Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att snabbt och reproducibly generera biologiskt inspirerad, biologiskt nedbrytbar dagsljus antigenpresenterande celler (aAPC) med avstämbara storlek, form och yta protein presentation för T-cell expansion ex vivo eller in vivo .
Abstract
Konstgjorda antigen presenterande celler (aAPC) är en lovande plattform för immun modulering på grund av sin potenta förmåga att stimulera T-celler. Acellulärt substrat erbjuder viktiga fördelar över cell-baserat aAPC, inklusive exakt kontroll av signal presentation parametrar och fysiska egenskaper av den aAPC ytan att modulera dess interaktioner med T-celler. aAPC tillverkad av anisotropisk partiklar, särskilt elliptiskt partiklar, har visat sig vara effektivare än sina sfäriska motsvarigheter på stimulera T-celler på grund av ökad bindning och större yta tillgänglig för T-cell kontakta, samt som minskad ospecifik upptag och förbättrad farmakokinetiska egenskaper. Trots ökade intresset Anisotrop partiklar, accepterade även allmänt metoder för att producera Anisotrop partiklar såsom tunnfilms-stretching kan vara svårt att införa och använda reproducibly.
I detta syfte vi beskriva ett protokoll för snabb, standardiserad tillverkning av biologiskt nedbrytbara Anisotrop partikel-baserade aAPC med avstämbara storlek, form och signalera presentation för T-cell expansion ex vivo eller in-vivo, tillsammans med metoder för att karakterisera deras storlek, morfologi och ytan protein innehåll, och att bedöma deras funktionalitet. Detta synsätt att fabricera Anisotrop aAPC är skalbar och reproducerbara, vilket gör den idealisk för att skapa aAPC för ”off-the-shelf” immunterapier.
Introduction
Konstgjorda antigen presenterande celler (aAPC) har visat lovande resultat som immunmodulerande medel eftersom de kan generera ett robust antigen-specifika T-cellssvar. Nödvändigt att dessa plattformar är deras förmåga att effektivt presentera avgörande signaler för T-cellsaktivering. Acellulärt aAPC är ett attraktivt alternativ till cell-baserat aAPC eftersom de är lättare och billigare att tillverka, färre utmaningar under skala upp och översättning och mildra riskerna med cellbaserade terapier. Acellulärt aAPC möjliggör även en hög grad av kontroll över signalen presentation parametrar och fysikaliska egenskaper av ytan som kommer att samverka med T celler1.
aAPC måste sammanfatta ett minimum av två signaler viktigt för T-cellsaktivering. Signal 1 ger antigen erkännande och uppstår när T cell receptorn (TCR) erkänner och engagerar med en MHC klass I eller II bär dess cognate antigen, vilket kulminerade i signalering genom komplexa TCR. För att kringgå kravet på antigen specificitet, bär aAPC system ofta en agonistiska monoklonal antikropp mot de CD3-receptorn, som nonspecifically stimulerar TCR komplexet. Rekombinant former av MHC, särskilt MHC multimers, har också använts på ytan av aAPC för att ge antigen specificitet2,3. Signal 2 är en costimulatory signal som styr T cellsaktivitet. För att ge costimulation som krävs för T-cellsaktivering, stimuleras CD28 receptorn generellt med en agonistiska antikropp som presenteras på den aAPC ytan, även om andra costimulatory receptorer såsom 4-1BB har varit framgångsrikt riktade4. Signalproteiner 1 och 2 är vanligtvis orörlig på ytan av styv partiklar att syntetisera aAPC. AAPC har historiskt sett varit påhittade från en mängd olika material, inklusive polystyren4,5 och järn dextran6. Nyare system utnyttja biologiskt nedbrytbara polymerer som poly (mjölksyra-co-glykolsyra) (PLGA) för att generera aAPC som enkelt kan kopplas för att signalera proteiner, lämpar sig för direkt administrering i vivooch kan underlätta den fördröjd frisättningen av inkapslade cytokiner eller lösliga faktorer att öka T cell aktivering7,8.
Utöver förekomsten av nödvändiga signalproteiner är receptor engagemang över en tillräckligt stor yta under aAPC/T cell samspelet viktigt för T-cellsaktivering. Således fysiska parametrar i aAPC såsom storlek och form drastiskt förändrar deras tillgängliga kontaktyta och påverka deras förmåga att stimulera T-celler. Micron stora aAPC har visat sig vara mer effektiva på stimulera T-celler än deras nanoskala motsvarigheter9,10. Nano-aAPC kan dock ha överlägsen biodistribution och bättre dränering till lymfkörtlarna som kan förbättra deras prestanda i vivo över mikro-aAPC11. Formen är en annan variabeln av intresse i partikel-baserade aAPC system. Anisotropic aAPC har nyligen visat sig vara effektivare än isotropiskt partiklar vid stimulera T-celler, främst på grund av förbättrad interaktion med målceller i kombination med minskad icke-specifik cell upptag. Celler binder prioriterat till den långa axeln av elliptiskt partiklar och större radie av krökning och plattare yta möjliggör mer kontakt mellan aAPC och T-cell12. Den långa axeln av elliptiskt partiklar avskräcker också fagocytos, vilket resulterar i ökad cirkulation tid jämfört med sfäriska partiklar efter i vivo administration12,13. På grund av dessa fördelar medla elliptiskt partiklar större expansion av antigen-specifika T celler in vitro- och in-vivo jämfört med sfäriska partiklar, en effekt som observerades både mikro- och nanoscales12, 13. Det finns olika strategier att fabricera Anisotrop partiklar, men tunnfilms-stretching är en enkel, allmänt accepterad metod som används för att generera en rad olika partikel former14. Efter syntes, partiklar kastas i filmer och utsträckt i en eller två dimensioner vid en temperatur över glasomvandlingstemperatur på partikel materialet. Filmen löses sedan för att hämta partiklarna. Trots växande intresse för anisotropisk partiklar, nuvarande metoder för fabricera partikel-baserade aAPC är mestadels begränsad till isotropiskt system och metoder för att förändra partikelform kan vara svår att genomföra, oförenlig med vissa aAPC syntes strategier och brist på precision och reproducerbarhet15. Vår tunnfilms-stretching teknik kan utföras manuellt eller i ett automatiserat sätt att snabbt generera Anisotrop partiklarna syntetiseras från en mängd biologiskt nedbrytbara polymerer, sträckt till önskad proportionerna i en eller två dimensioner15.
Baserat på vårt tidigare arbete, utvecklat vi en biologiskt nedbrytbar partikel-baserade strategi i kombination med skalbar tunnfilms-stretching teknik att snabbt generera aAPC med avstämbara storlek och form på ett standardiserat sätt för T-cell expansion ex vivo eller i vivo. Vår strategi för Konjugation av protein kan användas att någon proteinernas sevärdheter till carboxyl grupper på partikeln ytbehandlar på en önskad täthet, ger detta aAPC system en hög grad av flexibilitet. Vi beskriver också att karakterisera storlek, morfologi och ytan protein innehåll av aAPC, och att utvärdera deras funktioner in vitro-metoder. Detta protokoll kan enkelt anpassas till expandera immunceller ex vivo eller in-vivo för en mängd immunoterapeutisk tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) av Johns Hopkins University.
1. tillverkning av sfäriska PLGA partiklar av avstämbara storlek
- Beredning av material för partikel syntes
- Bered 5% w/w polyvinylalkohol (PVA).
- Lägga till 500 mL avjoniserat vatten (DI) vatten i en Erlenmeyerkolv med magnetiska rör bar och placera på värmeplatta omrörare på 500 rpm och övervaka temperatur med termometer. Täcka kolv med aluminiumfolie för att förhindra avdunstning.
- När vattentemperaturen når cirka 70 ° C, Lägg 25 g totalt av PVA i små partier över tiden, väntar på PVA lösas upp innan du lägger till mer.
- När alla PVA är upplöst (vanligen 30-60 min), låt lösningen cool och sterila filter. Förvaras vid 4 ° C för framtida bruk.
- Förbereda film gjutning lösning av 10% w/w PVA och 2% w/w glycerol.
- Lägga till 500 mL DI vatten i en Erlenmeyerkolv med magnetiska rör bar. Tillsätt 8 mL glycerol vid rumstemperatur och mix av sönderdelning.
- Placera kolven på värmeplatta omrörare på 500 rpm och övervaka temperatur med termometer. Täcka kolv med aluminiumfolie för att förhindra avdunstning.
- När lösningen temperaturen når ca 70 ° C, tillsätt 50 g totalt av PVA i små partier över tiden, väntar på PVA lösas upp innan du lägger till mer.
- När alla PVA är upplöst (vanligtvis 60 min), låt lösningen cool och sterila filter med en flaska-top vakuum filtersystem med en porstorlek på 0,22 μm. Förvara i rumstemperatur för framtida bruk.
- Bered en 50 mL 1% w/w PVA. Tillsätt 40 mL DI vatten och 10 mL 5% PVA lösning (tillverkad i 1.1.1) till en 100-150 mL-bägare.
- Förbered en lösning med 100 mL i 0,5% w/w PVA. Lägga till 90 mL DI vatten och 10 mL 5% PVA lösning i en 150-250 mL-bägare.
- Lägga till en magnetisk uppståndelse 0,5% PVA lösningen och häll i en kemisk huva på en uppståndelse tallrik vid rumstemperatur på 500 rpm.
- Bered 5% w/w polyvinylalkohol (PVA).
- Microparticle syntes
- Väg upp 100 mg av poly (mjölksyra-co-glykolsyra) (PLGA) till en scintillation injektionsflaska och lös upp den i 5 mL diklormetan (DCM). Vortex att upplösa PLGA.
- Placera Homogenisatorer i 50 mL 1% PVA-lösningen så att homogenisatorn är så nära botten av bägaren som möjligt utan att röra den. Aktivera Homogenisatorer och justera till önskad hastighet — 3200 rpm för 5 μm diameter partiklar, 5000 rpm för 3 μm, 15.000 rpm för 1 μm (ökande homogenisering hastighet minskar partikelstorlek). En gång på önskad hastighet, tillsätt den PLGA lösningen till bägaren och homogenisera under 1 minut.
- Efter homogenisering, Häll 1% PVA, PLGA microparticle lösning i 100 mL 0,5% PVA-lösningen på en uppståndelse plattan och rör i minst 4 timmar för lösningsmedel avdunstning i en kemisk huva.
- Tvätta partiklar 3 gånger i DI-vatten.
- Häll över partikel lösningen i 50 mL koniska rör och centrifugera vid 3000 x g i 5 minuter. Häll ut supernatanten och tillsätt ca 20 mL DI vatten.
- Återsuspendera partiklar av vortexa. När resuspended, fyll upp koniska rör till 50 mL med avjoniseratvatten.
- Tvätta igen på samma sätt två gånger.
- Nanopartiklar syntes
- Väg in 200 mg PLGA en scintillation injektionsflaska och lös i 5 mL av DCM. Vortex att upplösa PLGA.
- Placera en bägare med 50 mL 1% PVA lösning i behållare fylld med is. Placera den någon sonikator sonden i bägaren så nära botten som möjligt utan att röra. Påbörja ultraljudsbehandling och omedelbart lägga PLGA lösning i bägaren. Sonikera med en kraft av 12 W i 2 minuter att generera nanopartiklar med en ungefärlig diameter på 200 nm.
- Efter ultraljudsbehandling, Häll 1% PVA, PLGA nanopartiklar lösning i en 100 mL 0,5% PVA lösning på en uppståndelse plattan och rör i minst 4 timmar för lösningsmedel avdunstning i en kemisk huva.
- Häll 50 mL koniska rör och centrifugera vid 3 000 x g i 5 minuter för att ta bort mikropartiklar partikel lösningen. Ta bort supernatanten och häll i hög hastighet centrifugrör.
- Tvätta partiklarna 3 gånger med DI-vatten. Centrifugera vid 40 000 x g i 15 minuter. Häll ut supernatanten och återsuspendera i DI vatten av vortexa. Tvätta igen på samma sätt två gånger.
2. tillverkning av Polymera partiklar av avstämbara form
- Efter tvättning PLGA resuspendera partiklar tre gånger, partiklarna i ca 1 mL avjoniseratvatten. Lägg till film gjutning lösningen till partiklar för slutliga partikel koncentration av 2,5 mg/mL partiklar.
- Pipettera partikel suspensionen i 10 mL alikvoter i 75 x 50 mm rektangulär petriskålar för endimensionell stretching eller i 15 mL alikvoter i 100 x 100 mm fyrkantig petriskålar för tvådimensionella stretching. Ta bort bubblor med antingen pipett eller skjuta bubblor åt sidan och låt filmer torka över natten i en kemisk huva.
- När filmer har torkat, ta bort filmer från plast rätter med pincett och skära av kanterna av filmer med sax. Spara kanter i en 50 mL konisk tub som ska användas som sfäriska partiklar.
- Läsa in en film på automatiserade tunna filmen stretching enheten genom att montera en film till aluminium block. För 1D stretching, montera filmen till aluminium block av en axel av båren (figur 2) genom att placera två kortsidorna av film mellan två bitar av neoprengummi. Med hjälp av en insexnyckel, skruv handtag metall ovanpå gummi att hålla filmen på plats. För 2D stretching, montera alla fyra kanter till fyra aluminium block att sträcka på båda axlarna (figur 2).
- Mät och anteckna längden på filmen mellan aluminium block på en axel för 1 D stretching eller båda axlarna för 2D stretching. Beräkna avståndet krävs att sträcka filmen i en eller två riktningar utifrån önskad fold-stretch.
- Placera filmen-laddat stretching enheten i en ugn vid 90 ° C och ta filmen till temperatur under 10 minuter. Placera en stor bägare i ugnen med en liten mängd vatten.
- Sträckfilm.
- När stretching är klar, ta bort stretching enheten från ugnen och låt filmen svalna till rumstemperatur i 20 minuter.
- För 1D klippa stretching, filmen ur stretching enheten vid kanterna. För 2D stretching, klippa ut och spara centrum torget av film som sträcks ut jämnt på båda axlarna. Placera filmerna i koniska rör med 2 filmer per rör och kassera resten av filmen.
- Tillsätt ca 25 mL DI vatten varje koniska tube och vortex tills filmerna är upplöst.
- När filmerna är upplöst, tvätta partiklar 3 gånger med DI-vatten.
- För mikropartiklar, fylla upp koniska rör till 50 mL och centrifugera vid 3000 x g i 5 minuter, Häll ut supernatanten, tillsätt ca 20 mL DI vatten och vortex att resuspendera partiklar.
- För nanopartiklar, överföring partiklar till hög hastighet centrifugrör och centrifugera vid 40 000 x g i 15 minuter, Häll ut supernatanten, tillsätt ca 20 mL DI vatten och vortex att resuspendera partiklar.
- Efter den tredje tvätten, resuspendera partiklar i ca 1 mL avjoniseratvatten. Vikten för mikrocentrifug röret och lägga till partiklar i röret. Frysa partiklar i-80 ° C frys för 1 timme eller flash frysa i flytande kväve. När frysta, lyophilize partiklar över natten.
- När frystorkade, väga partiklar i mikrocentrifug röret och subtrahera registrerade vikten av tomma tuben för att fastställa vikten av frystorkade partiklar.
3. ytan Protein konjugation att skapa konstgjorda antigenpresenterande celler
- Förbereda 2-(N-Morpholino) ethanesulfonic syra (MES) buffert. Gör en 0,1 M lösning av MES i vattnet och justera pH till 6.0 genom titrering med 1M natriumhydroxid (NaOH).
- Återsuspendera frystorkade PLGA/PBAE mikro/nanopartiklar på 20 μg/mL i MES buffert av vortexa. Fyll en polypropylen mikrocentrifug rör med 900 μL av MES buffert och tillsätt 100 μL av partikel lösningen till röret.
- Bered EDC/NHS. Lös upp 40 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) och 48 mg N-hydroxysulfoxuccinimide (NHS) i 1 mL MES buffert.
- Tillsätt 100 μL EDC/NHS lösning till partiklar och vortex att blanda.
- Inkubera röret på en inverter i rumstemperatur i 30 minuter.
- Snurra ner mikropartiklar på 5 000 x g i 5 minuter, eller nanopartiklar på 17 000 x g i 5 minuter. Avlägsna supernatanten och återsuspendera i 1 mL PBS av vortexa (mikropartiklar) eller sonicating på 2-3 W i 5 sekunder (nanopartiklar).
- För mikropartiklar, lägga till 8 μg av proteinet önskad signal 1 och 10 μg antimus CD28 (klon 37.51) partiklar. För nanopartiklar, lägga till 16 μg signal 1 och 20 μg antimus CD28. Lägg till PBS för att få volymen i röret till 1,1 mL.
- Inkubera röret på en inverter vid 4 ° C över natten.
- Nästa dag, tvätta partiklarna. Snurra ner mikropartiklar på 5 000 x g i 5 minuter, eller nanopartiklar på 17 000 x g i 5 minuter. Avlägsna supernatanten och återsuspendera partiklar i 1 mL steril fosfatbuffrad Koksaltlösning vortexa (mikropartiklar) eller ultraljudsbehandling på 2-3 W i 5 sekunder (nanopartiklar). Upprepa två gånger.
- Återsuspendera partiklarna på önskad koncentration i odlingsmedium för omedelbar användning. För långsiktig lagring, resuspendera partiklar på 10 mg/mL i en 100 mM sackaroslösning. Frysa, lyophilize och lagra partiklarna vid-80 ° C.
4. karakterisering och utvärdering av aAPC
- Karakterisering av aAPC storlek och form (figur 3)
- Karakterisera microparticle storlek och form av imaging partiklar med hjälp av scanning electron microscopy (SEM). För SEM imaging, sprids frystorkade partiklar på kol band följs en aluminium tackel och sputter kappa med guld-palladium.
- Analysera storlek och bildförhållande som partiklar med hjälp av bild analys programvara.
- För att avgöra partikelstorlek, ange skala använda skalstapeln och mäta partikeldiameter. Upprepa för cirka 100 partiklar för att avgöra den genomsnittliga partikeldiameter och generera ett histogram över partikelstorlek.
- Att bestämma bildförhållandet, mäta avståndet mellan den långa och den korta axeln av partiklar och dela upp långa axeln av kort axel. Upprepa för cirka 50 partiklar av varje form att avgöra det genomsnittliga partikel bildförhållandet för varje form och generera histogram.
- Karakterisera nanopartiklar storlek och form av imaging partiklar med hjälp av transmissionselektronmikroskopi (TEM). Analysera storlek och proportioner av nanopartiklar med bild analys programvara som beskrivs i 5.1.2. Alternativt Mät sfäriska nanopartiklar storlek med hjälp av dynamiska ljusspridning (DLS) eller nanopartiklar spårning analys (NTA).
- Protein konjugation effektivitet
- Förbereda aAPC enligt metoder 1-3, men i steg 3,7 använda fluorescently märkt 1 signalprotein och antimus CD28. Efter konjugering och tvätt, Återsuspendera aAPC i 1 mL PBS för en slutkoncentration av 2 mg/mL aAPC.
- Förbereda protein standarder i en svart polystyren 96 brunnar mikroplattan. Tillsätt 5 μg fluorescently märkt signal 1 protein till PBS i den första brunnen av plattan och 10 1:2 utspädningar i PBS över raden av plattan. Lämna den sista väl tomrummet. Upprepa detta steg för att generera ytterligare en uppsättning standarder med fluorescently märkta anti-CD28.
- Tillsätt 100 μL aAPC lösningen i replikera brunnar i svart polystyren mikroplattan i tre exemplar.
- Läs fluorescensen på en fluorescens-spektrofotometer vid de lämpliga våglängderna. Använd fluorescens avläsningar från standarderna som protein för att generera standard kurvor för varje fluorescerande antikropp. Med hjälp av standardkurvan, beräkna koncentrationer av signal 1 och anti-CD28 i varje prov väl, och sedan beräkna mängden ytan protein och konjugation effektivitet (figur 4A, figur 5A).
- Utvärdering av aAPC för in vitro- stimulering av CD8 + T celler
- Förbered B' (RPMI medium kompletteras med L glutamin, 10% FBS, 1% icke-essentiella amino syra lösning, 1% natrium pyruvat, 1% MEM Vitamin lösning, 92 μM β-merkaptoetanol, 10 ng/mL ciprofloxacin och 30 U/mL IL-2.
- Offra en svart 6 mus via koldioxid exponering.
- Skörda mjälte från musen enligt en tidigare etablerat protokoll16. Samla in mjälte i en 50 mL konisk tub med 10 - 15 mL PBS. Använder en mortelstöt, mosa mjälte genom en sil med 70 µm i cellen till en 50 mL konisk tub. Under mäskningen, tvätta silen med 40 mL PBS.
- Snurra splenocytes vid 300 x g i 5 minuter. Häll av supernatanten och återsuspendera splenocytes i 4 mL Ack lyseringslösning buffert att lysera röda blodkroppar. Låt röret sitta ostört i 1 minut och sedan lägga till PBS för att få volymen i röret till 20 mL.
- Snurra cellerna på 300 x g i 5 minuter. Häll av supernatanten och återsuspendera cellerna i 1 mL PBS. Räkna de celler som använder en hemocytometer.
- Snurra cellerna på 300 x g i 5 minuter och återsuspendera i önskad volym av cell separation buffert. Isolera CD8 + T-celler från enda cellsuspensionen använder följa ett CD8 + negativa urval T cell isolering kit, efter tillverkarens protokollet.
- Efter magnetisk separering, snurra CD8 + T-celler vid 300 x g i fem minuter och ta bort cell separation bufferten. Omsuspendera cellerna i 1 mL PBS och räkna cellerna. Namnge celler med carboxyfluorescein succinyl ester (CFSE) enligt tillverkarens protokollet.
- Inkubera 8,333 CD8 + T-celler och 0.0833 mg (eller önskad dos) av aAPC i 150 μL B' media i varje brunn i en 96 väl U-vävnadsodling-behandlade bottenplattan.
- Inkubera vid 37 ° C i 7 dagar. Efter 3-4 dagar, uppdatera odlingsmediet genom att lägga 75 μl färskt medium till varje brunn.
- Efter 3 dagars inkubation, analysera CFSE märkta celler på en flödescytometer för att bedöma spridning. Varje topp på flöde flödescytometri CFSE histogrammet representerar en generation av celler på grund av den CFSE utspädningen med varje efterföljande celldelning.
- Efter 7 dagar, Använd en hemocytometer för att räkna antalet celler i varje brunn. Innan räkna, fläcken döda celler med en Trypan blå lösning. Utesluta döda celler från slutliga blodkroppar. Normalisera slutliga cellkoncentrationen till den ursprungliga koncentrationen att beräkna den vik-expansionen (figur 4 och figur 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En schematisk för automatiserad 2D tunn film stretching enheten ges i figur 1. En schematisk och beskrivning för en 1D tunn film stretching enheten ges i Ho et al.17 båren är tillverkad av aluminum delar använder standard fräsning och bearbetning tekniker. Liknar båren 1D, 2D båren består av metalliskt grepp och gejdrar. Dubbelriktad bly skruvar används för att översätta linjär till roterande rörelse. Bly skruvarna är bifogade via mekanisk kranar till identiska stegmotorer med tillräckligt vridmoment. 8 stepper motorstyrning trådarna kan lödas till 8-pin värmebeständigt amphenol anslutningar för enkel fastsättning på kontrollkonsolen i ugn för tunn film stretching. Polytetrafluoreten (PTFE) belagd tråd av tillräcklig längd måste användas att ansluta stegmotorerna till drivrutiner på kontrollkonsolen. Det rekommenderade dator kontrollsystemet ges i figur 1A. De två motorerna måste anslutas via värmebeständiga kablar till 2 oberoende förare. De två förarna måste sedan vara ansluten till en mikrokontroller till gränssnitt med en dator. Förarna bör anslutas till x-axeln och y-axeln utgångar på mikrokontroller. Både förarna och mikrokontroller kräver extern strömförsörjning. Innan du ansluter nätadaptern till dessa tre komponenter rekommenderas det att en 4 A säkring infogas mellan varje powered anslutningar till skydda komponenterna från nuvarande överbelastning. Slutligen, mikrokontroller kan kopplas via en parallell Port-ingång till en dator med en DB25 hane till hane kabel. Den elektronik som används för att kontrollera stegmotorerna är värmekänsliga och därför måste placeras utanför någon värmekälla (t.ex ugn) används under drift för att värma de tunna filmerna till tillräcklig temperatur för att stretching. Även om den rekommendera motorer är värmebeständiga upp till de temperaturer som anges i detta protokoll för stretching partiklar, på motorer och drivrutiner kommer att bygga upp ytterligare värme medan de är knutna till strömförsörjningen. Det rekommenderas därför att enheten bara vara påslagen under den faktiska filmen stretching för att minimera potentiella värmeutveckling.
PLGA nano- och mikropartiklar var syntetiseras med enda emulsion tekniker beskrivs i detta protokoll och avbildas med TEM (figur 3A) och SEM (figur 3B), respektive. Sfäriska nanopartiklar hade en diameter av 237.3 ± 4,0 nm mätt som DLS och 224 nm mätt med NTA (figur 3 c). Mikropartiklar var syntetiseras av homogenisering vid 5000 rpm att generera sfäriska partiklar med en genomsnittlig diameter av 3 ± 1 μm (figur 3D). Partiklarna sträcktes använder automatiserade filmen stretching enheten vid 90 ° C i en dimension att generera prolate elliptiskt nano- och mikropartiklar och sträckt vid 70 ° C i två dimensioner för att generera oblate elliptiskt partiklar. Proportioner av mikropartiklar av alla tre formerna analyserades genom att mäta den långa axeln och kort axel avståndet till partiklar och att dela de två. Sfäriska mikropartiklar hade ett bildförhållande på 1,05 ± 0,04, medan 1D sträckt prolate elliptiskt partiklar hade en större proportioner 3.6 ± 0,8 (figur 3E). 2D sträckt oblate elliptiskt partiklar hade ett bildförhållande på 1,2 ± 0,2, ungefär behålla proportionerna av en.
EDC/NHS reaktion kemi användes för att böja en fluorescently märkt peptid-loaded MHC IgG dimer och anti-CD28 antikropp på ytan av sträckt och sfäriska PLGA partiklar. Konjugation effektivitet resultat visar liknande mängder protein på ytan av sfäriska och elliptiskt mikro-aAPC (figur 4A) och nano-aAPC (figur 5A) och påvisa att protein koppling under aAPC syntes förekommer i en koncentrationsberoende sätt. För att utvärdera effekten av formen på aAPC funktionalitet, sfäriska och prolate elliptiskt aAPC konjugerat med gp100-loaded MHC IgG dimer och anti-CD28 användes för att stimulera PMEL transgena CD8 + T-celler. T-celler var märkt med CFSE och utvärderas av flödescytometri efter 3 dagar att bedöma spridning (figur 4B, 5B). Prolate elliptiskt aAPC konstaterades inducera T cell spridning vid sub mättar doser högre än sfäriska aAPC, med den bästa separation uppnås på en 0,01 mg dos. Efter 7 dagar räknades T-cellerna manuellt. Prolate elliptiskt aAPC mer effektivt stimuleras T-celler jämfört med deras sfäriska motsvarigheter på hur provtagningsutrustningen skall (figur 4 c) och nanoskala (figur 5 c), och dosberoende T cell expansion observerades.
Figur 1: Schematisk bild av automatiserade tunn film bår. (A) Schematisk bild av manöverbordet för tunn film bår. (B) Schematisk av mekaniska maskinvara för tunn film bår. (Vänster) Översiktsbild av mekaniska hårdvara. (Höger) Tvärsnitt av gripande mekanism för tunna filmer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: fotografier av monterade automatiserade tunn film bår att sträcka polymera partiklar i Anisotrop former. 2D tunna filmen stretching enheten består av två axlar med aluminium-fästen som grepp filmen. De två axlarna innehålla bly skruvar i motsatta riktningar så att de flyttar ifrån varandra. För att automatisera stretching förfarandet, är en USB-kopplad mikrokontroller ansluten till två stepper motor förare som relä signaler till unipolär stegmotor motorer genom en termisk kabel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: storlek och bildförhållande analys av sfäriska och elliptiskt PLGA partiklar. (A) TEM och (B) SEM bilder av sfäriska, 1D sträckte prolate elliptiskt, och 2D sträckt oblate elliptiskt PLGA (A) nanopartiklar och (B) mikropartiklar. (C) sfärisk nanopartiklar var storlek av NTA och fastställts vara 224 nm i diameter. SEM-bilder av PLGA mikropartiklar analyserades för (D) storlek distribution av sfäriska partiklar och bildförhållanden (E) alla partikel former. (C) reproduceras och anpassad med tillstånd från små13, Copyright Wiley-VCH 2015. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: karakterisering och funktionell bedömning av sfäriska och prolate elliptiskt mikro-aAPC. (A) konjugation effektivitet av fluorescently-märkta peptid-loaded MHC IgG dimer och anti-CD28 antikropp på ytan av sfäriska och prolate elliptiskt mikropartiklar. (B) CD8 + T celler var märkt med CFSE och inkuberas med sfäriska och 1D-sträckt mikro-aAPC på 0,01, 0,1 och 1 mg doser, eller icke-besläktat kontroller. Efter 3 dagar utvärderades celler av flödescytometri att bedöma spridning. (C) T-celler utvärderades också efter 7 dagar genom manuell räkning. Blodkroppar var normaliserade till första räkningen att beräkna fold-expansion. För jämförelse mellan prolate elliptiskt och sfäriska fold expansion, * = p < 0,05, ** = p < 0,01, och *** = p < 0,001. Felstaplar representera standardavvikelsen för medelvärdet (SEM) för 3 replikat. Reproduceras och anpassad med tillstånd från biomaterial12, Copyright Elsevier 2014. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: karakterisering och funktionell bedömning av sfäriska och prolate elliptiskt nano-aAPC. (A) konjugation effektivitet av fluorescently-märkta peptid-loaded MHC IgG dimer och anti-CD28 antikropp på ytan av sfäriska och prolate elliptiskt nanopartiklar. (B) CD8 + T celler var märkt med CFSE och inkuberas med sfäriska och prolate elliptiskt nano-aAPC av varierande fold-stretch på 0,01, 0,1 och 1 mg doser. Efter 3 dagar utvärderades celler av flödescytometri att bedöma spridning. (C) T-cellerna inkuberas med prolate elliptiskt partiklar av varierande vik stretch (allt från 1,5 till 3,5) utvärderades också efter 7 dagar genom manuell räkning. Blodkroppar var normaliserade till ett obehandlat tillstånd att beräkna fold-expansion. * = p < 0,05, ** = p < 0,01, och *** = p < 0,001 jämfört med sfäriska. Felstaplar representera standardavvikelsen för medelvärdet (SEM) för 3 replikat. Reproduceras och anpassad med tillstånd från små13, Copyright Wiley-VCH 2015. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll Detaljer en mångsidig metod för exakt generering av anisotropisk polymera partiklar. Tunna filmen stretching teknik som beskrivs här är skalbar, mycket reproducerbara och billiga. Alternativa tekniker för att generera Anisotrop partiklar lider många begränsningar, inklusive hög kostnad, låg genomströmning och begränsad partikelstorlek. Tunna filmen stretching strategi är också en fördel eftersom partiklarna är modifierad för att vara Anisotrop efter syntes, och som ett resultat, är kompatibel med ett brett utbud av partikelstorlek och syntes tekniker. Figur 1 beskriver inställningen av automatiserade tvådimensionell stretching enheten. Denna enhet kan också användas utan elektroniska komponenter av manuellt vrida skruvarna tills filmen har nått önskad grad av stretching. Vi har dock funnit att den automatisera processen är mycket mer konsekvent och snabb än manuell drift15. Olika tekniker har utvecklats för att syntetisera Anisotrop partiklar såsom mikroflödessystem metoder17,18,19, lager-för-lager beläggning21och andra nerifrån syntes metoder21 ,22. Dock dessa metoder aktiverar inte stark kontroll över partikel geometri och är inte lika mångsidig när det gäller former som kan genereras och partikel material som kan användas. En populär top-down-metod för fabricera nonspherical partiklar är partikel replikering i icke-vätning mallar (PRINT)24. Även om PRINT ger exakt kontroll över partikelform, det kräver dyra maskiner och är inte lika tillgängliga och enkla att genomföra som tunn film stretching metod.
Den enda emulsion tekniken kan användas för att fabricera PLGA partiklar av olika storlekar, allt från nano till hur provtagningsutrustningen skall12,13. Av varierande homogenisering hastighet eller ultraljudsbehandling amplitud, kan microparticle och nanopartiklar storlek, respektive anpassas. När sfäriska partiklar har genererats, kan tunna filmen stretching metod som beskrivs här användas att deformera partiklarna i olika former15. I detta protokoll beskriver vi generationen prolate och oblate elliptiskt partiklar genom att sträcka i en eller två dimensioner, respektive. Sfäriska partiklar är gjutna i en tunn plastfilm, som värms upp ovanför glasomvandlingstemperatur på PLGA och utsträckt i en eller två dimensioner att deformera partiklarna. Proportionerna av partiklarna är mycket kontrollerbar. Genom att trimma graden av filmen stretch, aspektförhållandet av partiklarna kan anpassas, och vi har hittat det uppmätta partikel bildförhållandet är starkt korrelerade med förväntat värde12,13. Olika andra former kan skapas genom att ändra temperaturen under stretching eller graden av stretching. Till exempel kan BIKONKAV skivformade partiklar som liknar formen av röda blodkroppar genereras av stretching mikropartiklar 1,5 i två dimensioner på 90 ° C. 15. denna film stretching teknik har också använts för att omvandla sfäriska polystyren partiklar till många Anisotrop figurer, bland annat maskar, fat och rektangulära skivor21. Filmen stretching enheten kan användas genom att manuellt kontrollera skruvarna eller enheten kan automatiseras som visas i figur 1 att göra processen mer effektiv och konsekvent15. Denna enkla teknik producerar tillförlitligt Anisotrop partiklar som behåller sin form under fysiologiskt villkorar24. Dessutom, denna metod har tillämpats på andra polymera material, i tillägg till PLGA, såsom polykaprolaktonuretangummi (PCL) samt hybrid partiklar av PLGA och poly (beta-amino ester) (PBAE).
Det här protokollet beskriver också hur PLGA partiklar av varierande storlek och form kan vara konjugerat med yta proteiner krävs för CD8 + T cellaktivering att agera som aAPC. Proteiner kan vara kovalent konjugerad till Anisotrop och sfäriska PLGA mikro- och nanopartiklar av EDC/NHS medierad kopplingen av primära aminer på proteiner till carboxyl grupper på partikeln ytbehandlar. Effektiviteten i protein konjugation kan mätas genom koppling fluorescently märkt protein på ytan av partiklar som beskrivs i detta protokoll, och vi har funnit att denna teknik par protein till partiklar vid 15-20% effektivitet12, 13. Prolate elliptiskt mikro- och nanopartiklar aAPC är effektivare än sina sfäriska motsvarigheter på att aktivera CD8 + T cell spridning och expansion in vitro-12,13. Elliptiskt aAPC har förstärkt bindning till och interaktion med T-celler på grund av deras större yta för kontakt12. Anisotrop partiklar har också överlägsna egenskaper över sfäriska partiklar i vivo på grund av sin förbättrade biodistribution och motstånd till fagocytos13. Denna plattform är mycket modulärt och har potential att anpassas till många andra drug delivery program. Med den här proceduren, polymera partiklar av avstämbara form och storlek kan genereras och partikeln ytbehandlar kan vara konjugerat med något protein av intresse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
EBA (DGE-1746891) och KRR (DGE-1232825) tacka NSF Graduate Research Fellowship-programmet för stöd. RAM tack den nationella forskningen Service Award NIH NCI F31 (F31CA214147) och de uppnå belöningar för College forskare stipendium för stöd. Författarna tackar NIH (R01EB016721 och R01CA195503), forskningen till förhindra blindhet James och Carole gratis katalysator Award, och JHU Bloomberg-Kimmel Institute for Cancer immunterapi för stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly(vinyl alcohol), MW 25000, 88% hydrolyzed | Polysciences, Inc. | 02975-500 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Digital Thermometer | Fluke | N/A | Model name: Fluke 52 II |
| Immersion Temperature Probe | Fluke | N/A | Model name: Fluke 80PK 22 |
| Digital Hotplate & Stirrer | Benchmark Scientific | H3760-HS | |
| Multipoint stirrer | Thermo Fisher Scientific | 50093538 | |
| Resomer RG 504 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide) | Sigma-Aldrich | 719900 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | D65100 | |
| Homogenizer | IKA | 0003725001 | |
| Sonicator | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Model number: VC 505 |
| Sonicator sound abating enclosure | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0427 |
| Sonicator probe | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0220 |
| Sonicator microtip | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0423 |
| High speed centrifuge | Beckman Coulter | N/A | Model number: J-20XP (discontinued), alternative model: J-26XP |
| High speed centrifuge rotor | Beckman Coulter | 369691 | Model number: JA-17 |
| High speed polycarbonate centrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific | 3118-0050 | 50 mL, screw cap |
| Rectangular disposable petri dish | VWR International | 25384-322 | 75 x 50 x 10 mm |
| Square disposable petri dish | VWR International | 10799-140 | 100 mm x 100 mm |
| LEAF Purified anti-mouse CD3ε Antibody | Biolegend | 100314 | |
| InVivoMab anti-mouse CD28, clone 37.51 | Bio X Cell | BE0015-1 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | E6383 | |
| N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt | Sigma-Aldrich | 56485 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100212 | |
| APC anti-mouse CD28 Antibody | Biolegend | 102109 | |
| Corning 96 Well Solid Polystyrene Microplate | Sigma-Aldrich | CLS3915 | flat bottom, black polystyrene |
| Protein LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431081 | |
| RPMI 1640 Medium (+ L-Glutamine) | ThermoFisher Scientific | 11875093 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | Heat Inactivated, sterile-filtered |
| Ciprofloxacin | Sigma-Aldrich | 17850 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Recombinant Human IL-2 (carrier-free) | Biolegend | 589102 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| MEM Vitamin Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11120052 | |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyi Biotech | 130-104-075 | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFisher Scientific | C34554 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| MACS Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Flow Cytometer | Accuri C6 | ||
| Synergy 2 Multi-Detection Microplate Reader | BioTek | ||
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi BIotech | 130-091-221 | |
| Cell Strainer | ThermoFisher Scientific | 22363548 | Sterile, 70 µm nylon mesh |
| ACK Lysing Buffer | ThermoFisher Scientific | A1049201 | |
| C57BL/6J (Black 6) Mouse | The Jackson Laboratory | 000664 | Male, at least 7 weeks old |
| U-Bottom Tissue Culture Plates | VWR | 353227 | Sterile, 96-well tissue culture treated polystyrene plates |
| 40 V DC Power Supply | Probotix | LPSK-4010 | |
| PTFE Coated Wire | Mouser | 602-5858-100-01 | This is for a 100 ft. spool but an equivalent wire will work |
| Stepper Motor Driver | Probotix | MondoStep5.6 | |
| IDC Connector Kit | Probotix | IDCM-10-12 | |
| Microcontroller | Probotix | PBX-RF | |
| 4A Fuses | Radio Shack | 2701026 | Equivalent fuses will work as well |
| DB25 Male to Male Cable | Probotix | DB25-6 | |
| USB-A to USB-B Cable | Staples | 2094915 | Equivalent cable will work as well |
| 8-Pin Amphenol Connectors Male and Female | Mouser | 654-97-3100A-20-7P and 654-97-3106A20-7S | |
| Stepper Motor | Probotix | HT23-420-8 | |
| Right Hand Lead Screw | Roton | 60722 | |
| Left Hand Lead Screw | Roton | 60723 | |
| Screws | McMaster Carr | 92196A151 | |
| Neoprene Rubber | McMaster Carr | 8698K51 | |
| Right Handed Flanged Lead Nut | Roton | 91962 | |
| Left Handed Flanged Lead Nut | Roton | 91963 | |
| Linux Control Computer | Probotix | LCNC-PC | Any computer with matching specification and Linux operating system will work |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma-Aldrich | CLS431097 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4 % | ThermoFisher Scientific | 15250061 |
References
- Eggermont, L. J., Paulis, L. E., Tel, J., Figdor, C. G. Towards efficient cancer immunotherapy: Advances in developing artificial antigen-presenting cells. Trends in Biotechnology. 32 (9), 456-465 (2014).
- Maus, M. V., Riley, J. L., Kwok, W. W., Nepom, G. T., June, C. H. HLA tetramer-based artificial antigen-presenting cells for stimulation of CD4+ T cells. Clinical Immunology. 106 (1), 16-22 (2003).
- Oelke, M., et al. Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells. Nature Medicine. 9 (5), 619-624 (2003).
- Rudolf, D., et al. Potent costimulation of human CD8 T cells by anti-4-1BB and anti-CD28 on synthetic artificial antigen presenting cells. Cancer Immunology, Immunotherapy. 57 (2), 175-183 (2008).
- Tham, E. L., Jensen, P. L., Mescher, M. F. Activation of antigen-specific T cells by artificial cell constructs having immobilized multimeric peptide-class I complexes and recombinant B7-Fc proteins. Journal of Immunological Methods. 249 (1-2), 111-119 (2001).
- Perica, K., et al. Magnetic field-induced T cell receptor clustering by nanoparticles enhances T cell activation and stimulates antitumor activity. ACS Nano. 8 (3), 2252-2260 (2014).
- Steenblock, E. R., Fadel, T., Labowsky, M., Pober, J. S., Fahmy, T. M. An artificial antigen-presenting cell with paracrine delivery of IL-2 impacts the magnitude and direction of the T cell response. The Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34883-34892 (2011).
- Zhang, L., et al. Paracrine release of IL-2 and anti-CTLA-4 enhances the ability of artificial polymer antigen-presenting cells to expand antigen-specific T cells and inhibit tumor growth in a mouse model. Cancer Immunology, Immunotherapy. 66 (9), 1229-1241 (2017).
- Mescher, M. F. Surface contact requirements for activation of cytotoxic T lymphocytes. The Journal of Immunology. 149 (7), 2402-2405 (1992).
- Steenblock, E. R., Fahmy, T. M. A comprehensive platform for ex vivo T-cell expansion based on biodegradable polymeric artificial antigen-presenting cells. Molecular Therapy. 16 (4), 765-772 (2008).
- Fifis, T., et al. Size-dependent immunogenicity: therapeutic and protective properties of nano-vaccines against tumors. The Journal of Immunology. 173 (5), 3148-3154 (2004).
- Sunshine, J. C., Perica, K., Schneck, J. P., Green, J. J. Particle shape dependence of CD8+ T cell activation by artificial antigen presenting cells. Biomaterials. 35 (1), 269-277 (2014).
- Meyer, R. A., et al. Biodegradable nanoellipsoidal artificial antigen presenting cells for antigen specific T-cell activation. Small. 11 (13), 1519-1525 (2015).
- Champion, J. A., Katare, Y. K., Mitragotri, S. Particle shape: a new design parameter for micro- and nanoscale drug delivery carriers. Journal of Controlled Release. 121 (1-2), 3-9 (2007).
- Meyer, R. A., Meyer, R. S., Green, J. J. An automated multidimensional thin film stretching device for the generation of anisotropic polymeric micro- and nanoparticles. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (8), 2747-2757 (2015).
- Ho, C. C., Keller, A., Odell, J. A., Ottewill, R. H. Preparation of monodisperse ellipsoidal polystyrene particles. Colloid and Polymer Science. 271 (5), 469-479 (1993).
- Shum, H. C., et al. Droplet microfluidics for fabrication of non-spherical particles. Macromolecular Rapid Communications. 31 (2), 108-118 (2010).
- Lan, W., Li, S., Xu, J., Luo, G. Controllable preparation of nanoparticle-coated chitosan microspheres in a co-axial microfluidic device. Lab on a Chip. 11 (4), 652-657 (2011).
- Yang, S., et al. Microfluidic synthesis of multifunctional Janus particles for biomedical applications. Lab on a Chip. 12 (12), 2097-2102 (2012).
- Zhou, Z., Anselmo, A. C., Mitragotri, S. Synthesis of protein-based, rod-shaped particles from spherical templates using layer-by-layer assembly. Advanced Materials. 25 (19), 2723-2727 (2013).
- Jang, S. G., et al. Striped, ellipsoidal particles by controlled assembly of diblock copolymers. Journal of the American Chemical Society. 135 (17), 6649-6657 (2013).
- Petzetakis, N., Dove, A. P., O'Reilly, R. K. Cylindrical micelles from the living crystallization-driven self-assembly of poly(lactide)-containing block copolymers. Chemical Science. 2 (5), 955-960 (2011).
- Rolland, J. P., et al. Direct fabrication and harvesting of monodisperse, shape-specific nanobiomaterials. Journal of the American Chemical Society. 127 (28), 10096-10100 (2005).
- Meyer, R. A., et al. Anisotropic biodegradable lipid coated particles for spatially dynamic protein presentation. Acta Biomaterialia. 72, 228-238 (2018).
