Summary
Qui, presentiamo un protocollo per in modo rapido e riproducibile generare articifical biologicamente ispirato, biodegradabile antigene che presenta le cellule (aAPC) con sintonizzabile dimensione, forma e presentazione di proteina di superficie per cellula T espansione ex vivo o in vivo .
Abstract
Cellule presentanti l'antigene artificiale (aAPC) sono una promettente piattaforma per modulazione immune dovuto la loro capacità potente per stimolare le cellule T. Substrati acellulare offrono vantaggi chiave sopra basati su cellule aAPC, compreso un controllo preciso dei parametri di presentazione di segnale e le proprietà fisiche della superficie aAPC per modulare le interazioni con le cellule T. aAPC costruito da particelle anisotropiche, particelle particolarmente ellissoidali, hanno dimostrato di essere più efficace di contattare loro controparti sferiche a stimolando le cellule di T a causa di grippaggio aumentato e maggiore superficie disponibile per la cellula T, anche come ha ridotto l'assorbimento non specifico e migliorate proprietà farmacocinetiche. Nonostante il crescente interesse anisotropiche particelle, anche ampiamente accettato metodi di generazione di particelle anisotropiche come allungamento del film sottile può essere difficile da implementare e utilizzare in modo riproducibile.
A tal fine, descriviamo un protocollo per la fabbricazione rapida, standardizzato di biodegradabile aAPC anisotropo basati su particelle con dimensioni regolabili, forma e segnale presentazione per cellula T espansione ex vivo o in vivo, insieme ai metodi di caratterizzano la loro dimensione, morfologia e superficie contenuto proteico e per valutare la loro funzionalità. Questo approccio a fabbricare aAPC anisotropico è scalabile e riproducibile, che lo rende ideale per la generazione di aAPC per immunoterapie "standard".
Introduction
Cellule presentanti l'antigene artificiale (aAPC) hanno indicato la promessa come agenti immunomodulatori perché possono generare una risposta robusta cellula di T antigene-specifiche. Essenziale per queste piattaforme sono la loro capacità di presentare in modo efficiente i segnali cruciali per l'attivazione delle cellule T. AAPC acellular sono un'alternativa attraente ai aAPC basati su cellule perché sono più facili e meno costoso da fabbricare, affrontare sfide meno durante scale-up e traduzione e alleviare i rischi connessi con le terapie basate sulle cellule. AAPC acellulare consentono anche di un elevato grado di controllo sui parametri di presentazione di segnale e le proprietà fisiche della superficie che si interfaccia con le cellule di T1.
aAPC deve ricapitolare un minimo di due segnali essenziali per l'attivazione delle cellule T. Segnale 1 fornisce il riconoscimento dell'antigene e si verifica quando il recettore delle cellule T (TCR) riconosce e si impegna con un MHC di classe I o II cuscinetto suo antigene cognata, che culmina nella segnalazione attraverso il complesso TCR. Per ignorare il requisito di specificità dell'antigene, aAPC sistemi spesso sopportano un agonistica dell'anticorpo monoclonale contro il recettore CD3, che non specifico stimola il complesso TCR. Forme ricombinanti di MHC, particolarmente dei multimeri MHC, sono state utilizzate anche sulla superficie della aAPC per fornire la specificità dell'antigene2,3. 2 è un segnale di costimolazione che indirizza l'attività delle cellule T. Per fornire la costimolazione necessari per l'attivazione delle cellule T, il recettore CD28 generalmente viene stimolato con un anticorpo agonista presentato sulla superficie aAPC, sebbene altri recettori costimolazione quali 4-1BB siano stati correttamente mirate4. Proteine di segnale 1 e 2 sono in genere immobilizzati sulla superficie delle particelle rigide di sintetizzare aAPC. Storicamente, aAPC sono stati fabbricati da una varietà di materiali, tra cui polistirolo4,5 e ferro destrano6. Sistemi più recenti utilizzano polimeri biodegradabili come poli (acido lattico-co-glicolico) (PLGA) per generare aAPC che può essere facilmente accoppiato per proteine di segnale, sono adatti per amministrazione diretta in vivoe può facilitare il rilascio prolungato di incapsulato citochine o fattori solubili per aumentare l'attivazione delle cellule T7,8.
Oltre alla presenza di proteine di segnale necessario, impegno del ricevitore su una superficie sufficientemente grande durante l'interazione aAPC/T è essenziale per l'attivazione delle cellule T. Così, parametri fisici di aAPC quali dimensioni e forma drasticamente alterano la loro area di contatto disponibile e influenzano la loro capacità di stimolare le cellule T. AAPC micron imprese hanno dimostrato di essere più efficace a stimolando le cellule di T di loro su scala nanometrica controparti9,10. Tuttavia, nano-aAPC possono avere biodistribuzione superiore e migliore drenaggio ai linfonodi che possono migliorare la loro prestazione in vivo sopra micro-aAPC11. Forma è un'altra variabile di interesse in sistemi basati su particelle aAPC. Anisotropo aAPC hanno recentemente dimostrato di essere più efficace di particelle isotropiche a stimolando le cellule di T, principalmente a causa di interazione avanzata con cellule bersaglio accoppiato con l'assorbimento riduttore delle cellule aspecifiche. Le cellule legano preferenzialmente all'asse lungo del ellissoidale particelle, e il più grande raggio di curvatura e la superficie più piatta consentono più contatto tra la aAPC e la cellula T12. L'asse lungo di particelle ellissoidali inoltre scoraggia la fagocitosi, con conseguente tempo di circolazione aumentata rispetto a particelle sferiche seguendo in vivo amministrazione12,13. A causa di questi vantaggi, ellissoidale particelle mediano una maggiore espansione di antigene-specifiche cellule T in vitro e in vivo rispetto a particelle sferiche, un effetto osservato al micro e nanoscales12, 13. Ci sono varie strategie per fabbricare particelle anisotropiche, ma film sottile lo stretching è un metodo ampiamente accettato semplice utilizzato per generare una gamma di particelle diverse forme14. A seguito di sintesi, particelle sono gettate nel film e allungate in una o due dimensioni ad una temperatura sopra la temperatura di transizione vetrosa del materiale della particella. Il film è poi sciolto per recuperare le particelle. Nonostante la crescente interesse in particelle anisotropiche, approcci attuali per fabbricazione aAPC basati su particelle sono per lo più limitati ai sistemi isotropi e metodi di alterare la forma delle particelle possono essere difficile da implementare, incompatibile con alcune sintesi aAPC strategie e mancanza di precisione e riproducibilità15. La nostra tecnica di allungamento del film sottile può essere eseguita manualmente o in modo automatico per generare velocemente anisotropiche particelle sintetizzate da una varietà di polimeri biodegradabili, estesa per un rapporto di aspetto desiderato in una o due dimensioni15.
Basato sul nostro lavoro precedente, abbiamo sviluppato un approccio basato su particelle biodegradabile combinato con scalabile tecnologia a film sottile che si estende per generare velocemente aAPC con forma e dimensioni sintonizzabile ad un modo standardizzato per cellula T espansione ex vivo o in vivo. La nostra strategia di coniugazione di proteina può essere utilizzato per accoppiare qualsiasi proteina di interesse per i gruppi carbossilici sulla superficie della particella ad una densità desiderata, dando questo sistema aAPC un elevato grado di flessibilità. Descriviamo anche metodi per caratterizzare la dimensione, la morfologia e la proteina di superficie contenuta di aAPC e per valutare la loro funzionalità in vitro. Questo protocollo può essere facilmente adattato per espandere le cellule immunitarie ex vivo o in vivo per una varietà di applicazioni di immunoterapia.
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Protocol
Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della Johns Hopkins University.
1. fabbricazione di particelle PLGA sferica di dimensioni sintonizzabile
- Preparazione di materiali per la sintesi delle particelle
- Preparare la soluzione al 5% p/p di alcol polivinilico (PVA).
- Aggiungere 500 mL di acqua deionizzata (DI) in un matraccio di Erlenmeyer con un'ancoretta magnetica e collocare su piastra riscaldante agitatore a 500 giri/min e monitor di temperatura con il termometro. Boccetta di coprire con carta stagnola per evitare l'evaporazione.
- Quando la temperatura dell'acqua raggiunge circa 70 ° C, aggiungere 25 g totale di PVA in piccoli lotti nel corso del tempo, in attesa di PVA sciogliere prima di aggiungere altro.
- Una volta che tutti i PVA è dissolto (in genere 30-60 min), lasciate filtro soluzione fredda e sterile. Conservare a 4 ° C per uso futuro.
- Preparare soluzione casting film 10% w/w PVA e 2% w/w glicerolo.
- Aggiungere 500 mL di acqua DI un matraccio di Erlenmeyer con un'ancoretta magnetica. Aggiungere 8 mL di glicerolo a temperatura ambiente e mescolare di triturazione.
- Immergere la muffola su piastra riscaldante agitatore a 500 giri/min e monitor temperatura con il termometro. Boccetta di coprire con carta stagnola per evitare l'evaporazione.
- Quando la temperatura della soluzione raggiunge circa 70 ° C, aggiungere 50 g totale di PVA in piccoli lotti nel corso del tempo, in attesa di PVA sciogliere prima di aggiungere più.
- Una volta che tutti i PVA è dissolto (in genere 60 min), lasciate filtro soluzione fredda e sterile utilizzando un sistema di filtro vuoto bottiglia-top con un diametro dei pori di 0.22 μm. Conservare a temperatura ambiente per un utilizzo futuro.
- Preparare una soluzione PVA di 50 mL 1% w/w. Aggiungere 40 mL di acqua distillata e 10 mL di soluzione PVA 5% (fatto in 1.1.1) in un becher da 100-150 mL.
- Preparare una soluzione PVA 100 mL 0,5% w/w. Aggiungere 90 mL di acqua distillata e 10 mL di soluzione di PVA 5% un becher da 150-250 mL.
- Aggiungere un ancoretta magnetica al 0,5% soluzione di PVA e posto in una cappa chimica su una piastra di agitazione a temperatura ambiente a 500 giri/min.
- Preparare la soluzione al 5% p/p di alcol polivinilico (PVA).
- Sintesi di microparticelle
- Pesare 100 mg di poli (acido lattico-co-glicolico) (PLGA) in un flaconcino di scintillazione e sciogliere in 5 mL di diclorometano (DCM). Vortex per sciogliere il PLGA.
- Posizionare omogeneizzatore ai 50 mL di soluzione PVA 1% in modo che l'omogeneizzatore è più vicino al fondo del becher possibile senza toccarlo. Accendere omogeneizzatore e regolare la velocità desiderata — 3.200 giri/min per 5 μm particelle di diametro, 5.000 giri/min per 3 μm, 15.000 rpm per 1 μm (aumentando la dimensione delle particelle di omogeneizzazione velocità diminuisce). Una volta alla velocità desiderata, aggiungere la soluzione PLGA Becher e omogeneizzare per 1 minuto.
- Dopo omogeneizzazione, versare l'1% PVA, soluzione di microparticelle PLGA nella soluzione di PVA 100 mL 0,5% su un piatto di mescolare e agitare per almeno 4 ore per evaporazione del solvente in una cappa chimica.
- Lavare le particelle 3 volte in acqua deionizzata.
- Versare la soluzione di particelle in provette coniche da 50 mL e centrifugare a 3000 x g per 5 minuti. Versare il surnatante e aggiungere circa 20 mL di acqua deionizzata.
- Risospendere le particelle nel Vortex. Una volta risospeso, riempire provette coniche da 50 mL con acqua deionizzata.
- Lavare nuovamente allo stesso modo altre due volte.
- Sintesi di nanoparticelle
- Pesare 200 mg di PLGA in un flacone di scintillazione e sciogliere in 5 mL di DCM. Vortex per sciogliere il PLGA.
- Inserire un becher con 50 mL di soluzione di 1% PVA nel contenitore pieno di ghiaccio. Posizionare la sonda sonicatore nel becher più vicino alla parte inferiore come possibile senza toccare. Iniziare la sonicazione e immediatamente aggiungere soluzione PLGA nel becher. Sottoporre ad ultrasuoni con una potenza di 12 W per 2 minuti per generare nanoparticelle con un diametro approssimativo di 200 nm.
- Dopo sonicazione, versare l'1% PVA, soluzione di nanoparticelle PLGA in una soluzione PVA 100 mL 0,5% su un piatto di mescolare e agitare per almeno 4 ore per evaporazione del solvente in una cappa chimica.
- Versare la soluzione di particelle in provette coniche da 50 mL e centrifugare a 3.000 x g per 5 minuti per eliminare le microparticelle. Rimuovere il surnatante e versare in provette da centrifuga ad alta velocità.
- Lavare le particelle 3 volte con acqua distillata. Centrifugare a 40.000 x g per 15 minuti. Versare il surnatante e risospendere in acqua distillata nel Vortex. Lavare nuovamente allo stesso modo altre due volte.
2. fabbricazione di particelle polimeriche di forma sintonizzabile
- Dopo il lavaggio particelle di PLGA tre volte, risospendere le particelle in circa 1 mL di acqua deionizzata. Aggiungere la soluzione di casting film alle particelle per concentrazione di particelle finale delle particelle di 2,5 mg/mL.
- Dispensare la sospensione di particelle in aliquote di 10 mL nei piatti Petri rettangolare 75 x 50 mm per lo stretching unidimensionale o in aliquote da 15 mL in 100 x 100 mm quadrati di Petri per allungamento bidimensionale. Togliere bolle mediante pipetta sia o bolle che spinge al lato e lasciate asciugare durante la notte film in una cappa chimica.
- Una volta seccato film, rimuovere film da piatti di plastica con le pinzette e tagliare i bordi delle pellicole con le forbici. Salvare i bordi in una provetta conica 50 mL per essere utilizzato come particelle sferiche.
- Caricare un film sulla pellicola sottile automatizzato stretching dispositivo montando un film sui blocchi di alluminio. 1D stretching, per montare film sui blocchi di alluminio di un asse della barella (Figura 2) inserendo due bordi corti della pellicola tra due pezzi di gomma del neoprene. Utilizzando una chiave a brugola, avvitare le manopole in metallo sulla parte superiore in gomma per tenere il film in posizione. Per l'allungamento 2D, montare tutti e quattro i bordi sui quattro blocchi di alluminio per allungare su entrambi gli assi (Figura 2).
- Misurare e registrare la lunghezza del film fra blocchi di alluminio su un asse per lo stretching 1D o entrambi gli assi per lo stretching 2D. Calcolare la distanza necessaria per la pellicola di stirata in una o due direzioni basate piega-stretching desiderata.
- Posizionare il dispositivo di stretching film-caricato in un forno a 90 ° C e portare il film a temperatura più di 10 minuti. Posto una grande Coppa al forno con una piccola quantità di acqua.
- Film estensibile.
- Al termine della dilatazione, rimuovere il dispositivo di allungamento dal forno e lasciare raffreddare la pellicola a temperatura ambiente per 20 minuti.
- 1D stretching, per tagliare la pellicola dal dispositivo d'allungamento ai bordi. Per l'allungamento 2D, tagliare e salvare il centro quadrato del film che è allungato uniformemente su entrambi gli assi. Mettere film in provette coniche con 2 pellicole per tubo e scartare il resto del film.
- Aggiungere circa 25 mL di acqua DI ogni provetta conica e agitare fino a quando i film sono dissolti.
- Una volta che i film sono particelle disciolte, lavare 3 volte con acqua distillata.
- Per microparticelle, riempire provette coniche da 50 mL e centrifugare a 3000 x g per 5 minuti, versare il surnatante, aggiungere circa 20 mL di acqua deionizzata e vortexare per risospendere le particelle.
- Per le nanoparticelle, particelle di trasferimento alle provette da centrifuga ad alta velocità e centrifugare a 40.000 x g per 15 minuti, versare il surnatante, aggiungere circa 20 mL di acqua deionizzata e vortexare per risospendere le particelle.
- Dopo il terzo lavaggio, risospendere le particelle in circa 1 mL di acqua deionizzata. Registrare il peso del tubo del microcentrifuge e aggiungere particelle al tubo. Congelare le particelle in un congelatore a-80 ° C per 1 ora o freeze flash in azoto liquido. Una volta congelato, lyophilize particelle durante la notte.
- Una volta liofilizzato, pesare le particelle nel tubo del microcentrifuge e sottrarre peso registrato del tubo vuoto per determinare il peso delle particelle liofilizzate.
3. superficie proteina coniugazione per creare cellule presentanti l'antigene artificiale
- Preparare 2-(N-morfolino) buffer di ethanesulfonic acido (MES). Effettuare una soluzione 0,1 M di MES in acqua e regolare il pH a 6.0 mediante titolazione con 1M di idrossido di sodio (NaOH).
- Risospendere liofilizzato PLGA/PBAE micro/nanoparticelle a 20 μg/mL in tampone MES nel Vortex. Riempire un tubo del microcentrifuge in polipropilene con 900 μL di tampone di MES e aggiungere 100 μL della soluzione di particelle al tubo.
- Preparare soluzione EDC/NHS. Sciogliere 40 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) e 48 mg N-hydroxysulfoxuccinimide (NHS) in 1 mL di tampone MES.
- Aggiungere 100 μL di soluzione EDC/NHS per le particelle e il vortice di mescolare.
- Incubare la provetta su un inverter a temperatura ambiente per 30 minuti.
- Rotazione verso il basso microparticelle a 5.000 x g per 5 minuti, o nanoparticelle a 17.000 x g per 5 minuti. Scartare il surnatante e risospendere in 1 mL di PBS di Vortex (microparticelle) o sonicating al 2-3 W per 5 secondi (nanoparticelle).
- Per microparticelle, aggiungere 8 μg della proteina segnale desiderato 1 e 10 μg anti-topo CD28 (clone 37.51) le particelle. Per le nanoparticelle, aggiungere 16 μg segnale 1 e 20 μg anti-mouse CD28. Aggiungere PBS per portare il volume nel tubo a 1,1 mL.
- Incubare la provetta su un inverter a 4 ° C durante la notte.
- Il giorno dopo, lavare le particelle. Rotazione verso il basso microparticelle a 5.000 x g per 5 minuti, o nanoparticelle a 17.000 x g per 5 minuti. Eliminare il supernatante e risospendere le particelle in 1 mL di PBS sterile di Vortex (microparticelle) o sonicazione a 2-3 W per 5 secondi (nanoparticelle). Ripetere due volte.
- Risospendere le particelle alla concentrazione desiderata nel terreno di coltura per un uso immediato. Per l'archiviazione a lungo termine, risospendere le particelle a 10 mg/mL in una soluzione di saccarosio di 100 mM. Congelare, lyophilize e memorizzare le particelle a-80 ° C.
4. caratterizzazione e valutazione di aAPC
- Caratterizzazione della aAPC dimensione e forma (Figura 3)
- Caratterizzano microparticella dimensioni e forma di particelle imaging mediante microscopia elettronica a scansione (SEM). Per SEM particelle liofilizzate imaging, diffuse sul nastro di carbonio aderito ad un alluminio virare e polverizza cappotto con oro-palladio.
- Analizzare le dimensioni e le proporzioni delle particelle utilizzando software di analisi di immagine.
- Per determinare la dimensione delle particelle, imposta scala utilizzando la barra della scala e misurare il diametro della particella. Ripetere per circa 100 particelle determinare il diametro medio delle particelle e generare un istogramma delle dimensioni delle particelle.
- Per determinare il rapporto di aspetto, misurare la distanza tra l'asse e l'asse corto di particelle e dividere l'asse lungo di asse corto. Ripetere per circa 50 particelle di ogni forma per determinare le proporzioni delle particelle media per ogni forma e generare istogrammi.
- Caratterizzano la forma e dimensioni delle nanoparticelle da imaging particelle mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM). Analizzare le dimensioni e le proporzioni delle nanoparticelle utilizzando software di analisi di immagine, come descritto in 5.1.2. In alternativa, misurare dimensioni delle nanoparticelle sferiche tramite diffusione dinamica della luce (DLS) o nanoparticle tracking analysis (NTA).
- Efficienza di coniugazione di proteina
- Preparare aAPC secondo metodi 1-3, ma nel passaggio 3,7 utilizzare proteine segnale fluorescente contrassegnati 1 e anti-topo CD28. Dopo coniugazione e il lavaggio, risospendere il aAPC in 1 mL di PBS per una concentrazione finale di 2 mg/mL aAPC.
- Preparare gli standard della proteina in una micropiastra a 96 pozzetti in polistirene nero. Aggiungere 5 µ g di proteine di segnale fluorescente contrassegnati 1 alla PBS nel primo pozzetto della piastra e fare 10 diluizioni 1:2 in PBS lungo la riga della piastra. Lasciare il vuoto bene ultimo. Ripetere questo passaggio per generare un'altra serie di norme con fluorescente identificati anti-CD28.
- Aggiungere 100 μL della soluzione aAPC in replicati pozzetti della micropiastra polistirolo nero in triplice copia.
- Leggere la fluorescenza su un lettore di fluorescenza alle lunghezze d'onda appropriate. Usare i valori di fluorescenza dagli standard della proteina per generare le curve standard per ogni anticorpo fluorescente. Utilizzando la curva standard, calcolare le concentrazioni di segnale 1 e anti-CD28 in ciascun pozzetto del campione e quindi calcolare la quantità di proteina di superficie ed efficienza di coniugazione (Figura 4A, Figura 5A).
- Valutazione di aAPC per stimolazione in vitro di cellule T CD8 +
- Preparare il supporto di B' (medium RPMI supplementato con L Glutammina, 10% FBS, soluzione all'1% Non-essenziale amminoacido, piruvato di sodio 1%, 1% soluzione di vitamine MEM, 92 μM β-mercaptoetanolo, 10 ng/mL ciprofloxacina e 30 U/mL IL-2.
- Sacrificare un mouse Nero 6 tramite esposizione di anidride carbonica.
- Raccogliere la milza dal mouse secondo un protocollo precedentemente stabilito16. Raccogliere la milza in una provetta conica da 50 mL con 10 - 15 mL di PBS. Con un pestello, schiacciare la milza attraverso un colino di cella di 70 µm in una provetta conica da 50 mL. Durante schiacciare, lavare il filtro con 40 mL di PBS.
- Spin il splenocytes a 300 x g per 5 minuti. Versare il sovranatante e risospendere il splenocytes in 4 mL di tampone di lisi Ack per lisare le cellule di anima rosse. Lasciare il tubo a sedere indisturbati per 1 minuto, quindi aggiungere PBS per portare il volume nel tubo a 20 mL.
- Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 minuti. Versare il supernatante e risospendere le cellule in 1 mL di PBS. Contare le celle utilizzando un emocitometro.
- Girare le cellule a 300 x g per 5 minuti e risospendere nel desiderato volume di tampone di separazione cellulare. Isolare le cellule di T di CD8 + dalla sospensione singola cella usando una selezione negativa CD8 + T cell kit di isolamento, seguendo il protocollo del produttore.
- A seguito di separazione magnetica, spin cellule T CD8 + a 300 x g per cinque minuti e rimuovere il tampone di separazione cellulare. Risospendere le cellule in 1 mL di PBS e contare le celle. Marcare le cellule con carboxyfluorescein succinil estere (CFSE) secondo il protocollo del produttore.
- Incubare 8.333 cellule T CD8 + e 0,0833 mg (o dose desiderata) di aAPC in media 150 B' μL in ogni pozzetto di un 96 piastra di coltura del tessuto-trattati bene U-inferiore.
- Incubare a 37 ° C per 7 giorni. Dopo 3-4 giorni, è necessario aggiornare il terreno di coltura aggiungendo mezzo fresco di 75 μL in ogni pozzetto.
- Dopo 3 giorni di incubazione, analizzare CFSE etichettati cellule su un citometro a flusso per valutare la proliferazione. Ogni picco l'istogramma di CFSE cytometry di flusso rappresenta una generazione di cellule dovuto la diluizione di CFSE ad ogni divisione cellulare successivi.
- Dopo 7 giorni, è necessario utilizzare un emocitometro per contare il numero di cellule in ciascun pozzetto. Prima del conteggio, macchia le cellule morte con una soluzione di blu di Trypan. Escludere le cellule morte dalla conta finale. Normalizzare la concentrazione di cella finale alla concentrazione iniziale per calcolare la fold-espansione (Figura 4 e Figura 5).
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Representative Results
Uno schema per il film sottile 2D automatico dispositivo di allungamento è dato in Figura 1. Un disegno schematico e una descrizione per un film sottile di 1D stretching dispositivo è dato Ho et al.17 la barella viene costruita dalle parti di alluminio mediante fresatura standard e tecniche di lavorazione. Simile alla barella 1D, 2D barella è costituito da manopole metalliche e rotaie di guida. Viti di trasmissione bidirezionale vengono utilizzate per tradurre lineare a movimento rotatorio. Le viti di piombo sono l'allegato tramite rubinetti meccanici per motori passo passo identico con coppia sufficiente. Il 8 fili di controllo del motore passo a passo possono essere saldati sul 8 pin amphenol termoresistente connettori per il collegamento facile alla console di comando in un forno per l'allungamento del film sottile. Filo rivestito di politetrafluoroetilene (PTFE) di lunghezza sufficiente deve essere utilizzato per collegare i motori passo a passo i driver nella console di controllo. Lo schema di controllo consigliato computer è dato in Figura 1A. I due motori devono essere collegati tramite cablaggio resistente al calore per 2 autisti indipendenti. I due piloti devono quindi essere collegati ad un microcontrollore per interfacciarsi con un computer. Il driver deve essere collegato all'asse x e asse y uscite sul microcontrollore. I driver e il microcontrollore entrambi richiedono un'alimentazione elettrica esterna. Prima di collegare l'alimentazione di queste tre componenti è consigliabile che un fusibile 4 essere inserito tra le connessioni alimentato per proteggere i componenti da sovraccarico di corrente. Infine, il microcontrollore può essere collegato tramite un ingresso porta parallela a un computer utilizzando un DB25 maschio a maschio cavo. I componenti elettronici utilizzati per controllare i motori passo-passo sono sensibili al calore e pertanto devono essere collocati di fuori di qualsiasi fonte di calore (ad esempio un forno) utilizzato durante il funzionamento per riscaldare il film sottili alla temperatura sufficiente per consentire lo stretching. Anche se i motori consigliati sono resistenti agli calore fino alle temperature specificate nel presente protocollo per lo stretching di particelle, i driver e motori costruirà calore supplementare mentre sono collegati alla rete di alimentazione elettrica. Pertanto, si raccomanda che il dispositivo essere attivata solo durante il periodo di effettivo film stretching per ridurre al minimo il potenziale accumulo di calore.
PLGA nano e microparticelle sono state sintetizzate utilizzando le tecniche di emulsione singolo descritto in questo protocollo e imaging utilizzando TEM (Figura 3A) e SEM (Figura 3B), rispettivamente. Nanoparticelle sferiche avevano un diametro di 237,3 nm ± 4.0 come misurato da DLS e 224 nm come misurato da NTA (Figura 3). Microparticelle sono state sintetizzate di omogeneizzazione a 5000 giri/min per generare particelle sferiche con un diametro medio di 3 ± 1 μm (Figura 3D). Le particelle sono state tese utilizzando il film automatizzato stretching dispositivo a 90 ° C in una dimensione di generare prolata ellissoidale nano e microparticelle e allungato a 70 ° C in due dimensioni per generare delle oblate ellissoidale particelle. Le proporzioni delle microparticelle di tutte le tre forme sono state analizzate misurando l'asse lungo e distanza asse corto di particelle e divide i due. Microparticelle sferiche avevano un aspect ratio di 1.05 ± 0.04, mentre 1D allungato prolata ellissoidale particelle avevano un rapporto di aspetto più grande di 3,6 ± 0,8 (Figura 3E). 2D allungate oblate ellissoidale particelle avevano un aspect ratio di 1,2 ± 0,2, mantenendo all'incirca un aspect ratio di uno.
EDC/NHS reazione chimica era utilizzata per coniugare un fluorescente coniugati peptide-caricato MHC dimero e anti-CD28 anticorpo di IgG alla superficie delle particelle PLGA allungate e sferiche. Coniugazione efficienza risultati dimostrano simili quantità di proteine sulla superficie sferica ed ellissoidali micro-aAPC (Figura 4A) e nano-aAPC (Figura 5A) e dimostrare che la proteina accoppiamento durante la sintesi aAPC si verifica in un concentrazione-dipendente. Per valutare l'effetto della forma sulla funzionalità aAPC, sferica e prolata aAPC ellissoidali coniugato con gp100-caricati del dimero di MHC IgG e anti-CD28 sono stati utilizzati per stimolare le cellule T CD8 + transgeniche PMEL. Cellule di T sono state etichettate con CFSE e valutate tramite flusso cytometry dopo 3 giorni per valutare la proliferazione (fig. 4B, 5B). Prolata aAPC ellissoidali sono stati trovati per indurre i livelli elevati di proliferazione delle cellule T a dosi sub-saturante che aAPC sferica, con la migliore separazione raggiunta ad una dose di 0,01 mg. Dopo 7 giorni, le cellule di T sono state contate manualmente. Prolata aAPC ellissoidale ha stimolato in modo più efficace le cellule di T rispetto ai loro omologhi sferiche microscale (Figura 4) o nanometrica (Figura 5), e l'espansione dose-dipendente delle cellule di T è stata osservata.
Figura 1: rappresentazione schematica della barella di film sottile automatizzato. (A) schema di controllo console per barella a film sottile. (B) schema di hardware meccanico per barella a film sottile. (Sinistra) Vista dall'alto di hardware meccanico. (A destra) Sezione trasversale di meccanismo per film sottili di presa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: fotografie di barella assemblato automatizzato film sottile allungare particelle polimeriche in forme anisotropici. Il film sottile 2D stretching dispositivo è composto da due assi con supporti di alluminio che afferrano il film. I due assi contengono madreviti in direzioni opposte in modo che si muovono oltre a vicenda. Per automatizzare la procedura di allungamento, un microcontroller USB collegato è collegato a due stepper motor driver che trasmettono segnali al passo-passo unipolari motori elettrici tramite un cavo termico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: analisi di dimensioni e proporzioni delle particelle PLGA sferiche ed ellissoidali. (A) TEM e SEM (B) immagini di forma sferica, 1D allungato prolata ellissoidali e 2D allungato oblato ellissoidali PLGA (A) nanoparticelle e microparticelle (B). (C) sferica nanoparticelle sono state dimensionate di NTA e determinato da 224 nm di diametro. Immagini di SEM di PLGA microparticelle sono stati analizzati per la distribuzione delle dimensioni delle particelle sferiche (D) e (E) aspect ratio di tutte le figure della particella. (C) riprodotto e adattato con permesso da piccolo13, Copyright Wiley-VCH 2015. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: caratterizzazione e valutazione funzionale di sferiche e prolata ellissoidali micro-aAPC. (A) efficienza coniugazione di fluorescente etichettati peptide-caricato MHC dimero e anti-CD28 anticorpo IgG alla superficie delle microparticelle ellissoidali sferiche e prolate. (B) CD8 + T cellule erano etichettate con CFSE e incubate con sferica e 1D-allungato micro-aAPC alle dosi di 0,01, 0,1 e 1 mg, o controlli non affine. Dopo 3 giorni, le cellule sono state valutate mediante citometria a flusso per valutare la proliferazione. Le cellule di T (C) inoltre sono state valutate dopo 7 giorni di conteggio manuale. I conteggi delle cellule sono stati normalizzati per il conteggio iniziale per calcolare piega-espansione. Per il confronto tra espansione prolata piega ellissoidali e sferica, * = p < 0,05, * * = p < 0.01, e * * * = p < 0,001. Barre di errore rappresentano l'errore standard della media (SEM) per 3 repliche. Riprodotta e adattato con permesso da biomateriali12, Copyright Elsevier 2014. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: caratterizzazione e valutazione funzionale di forma sferica e prolata ellissoidale nano-aAPC. (A) efficienza coniugazione di fluorescente etichettati peptide-caricato MHC dimero e anti-CD28 anticorpo IgG sulla superficie delle nanoparticelle ellissoidali sferiche e prolate. (B) CD8 + T cellule erano etichettate con CFSE e incubate con sferica e prolata ellissoidale nano-aAPC di variazione piega-tratto alle dosi di 0,01, 0,1 e 1 mg. Dopo 3 giorni, le cellule sono state valutate mediante citometria a flusso per valutare la proliferazione. (C) T cellule incubate con prolate ellissoidale particelle di diversa piega stirata (che vanno da 1,5 a 3,5) inoltre sono state valutate dopo 7 giorni di conteggio manuale. I conteggi delle cellule sono stati normalizzati a una condizione di non trattata per calcolare piega-espansione. * = p < 0,05, * * = p < 0.01, e * * * = p < 0,001 rispetto alla forma sferica. Barre di errore rappresentano l'errore standard della media (SEM) per 3 repliche. Riprodotta e adattato con permesso da piccolo13, Copyright Wiley-VCH 2015. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo in dettaglio un metodo versatile per la precisa generazione di particelle polimeriche anisotropiche. Il film sottile che allunga la tecnica qui descritta è scalabile, altamente riproducibile e poco costoso. Tecniche alternative per la generazione di particelle anisotropiche soffrono di molte limitazioni, tra cui il costo elevato, bassa velocità effettiva e granulometria limitata. Il film sottile stretching approccio è anche vantaggioso perché le particelle sono modificate per essere anisotropo dopo la sintesi e, di conseguenza, è compatibile con una vasta gamma di granulometrie e tecniche di sintesi. Figura 1 in dettaglio il programma di installazione del dispositivo d'allungamento bidimensionale automatizzato. Questo dispositivo utilizzabile anche senza i componenti elettronici girando manualmente le viti fino a quando il film ha raggiunto il grado desiderato di stretching. Tuttavia, abbiamo trovato che il processo automatizzato è molto più coerente e rapida di funzionamento manuale15. Varie tecniche sono state sviluppate per sintetizzare anisotropiche particelle, quali microfluidici approcci17,18,19, strato dopo strato rivestimento21e altri approcci di sintesi ascendente21 ,22. Tuttavia, questi approcci non consentono forte controllo sulla geometria delle particelle e non sono più versatili in termini di forme che possono essere generati e materiali della particella che possono essere utilizzati. Un popolare metodo top-down per fabbricare nonspherical particelle è la replica delle particelle in modelli Non-bagnante (stampa)24. Anche se stampa consente un controllo preciso sulla forma delle particelle, richiede macchinari costosi e non è così accessibile e semplice da implementare come il film sottile stretching metodo.
La tecnica di emulsione singola può essere utilizzata per fabbricare particelle di PLGA di varie dimensioni, che vanno dal nano al Microscala12,13. Di varia ampiezza omogeneizzazione velocità o sonicazione, dimensione microparticella e nanoparticelle, rispettivamente, può essere modulata. Una volta che le particelle sferiche sono state generate, il film sottile stretching metodo qui descritto può essere utilizzato per deformare le particelle in varie forme15. In questo protocollo, descriviamo la generazione di particelle ellissoidali prolate e oblate allungando in una o due dimensioni, rispettivamente. Particelle sferiche sono gettate in una sottile pellicola di plastica, che è riscaldata oltre la temperatura di transizione vetrosa di PLGA e allungata in una o due dimensioni per deformare le particelle. Le proporzioni delle particelle è altamente controllabile. Sintonizzando il grado di allungamento della pellicola, le proporzioni delle particelle può essere modulata, e abbiamo trovato che il formato delle particelle misurate è altamente correlato con il valore stimato12,13. Varie altre forme possono essere generati modificando la temperatura durante l'allungamento o il livello di estensione. Per esempio, particelle discoidale biconcave che assomiglia alla forma dei globuli rossi possono essere generate da stretching microparticelle 1,5 volte in due dimensioni a 90 ° C. 15. questo film lo stretching tecnica è stato utilizzato anche per trasformare le particelle sferiche di polistirolo in molte forme anisotropici anche vermi, botti e rettangolare dischi21. Il film lo stretching dispositivo può essere utilizzato da controllare manualmente le viti o il dispositivo può essere automatizzato come mostrato nella Figura 1 per rendere il processo più efficiente e coerente15. Questa semplice tecnica produce attendibilmente anisotropiche particelle che mantengono la loro forma sotto condizioni fisiologiche24. Inoltre, questo metodo è stato applicato ad altri materiali polimerici, inoltre di PLGA, quali policaprolattone (PCL) e ibrido particelle fatte di PLGA e poli (beta-amminico estere) (PBAE).
Questo protocollo descrive anche come particelle di PLGA di varia dimensione e forma possono essere coniugate con le proteine di superficie necessarie per l'attivazione delle cellule T CD8 + fungere da aAPC. Proteine possono essere coniugati covalentemente a anisotropo e sferica PLGA micro - e nanoparticelle di EDC/NHS mediata accoppiamento delle ammine primarie sulle proteine a gruppi carbossilici sulla superficie della particella. L'efficienza di coniugazione della proteina può essere misurata con accoppiamento proteina fluorescente contrassegnata alla superficie delle particelle, come descritto in questo protocollo, e abbiamo trovato che questa tecnica coppie proteina per particelle a 15-20% efficienza12, 13. Prolata ellissoidali micro e nanoparticelle aAPC sono più efficaci di quanto le loro controparti sferiche all'attivazione di CD8 + T cell proliferazione e l'espansione in vitro12,13. AAPC ellissoidali sono migliorati associazione a e interazione con le cellule di T a causa della loro maggiore superficie di contatto12. Anisotropiche particelle hanno anche proprietà superiori più particelle sferiche in vivo a causa della loro avanzata biodistribuzione e la resistenza alla fagocitosi13. Questa piattaforma è altamente modulare e ha il potenziale per essere adattato a molte altre applicazioni di consegna della droga. Utilizzando questa procedura, particelle polimeriche di tunable forma e dimensione possono essere generate e superficie della particella può essere coniugata con tutta la proteina di interesse.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
EBA (DGE-1746891) e KRR (DGE-1232825) grazie al programma NSF Graduate Research Fellowship per supporto. Grazie RAM nazionali di ricerca servizio premio NIH NCI F31 (F31CA214147) e le ricompense di successo per College scienziati Fellowship per supporto. Gli autori ringraziano il NIH (R01EB016721 e R01CA195503), la ricerca per prevenire la cecità James e Carole gratis Catalyst Award e l'Istituto di Bloomberg-Kimmel JHU per immunoterapia del cancro per il supporto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly(vinyl alcohol), MW 25000, 88% hydrolyzed | Polysciences, Inc. | 02975-500 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Digital Thermometer | Fluke | N/A | Model name: Fluke 52 II |
| Immersion Temperature Probe | Fluke | N/A | Model name: Fluke 80PK 22 |
| Digital Hotplate & Stirrer | Benchmark Scientific | H3760-HS | |
| Multipoint stirrer | Thermo Fisher Scientific | 50093538 | |
| Resomer RG 504 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide) | Sigma-Aldrich | 719900 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | D65100 | |
| Homogenizer | IKA | 0003725001 | |
| Sonicator | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Model number: VC 505 |
| Sonicator sound abating enclosure | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0427 |
| Sonicator probe | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0220 |
| Sonicator microtip | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0423 |
| High speed centrifuge | Beckman Coulter | N/A | Model number: J-20XP (discontinued), alternative model: J-26XP |
| High speed centrifuge rotor | Beckman Coulter | 369691 | Model number: JA-17 |
| High speed polycarbonate centrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific | 3118-0050 | 50 mL, screw cap |
| Rectangular disposable petri dish | VWR International | 25384-322 | 75 x 50 x 10 mm |
| Square disposable petri dish | VWR International | 10799-140 | 100 mm x 100 mm |
| LEAF Purified anti-mouse CD3ε Antibody | Biolegend | 100314 | |
| InVivoMab anti-mouse CD28, clone 37.51 | Bio X Cell | BE0015-1 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | E6383 | |
| N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt | Sigma-Aldrich | 56485 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100212 | |
| APC anti-mouse CD28 Antibody | Biolegend | 102109 | |
| Corning 96 Well Solid Polystyrene Microplate | Sigma-Aldrich | CLS3915 | flat bottom, black polystyrene |
| Protein LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431081 | |
| RPMI 1640 Medium (+ L-Glutamine) | ThermoFisher Scientific | 11875093 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | Heat Inactivated, sterile-filtered |
| Ciprofloxacin | Sigma-Aldrich | 17850 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Recombinant Human IL-2 (carrier-free) | Biolegend | 589102 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| MEM Vitamin Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11120052 | |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyi Biotech | 130-104-075 | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFisher Scientific | C34554 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| MACS Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Flow Cytometer | Accuri C6 | ||
| Synergy 2 Multi-Detection Microplate Reader | BioTek | ||
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi BIotech | 130-091-221 | |
| Cell Strainer | ThermoFisher Scientific | 22363548 | Sterile, 70 µm nylon mesh |
| ACK Lysing Buffer | ThermoFisher Scientific | A1049201 | |
| C57BL/6J (Black 6) Mouse | The Jackson Laboratory | 000664 | Male, at least 7 weeks old |
| U-Bottom Tissue Culture Plates | VWR | 353227 | Sterile, 96-well tissue culture treated polystyrene plates |
| 40 V DC Power Supply | Probotix | LPSK-4010 | |
| PTFE Coated Wire | Mouser | 602-5858-100-01 | This is for a 100 ft. spool but an equivalent wire will work |
| Stepper Motor Driver | Probotix | MondoStep5.6 | |
| IDC Connector Kit | Probotix | IDCM-10-12 | |
| Microcontroller | Probotix | PBX-RF | |
| 4A Fuses | Radio Shack | 2701026 | Equivalent fuses will work as well |
| DB25 Male to Male Cable | Probotix | DB25-6 | |
| USB-A to USB-B Cable | Staples | 2094915 | Equivalent cable will work as well |
| 8-Pin Amphenol Connectors Male and Female | Mouser | 654-97-3100A-20-7P and 654-97-3106A20-7S | |
| Stepper Motor | Probotix | HT23-420-8 | |
| Right Hand Lead Screw | Roton | 60722 | |
| Left Hand Lead Screw | Roton | 60723 | |
| Screws | McMaster Carr | 92196A151 | |
| Neoprene Rubber | McMaster Carr | 8698K51 | |
| Right Handed Flanged Lead Nut | Roton | 91962 | |
| Left Handed Flanged Lead Nut | Roton | 91963 | |
| Linux Control Computer | Probotix | LCNC-PC | Any computer with matching specification and Linux operating system will work |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma-Aldrich | CLS431097 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4 % | ThermoFisher Scientific | 15250061 |
References
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