Summary
ここでは、迅速かつ再現性をもって生物学的に促された、生分解性のバスユニットなど抗原提示し、可変サイズ、形状、および T 細胞の拡大前のヴィヴォまたは体内表面蛋白質プレゼンテーションと細胞 (aAPC) を生成するためのプロトコルを提案します。.
Abstract
人工抗原提示細胞 (aAPC) は、T 細胞を刺激するために強力な能力による免疫変調の有望なプラットフォームです。無細胞基板は、信号プレゼンテーション パラメーターの正確な制御と T 細胞との相互作用を調節する aAPC 表面の物理的性質などを含む細胞ベースの aAPC 上重要な利点を提供しています。異方性粒子から構成されて aAPC 特に楕円体粒子結合の増加と T 細胞の大きい表面積のための刺激的な T 細胞の球形対応連絡先としてもより効果的であることが示されています。非特異的取り込みと強化された薬物動態特性を減少。異方性粒子の関心の高まり、にもかかわらず実装および再現性をもって使用する薄膜のストレッチが困難になるなど、異方性粒子を生成する方法をも広く受け入れ。
このため、我々 は可変のサイズ、形状を持つ生分解性異方性粒子ベース aAPC の急速な標準化された作製のためのプロトコルを記述して T 細胞拡張前のヴィヴォまたは生体内で、方法と一緒にプレゼンテーションを信号サイズ、形態、およびコンテンツ、表面蛋白質を特徴付けるその機能を評価します。異方性 aAPC の製造へのこのアプローチは、スケーラブルかつ再現可能な作って、aAPC「市販」免疫療法のための生成に理想的です。
Introduction
彼らは堅牢な抗原特異的 T 細胞応答を生成できるため、人工抗原提示細胞 (aAPC) は免疫調節剤として約束を示しています。これらのプラットフォームに不可欠な効率的に T 細胞の活性化のための重要な信号を提示するという機能です。容易で安価を作製、スケール アップと翻訳の間に少ない課題に直面し、細胞ベースの治療に関連付けられているリスクを軽減するため、無細胞 aAPC、セルベース aAPC に魅力的な代替手段です。無細胞 aAPC は信号プレゼンテーション パラメーター制御の高度と T セル1に接続されます。 表面の物理的性質を有効にできます。
aAPC は、T 細胞の活性化に不可欠な 2 つの信号の最小値を要約する必要があります。シグナル 1 は、抗原認識を提供し、T 細胞受容体 (TCR) を認識し、MHC クラス I または II の同種の抗原を軸受を介して複雑な TCR シグナリングで最高潮に達する従事し場合に発生します。抗原特異性要件をバイパスするには、aAPC システムはしばしば特異的 TCR 複合体を刺激する CD3 受容体に対するアゴニスト抗体を負担します。MHC、特に MHC 多量の組換えの形態は、抗原特異性2,3を提供するために、aAPC の表面に使用されています。信号 2 は T 細胞の活動を指示する共刺激シグナルです。共刺激が引き起こす T 細胞の活性化に必要なを提供するために 4-1 bb など他の共刺激受容体が正常にターゲットを絞った4をされているが、CD28 受容体は一般的に aAPC 表面アゴニスト抗体で刺激されます。1 と 2 の信号タンパク質 aAPC を合成する剛体粒子の表面に通常固定されています。歴史的に、aAPC はポリスチレンの4、5と鉄デキストラン6を含む、材料の様々 なでつくられています。新しいシステムは利用するポリ (乳酸グリコール酸) のような生分解性ポリマー (PLGA) aAPC 蛋白質に信号を簡単に結合することができます、生体内直接管理に適しているとの持続的な放出を促進することができますを生成するにはサイトカインや可溶性因子 T 細胞活性化7、8を強化するためにカプセル化されます。
必要な信号蛋白質の存在に加え aAPC/T 細胞間相互作用の中に十分に大きい面積で受容体関与は T 細胞の活性化に不可欠です。したがって、aAPC のサイズや形状などの物理的なパラメーターを大幅にその接触面積を変更し、T 細胞を刺激するために彼らの能力に影響を与えます。ミクロン サイズ aAPC 刺激 T 細胞で、ナノスケールの対応9,10よりも効果的であることが示されています。しかし、ナノ aAPC は優れた体内分布および可能性があります、パフォーマンス強化体内にマイクロ aAPC11リンパ節よりよい排水を持つことができます。形状は、aAPC の粒子ベース システムへの関心の別の変数です。異方性 aAPC は最近刺激 T 細胞, と標的細胞の減らされた非特異的細胞取り込みと相まって強化された相互作用による主に等方性粒子よりもより効果的に示されています。細胞は優先的に楕円体粒子の長軸をバインドし、平坦なサーフェスの曲率半径を大きく aAPC と T 細胞の12のより多くの接触を可能にします。楕円体粒子の長軸は、貪食能、次の体内管理12,13球状粒子と比較して高められた循環時間の結果を落胆させます。これらの利点のため楕円体粒子仲介抗原特異的 T 細胞体外と体内の球形の粒子と比較しての拡大効果は観測マイクロおよびナノスケールの回路の両方で12、 13。異方性粒子を製造するための様々 な戦略がありますが、多様な粒子形状14の範囲を生成するために使用シンプルで広く受け入れられている方法は、薄膜のストレッチします。次の合成、粒子は映画にキャスト、粒子材料のガラス転移温度以上の温度で 1 つまたは 2 つの次元で伸びる。フィルム粒子を取得するために溶かします。異方性粒子の関心の高まり、にもかかわらず加工粒子ベース aAPC の現在のアプローチは等方性システムに制限されてほとんどと粒子形状を変更する方法は、実装が困難な特定 aAPC 合成と互換性がありません。戦略と精度と再現性の欠如15。当社の薄膜のストレッチ法は、手動で実行または急速に様々 な生分解性高分子から合成される異方性粒子を生成するための自動化された方法で 1 つまたは 2 つの次元のための15で必要な縦横比に拡大できます。
生分解性の粒子ベースのアプローチで急速に aAPC 可変サイズと形状を生成する T 細胞の拡大前のヴィヴォまたはのための標準化された方法でスケーラブルな薄膜ストレッチ技術と相まって開発した従来の仕事に基づいて、vivo。この aAPC システムに高度な柔軟性を与える目的の密度の粒子表面にカルボキシル基と関心の任意の蛋白を結合する蛋白質活用戦略を使用できます。サイズ、形態、表面蛋白質、aAPC のコンテンツを評価し、その機能の in vitro評価法についても述べる。このプロトコルは、展開前のヴィヴォ免疫細胞や生体内でさまざまな免疫療法のアプリケーションのために容易に適応することができます。
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Protocol
ここで説明するすべての方法は、制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ジョンズ ・ ホプキンス大学のによって承認されています。
1. 可変サイズの球形の PLGA 粒子の作製
- 微粒子の合成のための材料の準備
- W/w ポリビニル アルコール (PVA) の 5% 溶液を準備します。
- 磁気攪拌棒三角フラスコに 500 mL の純水 (DI) を追加、500 rpm とモニター温ホット プレート攪拌に温度計付き。蒸発を防ぐためにアルミ箔のフラスコをカバーします。
- 水温約 70 ° C に達すると、追加 PVA の 25 g 合計小さなバッチで時間をかけて増やす前に解散する PVA を待っています。
- すべて PVA 溶解 (通常 30-60 分)、かつては、ソリューションのクールで滅菌フィルターをみましょう。将来の使用のための 4 ° C で保存します。
- 10 %w/w PVA フィルム鋳造ソリューションと 2%/w グリセリンを準備します。
- 電磁攪拌棒、三角フラスコに DI 水の 500 mL を追加します。製粉によって室温とミックスでグリセロール 8 mL を追加します。
- 温度計付き 500 rpm とモニター温ホット プレート攪拌にフラスコを配置します。蒸発を防ぐためにアルミ箔のフラスコをカバーします。
- 溶液温度約 70 ° C に達すると、追加 50 g 合計 PVA の小ロットで、時間をかけて増やす前に解散する PVA を待っています。
- すべて PVA 溶解 (通常 60 分)、一度ソリューション クールで滅菌フィルター孔径 0.22 μ m のボトル上部真空フィルター システムを使用しなさい将来使用するため室温で保管します。
- 50 mL の 1%/w PVA の水溶液を準備します。100-150 の mL のビーカーに (1.1.1 製) 5 %pva 溶液 10 mL の純水 40 mL を追加します。
- 100 mL 0.5%/w PVA の水溶液を準備します。150-250 mL ビーカーに 90 mL ・ ディ ・水と 5 %pva 溶液 10 mL を追加します。
- 0.5 %pva の水溶液と化学フード 500 rpm で室温で撹拌プレート上の場所に磁気攪拌棒を追加します。
- W/w ポリビニル アルコール (PVA) の 5% 溶液を準備します。
- 微粒子の合成
- ポリ (乳酸グリコール酸) 100 mg を量り (PLGA) シンチレーション バイアルにジクロロ メタン (DCM) の 5 mL で溶解。渦、PLGA を溶解します。
- 50 mL の 1 %pva 溶液ホモジナイザーに置き、それに触れることがなく、できるだけ、ホモジナイザーがビーカーの底の近くにあります。ホモジナイザーをオンにし、必要な速度に調整-5 μ m 径の粒子、5,000 rpm 15,000 rpm (均質化速度減少粒子サイズを増やす) 1 μ m、3 μ m の 3,200 rpm。一度希望の速度でビーカーに PLGA ソリューションを追加し、1 分間ホモジナイズしてください。
- 均質化後、1 を注ぐ %pva、PLGA 微粒子溶液撹拌プレートとフードの化学溶媒の蒸発のために少なくとも 4 時間攪拌 100 mL 0.5 %pva の水溶液にします。
- ・ ディ ・水で 3 倍の粒子を洗浄します。
- 5 分間、50 mL の円錐管に 3000 × g で遠心分離粒子溶液を注ぐ。上清を注ぐし、DI 水約 20 mL を加えます。
- ボルテックスによって粒子を再懸濁します。一度再停止、DI 水で 50 ml の円錐管を埋めます。
- 同じことが 2 回以上何度洗ってください。
- ナノ粒子合成
- シンチレーション バイアルに PLGA の 200 mg を量り、DCM の 5 mL に溶かします。渦、PLGA を溶解します。
- 氷を入れた容器に 50 mL の 1 %pva 溶液をビーカーを置きます。触れることがなく、できるだけ底の近くにビーカーに超音波発生装置のプローブを配置します。超音波処理を開始し、すぐにビーカーに PLGA ソリューションを追加します。200 のおおよその直径を持つナノ粒子を生成する 2 分の 12 W の力で超音波 nm。
- 超音波処理後、1 を注ぐ %pva、PLGA ナノ粒子溶液 100 mL 0.5% の PVA 溶液撹拌プレートとフードの化学溶媒の蒸発のために少なくとも 4 時間撹拌に。
- 50 mL の円錐管に微粒子を取除くために 5 分の 3,000 × g で遠心分離粒子溶液を注ぐ。上清を除去し、高速遠心管に注ぐ。
- 3 回の DI 水で粒子を洗浄します。40,000 × g で 15 分間遠心します。上清を注ぐし、ボルテックス ・ ディ ・水で再懸濁します。同じことが 2 回以上何度洗ってください。
2. 可変形状のポリマー粒子の作製
- PLGA 粒子を 3 回洗浄した後は、約 1 mL の純水で粒子を再懸濁します。フィルムの鋳造ソリューションを 2.5 mg/mL 粒子の最終的な粒子濃度の粒子に追加します。
- 75 × 50 mm の長方形ペトリ皿ストレッチ一次元または二次元ストレッチ用 100 × 100 mm 角シャーレに 15 mL 因数でに粒子の懸濁液 10 ml のピペットします。いずれかのピペットを用いた気泡または側にプッシュの泡を削除し、膜化学フードで一晩乾燥。
- フィルムが乾燥すると、一度フィルムをプラスチック製の食器からピンセットで削除し、ハサミでフィルムの端が切れます。球状粒子として使用される 50 mL の円錐管にエッジを保存します。
- アルミ ブロックの上にフィルムをマウントすることによってストレッチ装置自動薄膜上にフィルムをロードします。1 D ストレッチ、ネオプレンゴムの 2 枚の間にフィルムの 2 つの短いエッジを配置することによってアルミニウム ブロック担架 (図 2) の 1 つの軸の上にフィルムをマウントします。六角レンチを使用して、場所にフィルムを保持するゴムの上に金属製のグリップをネジします。2 D ストレッチの両方の軸 (図 2) を伸ばすための 4 つのアルミ ブロックにすべての 4 つの端をマウントします。
- 測定し、1 D ストレッチの 1 つの軸または 2 D ストレッチの両方の軸上のアルミ ブロックの間にフィルムの長さを記録します。倍伸縮する目的に基づいて 1 つまたは 2 つの方向にフィルムを伸ばすために必要な距離を計算します。
- 90 ° C のオーブンで映画ロードの伸縮装置を置き、10 分以上温度にフィルムをもたらします。場所大ビーカーに少量の水と一緒にオーブンで。
- ストレッチ フィルム。
- ストレッチが完了したら、オーブンから伸縮装置を除去し、20 分間室温にフィルムを冷ます。
- 1 D 端ストレッチ デバイスから映画をカット、ストレッチします。2D ストレッチ両方の軸のうち、中央の正方形は均一に伸びるフィルムの保存をカットします。チューブあたり 2 作品と円錐管でフィルムを置き、映画の残りの部分を破棄します。
- フィルムが溶解するまで各円錐管と渦に DI 水約 25 mL を追加します。
- フィルムが溶けると、一度は、DI 水で 3 回の粒子を洗浄します。
- 微粒子、5 分間 3000 × g で遠心分離し、50 mL の円錐管を埋める、上澄みを注ぐ、DI 水の粒子を再懸濁しますに渦約 20 mL を加えます。
- 転送高速遠心分離機管 40,000 × g で 15 分間遠心する粒子ナノ粒子上清を注ぐ、DI 水の粒子を再懸濁しますに渦約 20 mL を加えます。
- 第 3 洗浄後約 1 mL の純水で粒子を再懸濁します。遠心チューブの重量を記録し、粒子をチューブに追加します。1 時間またはフラッシュ-80 ° C のフリーザーで凍結粒子を液体窒素で凍結します。凍結後は、粒子を一晩凍乾します。
- 凍結乾燥、一度遠心チューブの粒子の重量を量るし、凍結乾燥粒子の重量を決定する空の管の記録できる体重を引きます。
3. 表面蛋白質共役人工抗原提示細胞を作成するには
- 準備 2-(N Morpholino) ethanesulfonic 酸 (MES) バッファー。水で MES の 0.1 M 溶液を作成し、1 M 水酸化ナトリウム (NaOH) を滴定法による 6.0 に pH を調整します。
- ボルテックスでは、MES バッファーに 20 μ g/mL で凍結乾燥 PLGA/PBAE マイクロ/ナノ粒子を再懸濁します。MES バッファーの 900 μ L でポリプロピレン製遠心管を埋めるし、チューブに粒子溶液 100 μ L を追加します。
- EDC/NHS ソリューションを準備します。40 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) カルボジイミド (EDC) および 48 mg N hydroxysulfoxuccinimide (NHS) 1 mL MES バッファーに溶解します。
- 粒子と混合する渦に 100 μ L の EDC/NHS のソリューションを追加します。
- 30 分間室温でインバーターのチューブを孵化させなさい。
- 5 分 5 分、または 17,000 x g でナノ粒子の 5,000 × g で微粒子を回しなさい。上澄みを廃棄し、5 秒間 (ナノ粒子) 2-3 W でボルテックス (微粒子) または sonicating 1 mL PBS に再懸濁します。
- 微粒子、パーティクルに所望信号 1 タンパク質と 10 μ g 抗マウス CD28 の 8 μ g (クローン 37.51) を追加します。ナノ粒子、16 μ g 信号 1 と 20 μ g 抗マウス CD28 を追加します。1.1 mL をチューブでボリュームをもたらすに PBS を追加します。
- 4 ° C でインバーターのチューブを一晩インキュベートします。
- 次の日は、粒子を洗浄します。5 分 5 分、または 17,000 x g でナノ粒子の 5,000 × g で微粒子を回しなさい。、上澄みを廃棄し、粒子を 1 mL の滅菌 PBS でボルテックス (微粒子) または 5 秒 (ナノ粒子) の 2-3 W で超音波処理によって再懸濁します。2 回繰り返します。
- 即座の使用のための培地の必要な濃度で粒子を再懸濁します。長期保存 10 Mg/ml と 100 mM ショ糖液で粒子を再懸濁します。凍結、凍結乾燥、-80 ° C で粒子を保存
4. 評価と aAPC の評価
- AAPC サイズと形状 (図 3) の評価
- 走査型電子顕微鏡 (SEM) を用いた画像の粒子が微粒子のサイズと形状を特徴付けます。アルミに付着したカーボン テープ上にイメージング、広がりの凍結乾燥粒子 SEM のためのタックし、スパッター ・金パラジウム コート。
- サイズと画像解析ソフトを用いた粒子の縦横比を分析します。
- 粒子のサイズを決定するには、スケール バーを使用してスケールを設定し、粒子径を測定します。平均粒子径を決定し、粒子サイズのヒストグラムを生成する約 100 の粒子に対して繰り返します。
- 縦横比を決定するには、長い軸と粒子の短い軸間の距離を測定、短軸で軸を分割します。各図形の平均粒子アスペクト比を決定し、ヒストグラムを生成する各図形の約 50 の粒子に対して繰り返します。
- 透過型電子顕微鏡 (TEM) を用いた粒子をイメージングによるナノ粒子のサイズと形状を特徴付けます。サイズと縦横比 5.1.2 で説明されているように画像解析ソフトを用いたナノ粒子を分析します。また、動的光散乱 (DL) または追跡分析 (NTA) ナノ粒子を使用して球状ナノ粒子のサイズを測定します。
- タンパク質共役効率
- 1-3 の方法に従って aAPC の準備が、ステップ 3.7 で蛍光シグナル 1 蛋白質と抗マウス CD28 を使用します。活用、洗濯後最終濃度 2 mg/mL aAPC の 1 ml の PBS、aAPC を再懸濁します。
- 黒ポリスチレン 96 ウェル マイクロ プレートでの蛋白質の標準を準備します。プレートの最初の井戸に PBS に蛍光に分類されたシグナル 1 蛋白質の 5 μ g を追加し、プレートの行 PBS で 10 1:2 の希釈液を作る。最後も空白のままにします。蛍光に分類された抗 CD28 と標準の別のセットを生成するこの手順を繰り返します。
- 3 通で黒のポリスチレン マイクロ プレートの複製の井戸に aAPC 溶液 100 μ L をピペットします。
- 適切な波長の蛍光プレート リーダーの蛍光を読み取る。蛋白質の標準から蛍光の測定値を使用すると、各蛍光抗体の標準曲線を生成できます。標準曲線を使用して、各サンプルよく抗 CD28 と信号 1 の濃度を計算し、表面のタンパク質と共役効率 (図 4 a, 図 5 a) の量を計算します。
- AAPC体外cd8 T 細胞の刺激のための評価
- B' メディアを準備 (L グルタミン、10 %fbs、1% 非本質的なアミノ酸液、ピルビン酸ナトリウム 1%、1 %mem ビタミン溶液 RPMI 培 92 μ M β-メルカプトエタノール、10 ng/mL シプロフロキサシン、30 U/mL IL-2。
- 二酸化炭素の暴露を介して黒 6 マウスを犠牲に。
- 以前に確立されたプロトコル16によるとマウスから脾臓を収穫します。10-50 mL のコニカル チューブに脾臓を収集 15 mL PBS。乳棒を用いて 50 mL の円錐管に 70 μ m セル ストレーナー脾臓をマッシュします。マッシュ アップ、中に 40 mL の PBS でストレーナーを洗浄します。
- 5 分間 300 x g で脾細胞をスピンします。上清を注ぎ、4 mL の赤の血液細胞を溶解する Ack 溶解バッファーで脾細胞を再懸濁します。1 分邪魔に座って管を許可する、PBS を 20 mL チューブにボリュームを表示するを追加します。
- 5 分の 300 x g でセルを回しなさい。上清を離れて注ぎ、1 mL の PBS で細胞を再懸濁します。診断を使用してセルをカウントします。
- 5 分の 300 x g でセルを回し、細胞分離バッファーの適切なボリュームで再懸濁します。Cd 8 + T 細胞 cd8 陰性選択 T 細胞分離キットには、次の製造元のプロトコルを使用して単一細胞懸濁液を分離します。
- 磁気分離後 5 分の 300 x g cd 8 + T 細胞を回し、細胞分離バッファーを削除します。1 mL の PBS で細胞を再懸濁し、セルをカウントします。製造元のプロトコルに従って carboxyfluorescein サクシニル エステル (CFSE) とセルにラベルを付けます。
- 8,333 cd8 陽性 T 細胞と 0.0833 mg (または必要な線量) 各ウェルで 150 μ L B' メディアに aAPC の 96 の孵化も組織培養治療プレート U 底。
- 37 ° C で 7 日間インキュベートします。3-4 日後に、75 μ L 新鮮な培地を各ウェルに追加することによって培養培地を更新します。
- 培養 3 日後増殖を評価する流れの cytometer で細胞を標識 CFSE を分析します。流れの cytometry CFSE ヒストグラムの各ピークは、各連続の細胞分裂と CFSE 希釈による細胞の世代を表します。
- 7 日後に、各ウェル内のセルの数をカウントするのに、検定を使用します。カウント、前にトリパン ブルー溶液と死んだ細胞を染色します。最終的な細胞数から死んだ細胞を除外します。初期濃度倍拡大(図 4 および図 5) を計算するために最終的な細胞濃度を正常化します。
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Representative Results
ストレッチ装置自動 2次元薄膜の回路図は、図 1で与えられます。Ho ら17標準加工と加工技術を使用してアルミ部品から担架を構築で回路図と 1 D 薄膜デバイスのストレッチの説明を与えます。1 D 担架と同様に、2 D の担架は金属のグリップとガイド レールで構成されます。双方向鉛ねじは、回転運動を直線に変換する使用されます。レジンリード スクリューは、十分なトルクと同一のステッピングモータに機械タップを介して接続されています。8 のステッピング モーター制御ワイヤーは、薄膜を伸ばすためオーブンで制御コンソールに簡単に添付ファイルの 8 ピン耐熱性 amphenol コネクタに半田付けすることができます。十分な長さのポリテトラフルオロ エチレン (PTFE) をコーティングしたワイヤーはコントロール コンソール ドライバーにステッピング モーターを接続するために使わなければなりません。推奨されるコンピューター制御方式は、図 1 aに与えられます。2 つのモーターは、2 つの独立したドライバーに耐熱配線を介して接続しなければなりません。2 つのドライバーは、コンピューターとインタ フェースするマイクロ コント ローラーに接続されている必要があります。ドライバーは、x 軸に接続する必要があります、y 軸がマイクロ コント ローラーに出力します。マイコンとドライバーは、外部電源を必要とします。これらの 3 つのコンポーネントに電源を接続する前に、4 A のヒューズが過電流からコンポーネントを保護するために動力を与えられた接続の間に挿入されることをお勧めします。最後に、DB25 オス オスのケーブルを使用してコンピューターにパラレル ポート入力を介してマイクロ コント ローラーをリンクできます。ステッピング モーターを制御するための電子機器は熱に敏感で、したがって、薄膜中にストレッチを有効にするのに十分な温度に加熱する操作中に使用 (オーブン) などの熱源の外にする必要があります。推奨モーターが粒子を伸ばすためこのプロトコルで指定温度まで耐熱性は、主電源に接続されている間、モータとドライバーの付加的な熱を構築します。したがって、デバイスは、潜在的な発熱を最小限に抑えるために実際のフィルムの期間中のみになってことをお勧めします。
PLGA ナノ ・微粒子はこのプロトコルで記述されている (図 3 a) TEM および SEM (図 3 b) をそれぞれ使ってイメージ化片面乳剤技術を使用して合成しました。球状微粒子 237.3 ± 4.0 nm、DLS と 224 の点の直径があった nm NTA (図 3) で測定しました。3 ± 1 μ m (図 3 D) の平均直径の球形粒子を生成する 5000 rpm で均質化により微粒子を合成しました。偏平楕円体粒子を生成する 2 次元で 70 ° C で伸ばしストレッチ装置 90 ° c 形楕円体ナノ ・微粒子を生成する 1 つの次元で自動化されたフィルムを使用して粒子が伸ばされました。すべての 3 つの図形の微粒子のアスペクト比は、長軸と短軸粒子の距離を測定し、2 つの分割によって分析されました。球状微粒子 1.05 ± 0.04 の縦横比、1 D 伸縮形楕円体粒子いた大きなアスペクト比の 3.6 ± 0.8 (図 3E)。2 D ストレッチ偏平楕円体粒子は、1.2 ± 0.2、約 1 つのアスペクト比を維持のアスペクト比を持っていた。
EDC/NHS 反応化学は、共役、蛍光標識ペプチド負荷 MHC 二量体と抗 CD28 抗体伸ばされた球形の PLGA 粒子の表面に使用しました。活用効率結果球状、楕円体のマイクロ aAPC (図 4 a) とナノ aAPC (図 5 a) の表面にタンパク質の似たような量を示し、aAPC 合成中に結合蛋白質がで発生することを示す、濃度依存的。球状と形の楕円体 aAPC 共役 MHC IgG ダイマーの gp100 ロード aAPC 機能に及ぼす形状を評価して抗 CD28 ブイデータ トランスジェニック cd8 陽性 T 細胞を刺激するために使用されました。T 細胞は CFSE で標識され、増殖 (図 4 b、 5 b) を評価するために 3 日後、フローサイトメトリーによる評価。0.01 mg の投与量で達成される最高の分離と球状 aAPC よりサブ飽和用量で T 細胞の増殖のハイレベルを誘導する形の楕円体 aAPC が見つかりました。7 日後 T 細胞は手動で数えられました。形楕円 aAPC より効果的に刺激 T 細胞 (図 4) マイクロ スケールやナノスケール (図 5)、球形の対応と比較して、線量依存性 T 細胞の拡大が認められました。
図 1: 自動薄膜担架の略図。(A) 薄膜担架の制御コンソールの模式図。(薄膜担架用機械のハードウェアの回路図 B)(左)機械のハードウェアのオーバーヘッドがビュー。(右)薄膜の機構をグリップの断面。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 異方性形状にポリマー粒子をストレッチする組み立ての自動化された薄膜担架の写真。ストレッチ装置 2次元薄膜フィルムをグリップ アルミ マウントで 2 つの軸で構成されます。2 つの軸は、互いから離れて移動するように反対方向にリード スクリューを含まれています。ストレッチのプロシージャを自動化するには、リンク USB マイコンは熱ケーブルを介してモータのユニポーラ ステッピングモータに信号を中継 2 つのステッピング モーター ドライバーに接続されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 球状や楕円の PLGA 粒子のサイズとアスペクト比の解析。(球状の TEM A) と (B) SEM イメージ、1 D は、長球、楕円、2 D ストレッチ偏平楕円 PLGA (A) ナノ粒子と (B) 微粒子を伸ばした。(C) 球状ナノ粒子国税庁によってサイズがあるし、判断 224 nm 程度。球状粒子のサイズ分布を (D) と (E) 縦横比のすべてのパーティクルのシェイプ PLGA 微粒子の SEM 像を行った。(小さいから13、著作権ワイリー VCH 2015 C) 再現しに適応アクセス許可。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 特性評価と球面と形の楕円体のマイクロ aAPC の機能評価します。(蛍光標識ペプチド負荷 MHC 二量体と抗 CD28 に対する IgG 抗体球面と形の楕円体微粒子の表面 A) 活用の効率化。(B) cd 8 + T 細胞は CFSE で標識され、インキュベートを球面と 1 D ストレッチ マイクロ aAPC 0.01、0.1、および 1 mg 用量または非同系コントロールで。3 日後の細胞は増殖を評価するためにフローサイトメトリーによって評価されました。(C) T 細胞は、手動を数えることによって 7 日後また評価されました。細胞数は、倍拡大の計算にカウントの初期値に正規化されました。形の楕円体および球倍拡大比較 * = p < 0.05 * * p < 0.01 と * * * p < 0.001 を =。誤差範囲は、3 の複製の (SEM) 平均値の標準誤差を表しています。生体材料12、著作権エルゼビア 2014年から再現しに適応アクセス許可。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 特性評価と球面と形の楕円体のナノ aAPC の機能評価します。(蛍光標識ペプチド負荷 MHC 二量体と抗 CD28 に対する IgG 抗体球面と形の楕円体ナノ粒子の表面 A) 活用の効率化。(B) cd 8 + T 細胞 CFSE 付け, インキュベートを球面と形楕円体ナノ-aAPC 0.01、0.1、および 1 mg 用量でさまざまな折りストレッチの.3 日後の細胞は増殖を評価するためにフローサイトメトリーによって評価されました。(7 日後マニュアルを数えることで変倍ストレッチ (1.5 から 3.5 まで) の形の楕円体粒子と孵化 C) T 細胞を評価しました。細胞数は、倍膨張を計算する未処理状態に正規化されました。* = p < 0.05 * * p < 0.01 と * * * = p < 0.001 球と比較して。誤差範囲は、3 の複製の (SEM) 平均値の標準誤差を表しています。小さな13、著作権ワイリー VCH 2015 から再現しに適応アクセス許可。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、異方性高分子粒子の正確な生成のため汎用性の高い方法を詳しく説明します。ここで説明する手法を伸ばして薄い膜がスケーラブルな高い再現性で安価です。異方性粒子を生成するための代替技術はコストが高い、低いスループット、および限られた粒を含む多くの制限に苦しみます。薄膜のアプローチをストレッチは、合成後に異方性粒子が変更されるため有利であると、その結果、粒子サイズと合成技術の広い範囲と互換性が。図 1は、自動二次元ストレッチ デバイスのセットアップを詳しく説明します。このデバイスは、フィルムがストレッチの所望の程度に達するまで手動でネジを回すことによって電子のコンポーネントなしでも使用できます。しかし、我々 は自動化されたプロセスがはるかに一貫して手動操作15より迅速を発見しました。マイクロ アプローチ17,18,19、層によってコーティング21、21 の他のボトムアップ合成アプローチなどの異方性粒子を合成する様々 な技術が開発されています。 ,22。ただし、これらのアプローチは、パーティクル ジオメトリを強力に制御を有効にしないし、として生成できる形状と使用することができます粒子材料の観点から汎用性はないです。非球形粒子を製造するための人気のあるトップダウン方式、非湿潤テンプレート (印刷)24粒子レプリケーションです。印刷は、粒子形状の正確な制御を可能それは高価な機械を必要し、としてアクセス可能で、簡単に薄膜のストレッチング方法として実装ではありません。
片面乳剤技術を使用して、PLGA ナノからマイクロ スケール12,13に至るまで、様々 なサイズの粒子を作製できます。さまざまな均質化速度や超音波振幅によって微粒子・ ナノ粒子のサイズ、それぞれできる変調します。球状粒子が生成されると、さまざまな図形15に粒子を変形する薄膜ストレッチングここで説明した方法が使えます。このプロトコルでは 1 つまたは 2 つの次元でそれぞれの伸張によって形、偏平の楕円体粒子の生成について述べる.球状粒子 PLGA のガラス転移温度以上に加熱し粒子を変形する 1 つまたは 2 つの次元で伸びる薄いプラスチックのフィルムにキャストされます。粒子のアスペクト比は非常に制御できます。フィルム ストレッチの度合いを調整することにより粒子のアスペクト比を変調することができます, と我々 は予測値12,13とその測定粒子アスペクト比が相関を発見しました。などの形をストレッチするときに温度または伸張の程度を変更することによって生成できます。90 ° C で 2 つの 1.5 倍の微粒子寸法をストレッチによって赤血球の形に似た凹面の円盤状粒子を生成ことができますたとえば、15. ストレッチ テクニックこの映画は、真球状のポリスチレン粒子をワーム、バレル、長方形ディスク21など多くの異方性形状に変換に使用されています。ネジを手動で制御することによりデバイスをストレッチ フィルムを使用したり、プロセスを向上させる図 1に示すように、デバイスを自動化できる効率的で一貫した15。この簡単な技術は、確実に24生理学的な条件の下でその形状を保持する異方性粒子を生成します。さらに、このメソッドに適用されている他の高分子材料に加えて、PLGA ポリカプロラクトン (PCL) など、ハイブリッド粒子 PLGA およびポリ (β-アミノ酸エステル) から成っている (PBAE)。
このプロトコルはまた、様々 なサイズと形状の PLGA 粒子が共役して aAPC として cd8 陽性 T 細胞の活性化に必要な表面の蛋白質と方法について説明します。異方性球状にした共役 PLGA マイクロとナノ粒子表面にカルボキシル基とタンパク質の第一アミンの EDC/NHS を介した結合によるタンパク質ができます。このプロトコルで説明されているように、粒子の表面に蛍光に分類された蛋白質を結合することによってタンパク質共役の効率を測定することができます、我々 は、この手法がタンパク質を 15-20% 効率12、粒子に結び付けられることを発見しました。 13。長球楕円マイクロとナノ粒子 aAPC 球対応する活性化 cd8 陽性 T 細胞増殖・拡大培養12,13よりも効果的です。楕円 aAPC が強化されたは、バインディングと連絡先12の大きい表面積のための T 細胞との相互作用。異方性粒子も球状粒子体内の彼らの強化された体内と貪食13への抵抗のために優れた特性を持っています。このプラットフォームは非常にモジュールと他の多くの薬物送達アプリケーションに適応する可能性を秘めています。この手順を使用して、調整可能な形状とサイズのポリマー粒子を生成でき、粒子表面は興味の任意のタンパク質と共役することができます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
EBA (DGE-1746891)、KRR (DGE-1232825) サポートの NSF 大学院研究フェローシップ プログラムをありがとうございます。RAM のおかげで国立研究サービス賞を受賞 NIH NCI F31 (F31CA214147) とサポートの大学科学者フェローシップの成果報酬です。著者に感謝 (R01EB016721 と R01CA195503) の NIH、失明ジェームスの防止およびキャロル無料カタリスト賞、研究サポートのためがん免疫療法のビジネスキャリー ブルームバーグ キンメル所。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly(vinyl alcohol), MW 25000, 88% hydrolyzed | Polysciences, Inc. | 02975-500 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Digital Thermometer | Fluke | N/A | Model name: Fluke 52 II |
| Immersion Temperature Probe | Fluke | N/A | Model name: Fluke 80PK 22 |
| Digital Hotplate & Stirrer | Benchmark Scientific | H3760-HS | |
| Multipoint stirrer | Thermo Fisher Scientific | 50093538 | |
| Resomer RG 504 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide) | Sigma-Aldrich | 719900 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | D65100 | |
| Homogenizer | IKA | 0003725001 | |
| Sonicator | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Model number: VC 505 |
| Sonicator sound abating enclosure | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0427 |
| Sonicator probe | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0220 |
| Sonicator microtip | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0423 |
| High speed centrifuge | Beckman Coulter | N/A | Model number: J-20XP (discontinued), alternative model: J-26XP |
| High speed centrifuge rotor | Beckman Coulter | 369691 | Model number: JA-17 |
| High speed polycarbonate centrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific | 3118-0050 | 50 mL, screw cap |
| Rectangular disposable petri dish | VWR International | 25384-322 | 75 x 50 x 10 mm |
| Square disposable petri dish | VWR International | 10799-140 | 100 mm x 100 mm |
| LEAF Purified anti-mouse CD3ε Antibody | Biolegend | 100314 | |
| InVivoMab anti-mouse CD28, clone 37.51 | Bio X Cell | BE0015-1 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | E6383 | |
| N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt | Sigma-Aldrich | 56485 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100212 | |
| APC anti-mouse CD28 Antibody | Biolegend | 102109 | |
| Corning 96 Well Solid Polystyrene Microplate | Sigma-Aldrich | CLS3915 | flat bottom, black polystyrene |
| Protein LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431081 | |
| RPMI 1640 Medium (+ L-Glutamine) | ThermoFisher Scientific | 11875093 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | Heat Inactivated, sterile-filtered |
| Ciprofloxacin | Sigma-Aldrich | 17850 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Recombinant Human IL-2 (carrier-free) | Biolegend | 589102 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| MEM Vitamin Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11120052 | |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyi Biotech | 130-104-075 | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFisher Scientific | C34554 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| MACS Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Flow Cytometer | Accuri C6 | ||
| Synergy 2 Multi-Detection Microplate Reader | BioTek | ||
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi BIotech | 130-091-221 | |
| Cell Strainer | ThermoFisher Scientific | 22363548 | Sterile, 70 µm nylon mesh |
| ACK Lysing Buffer | ThermoFisher Scientific | A1049201 | |
| C57BL/6J (Black 6) Mouse | The Jackson Laboratory | 000664 | Male, at least 7 weeks old |
| U-Bottom Tissue Culture Plates | VWR | 353227 | Sterile, 96-well tissue culture treated polystyrene plates |
| 40 V DC Power Supply | Probotix | LPSK-4010 | |
| PTFE Coated Wire | Mouser | 602-5858-100-01 | This is for a 100 ft. spool but an equivalent wire will work |
| Stepper Motor Driver | Probotix | MondoStep5.6 | |
| IDC Connector Kit | Probotix | IDCM-10-12 | |
| Microcontroller | Probotix | PBX-RF | |
| 4A Fuses | Radio Shack | 2701026 | Equivalent fuses will work as well |
| DB25 Male to Male Cable | Probotix | DB25-6 | |
| USB-A to USB-B Cable | Staples | 2094915 | Equivalent cable will work as well |
| 8-Pin Amphenol Connectors Male and Female | Mouser | 654-97-3100A-20-7P and 654-97-3106A20-7S | |
| Stepper Motor | Probotix | HT23-420-8 | |
| Right Hand Lead Screw | Roton | 60722 | |
| Left Hand Lead Screw | Roton | 60723 | |
| Screws | McMaster Carr | 92196A151 | |
| Neoprene Rubber | McMaster Carr | 8698K51 | |
| Right Handed Flanged Lead Nut | Roton | 91962 | |
| Left Handed Flanged Lead Nut | Roton | 91963 | |
| Linux Control Computer | Probotix | LCNC-PC | Any computer with matching specification and Linux operating system will work |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma-Aldrich | CLS431097 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4 % | ThermoFisher Scientific | 15250061 |
References
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