Summary
כאן, אנו מציגים את פרוטוקול לייצר במהירות, reproducibly articifical בהשראה ביולוגית, מתכלה אנטיגן הצגת תאים (aAPC) עם tunable גודל, צורה של הדם המצגת ל- T cell הרחבה שמחוץ או ויוו .
Abstract
תאים המציג אנטיגן מלאכותית (aAPC) הם פלטפורמה מבטיח עבור אפנון המערכת החיסונית עקב יכולתם חזק כדי לגרות את תאי T. מצעים acellular מציעים יתרונות מרכזיים על פני מבוססת-תא aAPC, כולל שליטה מדויקת של הפרמטרים מצגת אות ומאפיינים פיזיים של פני השטח aAPC כדי לווסת את האינטראקציות שלה עם תאי T. aAPC בנוי אניסוטרופי חלקיקים, במיוחד אליפסואידי חלקיקים, הוכחו להיות יעילים יותר מאשר עמיתיהם הכדורית שלהם על תאי T מגרה בשל הכריכה מוגברת שטח גדול יותר זמין עבור תא T קשר, גם כן כמו מופחתת ספיגת לא ספציפית, המאפיינים פרמוקוקינטיים משופרת. למרות שהאיחוד חלקיקים אנאיזוטרופי, מקובל אפילו מאוד שיטות של יצירת חלקיקים אניסוטרופי כגון סרט דק מותח עשויה להיות מאתגרת להטמיע ולהשתמש reproducibly.
למטרה זו, אנו מתארים פרוטוקול על הזיוף מהירה, מתוקננת של מתכלה אניסוטרופי מבוסס חלקיק aAPC עם tunable, גודל, צורה, אות מצגת עבור תא T הרחבה שמחוץ או ויוו, יחד עם שיטות לאפיין שלהם גודל, מורפולוגיה, תוכן, משטח חלבון כדי להעריך את הפונקציונליות שלהם. גישה זו כדי בודה aAPC אניסוטרופי היא מדרגית, לשחזור, שהופך אותו אידיאלי עבור יצירת aAPC עבור immunotherapies "מדף".
Introduction
תאים המציג אנטיגן מלאכותית (aAPC) הראו הבטחה כסוכני immunomodulatory כי הם יכולים ליצור תגובה חזקה תא T אנטיגן ספציפי. אתרי פלטפורמות אלו הן את היכולת שלהם ביעילות להציג אותות חיוני להפעלת תא T. Acellular aAPC הם חלופה אטרקטיבית מבוססת-תא aAPC כי הם קלים יותר ויקרות פחות לפברק בפני אתגרים פחות במהלך הסולם ותרגום, להקל על סיכונים הקשורים טיפולים מבוססי תאים. Acellular aAPC מאפשרים גם רמה גבוהה של שליטה על שידור מצגת פרמטרים ומאפיינים פיזיים של השטח, מה ממשק עם T תאים1.
aAPC חייב מסכם את הדברים מינימום של שני אותות חיוניים עבור הפעלת תא T. אות 1 מספק זיהוי אנטיגן, מתרחשת כאשר הקולטן תא T (TCR) מזהה ועוסק עם מחלקה MHC I או II הנושאת אנטיגן cognate שלה, שהגיעה לשיאה ב איתות באמצעות TCR מורכבות. כדי לעקוף את הדרישה ירידה לפרטים אנטיגן, מערכות aAPC לעיתים קרובות נושאים נוגדנים חד-שבטיים היתה ללא-חת כנגד הקולטן CD3, אשר nonspecifically מעוררת את המתחם TCR. צורות רקומביננטי של MHC, במיוחד MHC multimers, גם שימשו על פני השטח של aAPC כדי לספק אנטיגן ירידה לפרטים2,3. אות 2 הוא סימן costimulatory מנחה את תא T פעילות. כדי לספק את costimulation הדרוש להפעלת תא T, הקולטן CD28 מגורה באופן כללי עם נוגדן היתה ללא-חת הציגו על פני השטח aAPC, למרות קולטנים costimulatory אחרים כגון 4-1BB היה יישוב בהצלחה4. אות 1 ו-2 חלבונים ללא יכולת תנועה הם בדרך כלל על פני השטח של חלקיקים נוקשה לסנתז aAPC. מבחינה היסטורית, aAPC היה מפוברק ממגוון רחב של חומרים, כולל פוליסטירן4,5 ו ברזל לתוספי6. מערכות חדשות לנצל פולימרים מתכלים כמו פוליפוני (חומצה לקטית-co-גליקולית) (PLGA) כדי ליצור aAPC זה יכול להיות משולב בקלות כדי לאותת חלבונים מתאימים עבור ניהול ישיר ויוו, יכול להקל על שחרורו מתמשכת של אנקפסולציה ציטוקינים או גורמים מסיסים להעצמת תא T-הפעלה-7,-8.
בנוסף נוכחותם של חלבונים הדרושים אות, אירוסין קולטן על פני שטח גדול מספיק במהלך האינטראקציה תא aAPC/T חיוני להפעלת תא T. לפיכך, פרמטרים פיזיים של aAPC כגון גודל וצורה באופן דרסטי לשנות תחום הקשר הזמינים, להשפיע על יכולתם לעורר תאי T. AAPC בגודל מיקרון הוכחו להיות יעילים יותר על תאי T מגרה מאשר שלהם הננומטרי עמיתיהם9,10. עם זאת, ננו-aAPC יכול להיות מעולה biodistribution ניקוז טוב יותר אל בלוטות הלימפה עשוי המשפרים את ביצועי ויוו מיקרו-aAPC11. צורה זו היא משתנה אחר עניין במערכות aAPC מבוסס חלקיק. AAPC אניסוטרופי לאחרונה הוכחו להיות יעיל יותר מאשר חלקיקים איזוטרופיות על תאי T מגרה, בעיקר עקב אינטראקציה משופרת עם תאי המטרה בשילוב עם תאים שאינם ספציפיים מופחתת ספיגת. תאים מעדיפים לאגד לציר הארוך של חלקיקים אליפסואידי, ולאפשר רדיוס גדול יותר של עקמומיות, משטח שטוח יותר קשר בין aAPC לבין תא T12. לציר הארוך של חלקיקים אליפסואידי מרתיעה גם phagocytosis, וכתוצאה מכך זמן מחזור הדם מוגברת בהשוואה חלקיקי כדורית בעקבות ויוו המינהל12,13. בגלל יתרונות אלה, חלקיקים אליפסואידי לתווך הרחבה יותר של אנטיגן ספציפי T תאים במבחנה וב ויוו בהשוואה חלקיקי כדורית, אפקט נצפו על מיקרו והן nanoscales12, 13. ישנן אסטרטגיות שונות כדי לבדות חלקיקים אנאיזוטרופי, אבל סרט דק מתיחה היא שיטה פשוטה, נפוצה ומקובלת המשמש ליצירת מגוון צורות מגוונות של חלקיקים14. בעקבות סינתזה, חלקיקים הם הטלת לסרטים, נמתח בממדים אחד או שניים בטמפרטורה מעל טמפרטורת המעבר זכוכית של החומר חלקיקים. הסרט ואז התפרקה כדי לאחזר את החלקיקים. למרות גוברת ההתעניינות חלקיקים אנאיזוטרופי, לגישות עבור aAPC מבוסס חלקיק שמפברק מוגבלים בעיקר למערכות איזוטרופיות, שיטות של שינוי צורה חלקיק יכול להיות קשה ליישום, תואם מסוימים סינתזה aAPC אסטרטגיות, חוסר דיוק, הפארמצבטית15. הטכניקה מתיחה שלנו סרט דק ניתן לבצע באופן ידני או באופן אוטומטי ליצירת חלקיקים אניסוטרופי מסונתז ממגוון רחב של פולימרים מתכלים במהירות, נמתח יחס רוחב-גובה הרצויה ממדים של אחד או שניים-15.
בהתבסס על העבודות הקודמות שלנו, פיתחנו בגישה מבוסס חלקיק חומר מתכלה בשילוב עם טכנולוגיה מדרגיים של מתיחה סרט דק כדי ליצור במהירות aAPC עם tunable גודל וצורה בצורה סטנדרטית עבור תא T הרחבה שמחוץ או ויוו. האסטרטגיה שלנו ההטיה חלבון יכול לשמש זוג protein(s) בכל עניין לקבוצות carboxyl על פני השטח של חלקיקים-צפיפות הרצוי, נותן את המערכת aAPC רמה גבוהה של גמישות. אנו מתארים גם שיטות כדי לאפיין את גודל, מורפולוגיה, ואת התוכן של aAPC הדם, וכן להעריך את הפונקציונליות במבחנה. פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות להרחיב תאים חיסוניים שמחוץ או ויוו למגוון רחב של יישומים immunotherapeutic.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) מאוניברסיטת ג'ונס הופקינס.
1. ייצור של כדוריות PLGA חלקיקים בגודל Tunable
- הכנה של חומרים עבור חלקיקים סינתזה
- להכין תמיסת כוהל פוליוויניל w/w (PVA) 5%.
- להוסיף 500 מ"ל מים (DI) יונים הבקבוק Erlenmeyer עם פס מגנטי מערבבים ומניחים על פלטה קדירות בטמפרטורת 500 סל ד וצג עם מד חום. מכסים את הבקבוק עם נייר כסף כדי למנוע התאיידות.
- כאשר טמפרטורת המים מגיע כ 70 מעלות צלזיוס, להוסיף 25 גרם סך-PVA בקבוצות קטנות לאורך זמן, מחכה PVA להתמוסס לפני הוספת יותר.
- ברגע PVA כל התפרקה (בדרך כלל 30-60 דקות), לתת פתרון סינון מגניב וסטרילי. לאחסן ב 4 ° C לשימוש עתידי.
- להכין סרט פתרון הליהוק של 10% w/w PVA גליצרול w/w 2%.
- להוסיף 500 מ"ל מים DI הבקבוק Erlenmeyer עם פס מגנטי מערבבים. הוסף 8 מ של גליצרול בטמפרטורת החדר, מיקס על ידי trituration.
- מניחים את הבקבוק על פלטה קדירות בטמפרטורת 500 סל ד וצג עם מד חום. מכסים את הבקבוק עם נייר כסף כדי למנוע התאיידות.
- פתרון הטמפרטורה מגיעה כ 70 מעלות צלזיוס, להוסיף 50 גר' סך-PVA בקבוצות קטנות לאורך זמן, מחכה PVA להתמוסס לפני הוספת יותר.
- לאחר כל PVA התפרקה (בדרך כלל 60 דקות), לתת פתרון סטרילי וקריר מסנן באמצעות מערכת מסנן ואקום בקבוק-העליון עם גודל הנקבוביות של 0.22 μm. לאחסן בטמפרטורת החדר לשימוש עתידי.
- להכין פתרון PVA 50 מ ל w/w 1%. להוסיף 40 מ"ל של מים DI ו- 10 מ"ל של 5% PVA פתרון (בוצעו ב 1.1.1) גביע 100-150 מ.
- להכין פתרון PVA w/w 0.5% 100 מ. להוסיף 90 מ של מים DI ו- 10 מ"ל של 5% PVA פתרון גביע 150-250 מ.
- להוסיף פס מגנטי מערבבים הפתרון PVA 0.5% והמקום בשכונה כימי על צלחת מערבבים בטמפרטורת החדר 500 סל ד.
- להכין תמיסת כוהל פוליוויניל w/w (PVA) 5%.
- סינתזה Microparticle
- שוקלים לצאת 100 מ ג של פולי (חומצה לקטית-co-גליקולית) (PLGA) לתוך המבחנה נצנוץ התמוססות ב 5 מ של דיכלורומתאן (DCM). מערבולת כדי להמיס את PLGA.
- המקום מהמגן בפתרון PVA 1% 50 מ ל, כך מהמגן הוא קרוב לתחתית כשהספל ככל האפשר מבלי לגעת בו. הפעל מהמגן ולהתאים את המהירות הרצויה — 3,200 סל ד עבור 5 μm קוטר חלקיקים, 5,000 סל ד עבור μm 3, במהירות של 15,000 סל ד עבור μm 1 (הגדלת גודל החלקיקים של ירידות מהירות המגון). פעם אחת על המהירות הרצויה, להוסיף את הפתרון PLGA הספל, homogenize במשך דקה אחת.
- לאחר המגון, יוצקים 1% PVA, PLGA microparticle פתרון בתוך 0.5% 100 מ ל תמיסת PVA על צלחת מערבבים ומערבבים במשך לפחות 4 שעות אידוי הממס בשכונה כימי.
- לשטוף את החלקיקים 3 פעמים במים DI.
- שופכים את הפתרון של חלקיקים לתוך צינורות חרוט 50 מ ל, צנטריפוגה ב 3000 x g למשך 5 דקות. שופכים תגובת שיקוע והוסף כ 20 מ ל מים DI.
- Resuspend חלקיקים על-ידי vortexing. ברגע resuspended, למלא צינורות חרוט 50 מ ל מים DI.
- לשטוף שוב באותה הדרך עוד פעמיים.
- ננו-חלקיק סינתזה
- שוקלים לצאת 200 מ ג של PLGA לתוך בקבוקון נצנוץ, להמיס 5 מיליליטר DCM. מערבולת כדי להמיס את PLGA.
- המקום גביע עם 50 מ ל 1% פתרון PVA לתוך מיכל מלא קרח. מניחים את המכשיר sonicator במיכל קרוב לתחתית ככל האפשר מבלי לגעת. להתחיל sonication ולהוסיף מיד PLGA פתרון לתוך הספל. Sonicate עם כוח של 12 W 2 דקות ליצור חלקיקים עם הקוטר המשוער של 200 ננומטר.
- לאחר sonication, יוצקים 1% PVA, PLGA פתרון nanoparticle לתוך פתרון PVA 0.5% 100 מ ב מערבבים בצלחת ומערבבים במשך לפחות 4 שעות אידוי הממס בשכונה כימי.
- שופכים את הפתרון של חלקיקים לתוך צינורות חרוט 50 מ ל, צנטריפוגה ב 3000 g x 5 דקות להסיר את microparticles. להסיר את תגובת שיקוע ויוצקים לתוך צינורות צנטריפוגה במהירות גבוהה.
- לשטוף את החלקיקים 3 פעמים עם מים DI. צנטריפוגה ב 40,000 x g במשך 15 דקות. שופכים תגובת שיקוע, resuspend במים DI על-ידי vortexing. לשטוף שוב באותה הדרך עוד פעמיים.
2. ייצור של חלקיקים פולימרים של צורה Tunable
- לאחר נטילת PLGA חלקיקים שלוש פעמים, resuspend החלקיקים בכ-1 מ ל מים DI. להוסיף את הפתרון ליהוק הסרט חלקיקים לריכוז החלקיקים הסופי של חלקיקים 2.5 מ"ג/מ"ל.
- Pipette התליה של חלקיקים ב 10 מ"ל aliquots 75 x 50 מ מ מלבני פטרי למתיחת חד-ממדי או aliquots 15 mL 100 100x מ מ מרובע פטרי למתיחת דו-ממדית. להסיר בועות על ידי או פיפטה, או בועות לדחוף הצידה ולתת סרטים לילה יבש בשכונה כימי.
- פעם סרטים התייבשו, להוריד סרטים ממנות פלסטיק עם פינצטה, לחתוך את הקצוות של סרטים עם מספריים. שמור קצוות צינור חרוטי 50 מ ל כדי לשמש חלקיקי כדורית.
- לטעון סרט על גבי הסרט דק אוטומטיות מתיחה התקן על-ידי טעינת סרט על גבי אלומיניום. עבור 1 י מתיחה, הר הסרט על גבי אלומיניום בלוקים של ציר אחד של האלונקה (איור 2) על ידי הצבת שני הקצוות קצר של הסרט בין שני חלקי גומי נאופרן. באמצעות ברגים, בורג אוחז מתכת על גבי גומי כדי להחזיק את הסרט במקום. עבור מתיחה 2D, הר לכל ארבעה קצוות על גבי ארבעה רחובות אלומיניום למתוח על שני הצירים (איור 2).
- למדוד ולהקליט את אורך הסרט בין אלומיניום בלוקים על ציר אחד למתיחת 1 D או שני הצירים למתיחת 2D. לחשב את המרחק נדרש למתוח את הסרט באחד או בשני כיוונים בהתבסס על הרצוי קיפול-מתיחה.
- למקם את המכשיר מתיחה הסרט נטען בתנור ב 90 מעלות צלזיוס ולהביא את הסרט טמפרטורה מעל 10 דקות. מניחים גביע גדול בתנור עם כמות קטנה של מים.
- הסרט למתוח.
- כאשר מתיחה הושלם, להסיר את ההתקן מתיחה מהתנור ומצננים את הסרט לטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.
- עבור 1 י מתיחה, חותכים את הסרט שליפת מתיחה בקצוות. עבור מתיחה 2D, חתך למרכז ריבוע של הסרט בצורה אחידה נמתחת ושמור על שני הצירים. במקום סרטים צינורות חרוט עם סרטים 2 למחזור ולהשליך את השאר של הסרט.
- להוסיף כ- 25 מ ל מים DI כל צינור חרוטי ו מערבולת עד הסרטים הם התפרקה.
- ברגע הסרטים הם חלקיקי המומס, תשטוף 3 פעמים עם מים DI.
- עבור microparticles, למלא את צינורות חרוט 50 מ ל, צנטריפוגה ב 3000 x g למשך 5 דקות, שופכים תגובת שיקוע, להוסיף כ 20 מ של מים DI ו מערבולת כדי resuspend חלקיקים.
- עבור חלקיקים, העברת חלקיקים מהירות גבוהה צנטריפוגה צינורות, צנטריפוגה ב g 40,000 x ל-15 דקות שופכים תגובת שיקוע, להוסיף כ 20 מ של מים DI ו מערבולת כדי resuspend חלקיקים.
- לאחר לשטוף את השלישי, resuspend חלקיקים בכ-1 מ ל מים DI. להקליט את המשקל של הצינורית microcentrifuge ולהוסיף חלקיקים ברכבת התחתית. להקפיא חלקיקים במקפיא-80 מעלות צלזיוס במשך שעה או להקפיא פלאש בחנקן נוזלי. ברגע קפוא, lyophilize חלקיקים בן לילה.
- לאחר lyophilized, שוקל חלקיקים בצינור microcentrifuge ואת הפחת משקל מוקלטות של הצינור ריק כדי לקבוע את המשקל של חלקיקים lyophilized.
3. הדם ההטיה כדי ליצור מלאכותי אנטיגן הצגת תאים
- להכין 2-(N-מורפולינו) ethanesulfonic חומצה (MES) מאגר. להפוך את פתרון 0.1 M של MES במים ולהתאים את ה-pH עד 6.0 באמצעות טיטור עם 1 מ' הידרוקסיד הנתרן (NaOH).
- Resuspend lyophilized PLGA/PBAE מיקרו/חלקיקים ב 20 μg/mL במאגר MES על-ידי vortexing. למלא את צינור פוליפרופילן microcentrifuge μL 900 MES המאגר ולהוסיף μL 100 של הפתרון של חלקיקים ברכבת התחתית.
- להכין פתרון EDC/NHS. להמיס carbodiimide 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) 40 מ"ג (EDC) ו- 48 מ"ג N-hydroxysulfoxuccinimide (NHS) במאגר MES 1 מ"ל.
- להוסיף 100 μL EDC/NHS פתרון החלקיקים ואת מערבולת לערבב.
- דגירה הצינור על מהפך בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.
- ספין למטה microparticles ב 5,000 x g עבור 5 דקות או חלקיקים ב 17,000 x g למשך 5 דקות. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend ב 1 מ"ל PBS על-ידי vortexing (microparticles) או sonicating ב 2-3 W במשך 5 שניות (חלקיקים).
- עבור microparticles, להוסיף 8 μg של החלבון הרצויה אות 1, ועכבר 10 μg אנטי-CD28 (שיבוט 37.51) החלקיקים. חלקיקים, להוסיף 16 μg אות 1 ו- 20 μg אנטי עכבר CD28. הוסף PBS להביא את עוצמת הקול בצינור 1.1 מ.
- דגירה הצינור על מהפך ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- למחרת, לשטוף את החלקיקים. ספין למטה microparticles ב 5,000 x g עבור 5 דקות או חלקיקים ב 17,000 x g למשך 5 דקות. למחוק את תגובת שיקוע ולאחר resuspend חלקיקים ב 1 מ"ל של PBS סטרילי על-ידי vortexing (microparticles) או sonication ב 2-3 W במשך 5 שניות (חלקיקים). חזור על פעמיים.
- Resuspend החלקיקים על הריכוז הרצויה ביותר במדיום תרבות לשימוש מיידי. לאחסון לטווח ארוך, resuspend חלקיקים-10 מ"ג/מ"ל תמיסת סוכרוז 100 מ מ. להקפיא, lyophilize ואחסן את החלקיקים ב-80 מעלות צלזיוס.
4. אפיון והערכת aAPC
- אפיון aAPC גודל וצורה (איור 3)
- לאפיין בצורה ובגודל microparticle על ידי חלקיקים הדמיה באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים סריקה (SEM). עבור SEM הדמיה, התפשטות חלקיקים lyophilized על גבי קלטת פחמן דבקה אלומיניום להוסיף, להתיז בחוטי זהב-פלדיום.
- לנתח את הגודל ויחס גובה-רוחב של חלקיקים באמצעות תוכנת ניתוח התמונה.
- כדי לקבוע את גודל החלקיקים, להגדיר באמצעות סרגל קנה מידה ומדידת קוטר של חלקיקים. חזור על-100 חלקיקי לקבוע את הקוטר החלקיקים הממוצע ולהפיק היסטוגרמה של גודל החלקיקים.
- כדי לקבוע יחס גובה-רוחב, למדוד את המרחק על פני ציר זמן, הציר הקצר של חלקיקים ולחלק ציר זמן קצר הציר. חזור על-50 חלקיקים של כל צורה כדי לקבוע יחס הגובה-רוחב החלקיקים הממוצע עבור כל צורה ולהפיק היסטוגרמות.
- לאפיין בצורה ובגודל ננו-חלקיק על ידי הדמיה חלקיקים באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים הילוכים (TEM). לנתח את הגודל ויחס גובה-רוחב של חלקיקים באמצעות תוכנת ניתוח תמונה כפי שמתואר 5.1.2. לחלופין, למדוד גודל כדורית nanoparticle באמצעות פיזור אור דינאמי (DLS) או nanoparticle מעקב ניתוח (נ).
- יעילות ההטיה חלבון
- להכין aAPC על פי שיטות 1-3, אבל ב- 3.7 צעד להשתמש fluorescently שכותרתו אות 1 חלבון ו- CD28 אנטי עכבר. לאחר ההטיה, כביסה, resuspend את aAPC ב 1 מ"ל PBS עבור ריכוז סופי של 2 מ"ג/מ"ל aAPC.
- הכנת סטנדרטים חלבון microplate 96-ובכן פוליסטירן שחור. להוסיף 5 μg של האות fluorescently שכותרתו 1 חלבון PBS בהבאר הראשונה של הצלחת ולעשות 10 דילולים 1:2 ב- PBS לרוחב השורה של הצלחת. להשאיר ריק טוב אתמול. חזור על שלב זה כדי ליצור קבוצה נוספת של סטנדרטים עם אנטי fluorescently שכותרתו-CD28.
- פיפטה μL 100 של הפתרון aAPC לתוך בארות שכפל microplate פוליסטירן שחור דולר.
- קרא את זריחה על קורא צלחת פלורסצנטיות באורכי המתאים. להשתמש את קריאות קרינה פלואורסצנטית מכל הסטנדרטים חלבון כדי ליצור עקומות סטנדרטי עבור כל נוגדן פלורסנט. באמצעות עקומת סטנדרטי, לחשב את ריכוזי אות 1 אנטי-CD28 היטב כל דגימה, ואז לחשב את כמות הדם ויעילות ההטיה (איור 4A, 5A איור).
- הערכה של aAPC לגירוי במבחנה של CD8 + T תאים
- להכין המדיה ב' (בינוני RPMI בתוספת L גלוטמין, 10% FBS, פתרון חומצת אמינו שאינן הכרחיות 1%, 1% נתרן פירובט, 1% פתרון MEM ויטמין, 92 μM β-mercaptoethanol, 10 ננוגרם למ"ל ציפרופלוקסאצין ו 30 U/mL il-2.
- אקריב עכבר שחור 6 בעזרת חשיפה פחמן דו-חמצני.
- הקציר הטחול מהעכבר לפי פרוטוקול שנקבעו קודם16. לאסוף את הטחול צינור חרוטי 50 מ עם 10 - 15 מ"ל PBS. באמצעות כבעלי, מועכים הטחול דרך מסננת תא מיקרומטר 70 לתוך צינור חרוטי 50 מ. במהלך רסוק, לשטוף את מסננת עם 40 מ"ל PBS.
- לסובב את splenocytes ב 300 x g למשך 5 דקות. יוצקים את תגובת שיקוע, resuspend את splenocytes ב 4 מיליליטר Ack Lysing מאגר כדי lyse כדוריות דם אדומות. לאפשר את הצינור לשבת ללא הפרעה במשך דקה אחת, ולאחר מכן להוסיף PBS להביא את עוצמת הקול בצינור 20 מ.
- לסובב את התאים ב 300 x g למשך 5 דקות. יוצקים את תגובת שיקוע, resuspend תאי 1 מ"ל ל- PBS. לספור את התאים באמצעות hemocytometer.
- לסובב את התאים ב 300 x g למשך 5 דקות, resuspend באמצעי האחסון הרצוי תא ההפרדה המאגר. בידוד תאי CD8 + T מן התליה תא בודד באמצעות CD8 + שלילי מבחר תא T בידוד ערכת, ע פ הפרוטוקול של היצרן.
- בעקבות הפרדה מגנטית, ספין תאי CD8 + T-g 300 x במשך חמש דקות ולהסיר את המאגר ההפרדה תא. Resuspend תאים 1 מ"ל של PBS ולספור את התאים. תווית תאים עם אסתר succinyl carboxyfluorescein (CFSE) על פי הפרוטוקול של היצרן.
- דגירה 8,333 CD8 + T תאים, 0.0833 mg (או במינון הרצוי) של aAPC בתקשורת ב' μL 150 היטב כל של 96 ובכן U-תרביות רקמה שטופלו הצלחת התחתונה.
- דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 7 ימים. לאחר 3-4 ימים, רענן המדיום תרבות על-ידי הוספת 75 μL בינוני טריים מכל קידוח.
- לאחר 3 ימי דגירה, לנתח CFSE מתויג לתאים cytometer זרימה כדי להעריך את התפשטות. כל שיא על ההיסטוגרמה CFSE cytometry זרימה מייצג דור של תאים עקב דילול CFSE עם כל חלוקת התא רצופים.
- לאחר 7 ימים, להשתמש hemocytometer כדי לספור את מספר התאים היטב בכל. לפני ספירה, כתם תאים מתים עם פתרון Trypan Blue. אל תכלול תאים מתים ספירת הסופי. לנרמל את הריכוז הסופי תא לריכוז הראשונית כדי לחשב את הקיפול-הרחבת (איור 4 , איור 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מפרטים טכניים עבור הסרט דק אוטומטית 2D מתיחה התקן ניתנת באיור1. מפרטים טכניים ותיאור עבור סרט דק 1 י מתיחות התקן ניתנת et al. הו17 האלונקה נבנית חלקי אלומיניום באמצעות טכניקות לכרסום וחריטה סטנדרטי. בדומה האלונקה 1 י, האלונקה 2D מורכב אוחז מתכת ומעקות מדריך. ברגים עופרת דו-כיווני משמשים כדי לתרגם ליניארי לתנועה סיבובית. הברגים עופרת הם המצורפת באמצעות הברזים מכני זהים stepper מוטורס עם מומנט מספיק. יהיה מולחם החוטים השליטה המוטורית stepper 8 על 8 פינים עמידים בחום amphenol מחברים עבור חיבור פשוט במסוף הבקרה בתוך תנור למתיחת סרט דק. חוט מצופה טפלון (PTFE) של אורך מספיק יש להשתמש כדי להתחבר stepper מוטורס את מנהלי ההתקנים במסוף הבקרה. ערכת שליטה במחשב המומלץ הוא נתון איור 1A. שני מנועים עליך להיות מחובר באמצעות חיווט עמידים בחום 2 נהגים עצמאיים. שני מנהלי ההתקן חייב להיות מחובר ואז מיקרו-בקר ממשק עם מחשב. הנהגים אמור להיות מחובר בציר ה-x והתפוקות של ציר ה-y על מיקרו-בקר. הנהגים וגם מיקרו דורשים של ספק כוח חיצוני. לפני חיבור ספק הכוח שלושה מרכיבים אלה מומלץ נתיך A 4 שיוכנס בין כל אחד מהחיבורים מופעל כדי להגן על הרכיבים מפני עומס יתר הנוכחי. לבסוף, מיקרו יכולים להיות מקושרים באמצעות קלט יציאה מקבילית למחשב באמצעות. זכרים DB25 כבל זכר. האלקטרוניקה משמש לשליטה של stepper מוטורס רגישים לחום, ולכן יש להציב מחוץ מכל מקור חום (כגון תנור) משמש במהלך מבצע לחימום הסרטים דק לטמפרטורת מספיק כדי לאפשר מתיחה. למרות לרוורס המומלצת חום עמיד עד הטמפרטורות שצוין בפרוטוקול זה למתיחת חלקיקים, מוטורס ומנהלי התקנים תבנה החימום נוספים כאשר הם מחוברים למקור הכוח הראשי. לכן, מומלץ כי המכשיר רק להיות מופעל במהלך התקופה של הסרט בפועל מתיחות כדי למזער את פוטנציאל חימום יתר.
ננו PLGA - ו microparticles היו מסונתז תוך שימוש בטכניקות אמולסיה יחיד שמתואר פרוטוקול זה, עם תמונה באמצעות TEM (איור 3 א) ו- SEM (איור 3B), בהתאמה. חלקיקים כדוריים היה בקוטר של 237.3 ננומטר ± 4.0 כפי שנמדד על-ידי DLS 224 nm כפי שהיא נמדדת נ (איור 3C). Microparticles היו מסונתז על ידי המגון-5000 סל ד כדי לייצר חלקיקי כדורית בקוטר ממוצע של ± 1 3 μm (דמות תלת-ממד). החלקיקים המתוחים באמצעות הסרט האוטומטי מתיחה המכשיר ב 90 מעלות צלזיוס במימד אחד להפקת ננו אליפסואידי prolate - ו microparticles ומתח ב 70 ° C בשני מימדים כדי ליצור חלקיקים אליפסואידי גולגלת. יחס הגובה-רוחב של microparticles של כל שלושת הצורות נותחו על ידי מדידה של ציר זמן ומרחק קצר ציר של חלקיקים חלוקת שני. כדורי microparticles היה יחס גובה-רוחב של 1.05 ± 0.04, בעוד 1 י נמתח prolate חלקיקים אליפסואידי היה יחס גובה-רוחב גדול יותר של 3.6 ± 0.8 (איור 3E). 2D נמתח חלקיקים אליפסואידי גולגלת היה יחס גובה-רוחב של 1.2 ± 0.2, בערך שמירה על יחס גובה-רוחב של אחד.
כימיה התגובה EDC/NHS שימשה נזווג שכותרתה fluorescently טעון-פפטיד MHC IgG דיימר ו- anti-CD28 נוגדן השטח של חלקיקים PLGA נמתח, כדורית. תוצאות יעילות ההטיה להדגים דומה בכמות החלבון על פני השטח של כדורית, אליפסואידי מיקרו-aAPC (איור 4A) ו ננו-aAPC (איור 5A) ומדגימים כי חלבון צימוד במהלך סינתזה aAPC מתרחשת באופן תלוי-ריכוז. כדי להעריך את ההשפעה של צורה על פונקציונליות aAPC, aAPC אליפסואידי כדורית, prolate מצומדת עם דימר MHC IgG נטען gp100, אנטי-CD28 שימשו כדי לגרות את תאי CD8 + T הטרנסגניים PMEL. תאי T היו בלוחיות הסבר CFSE, מוערך על ידי cytometry זרימה לאחר 3 ימים כדי להעריך את התפשטות (איור 4B, 5B). Prolate aAPC אליפסואידי נמצאו לזירוז רמות גבוהות יותר של התפשטות תאים T במינון תת קולח מאשר aAPC כדורית, עם הפירוד הטוב ביותר מושגת במינון 0.01 מ"ג. לאחר 7 ימים, תאי T נספרו באופן ידני. Prolate aAPC אליפסואידי ביעילות רבה יותר מגורה בתאי T לעומת עמיתיהם הכדורית שלהם microscale (איור 4C), ננו (איור 5C), נצפתה הרחבה תא T תלוי במינון.
איור 1: ייצוג סכמטי של סרט דק אוטומטיות אלונקה. (א) תיאור סכמטי של מסוף הבקרה עבור סרט דק אלונקה. (ב) תיאור סכמטי של החומרה מכני על האלונקה סרט דק. (משמאל) מבט עילי על החומרה מכני. (מימין) חתך רוחב של מרתק מנגנון סרטים רזה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: צילומים של סרט דק שהורכב אוטומטיות האלונקה למתוח חלקיקים פולימרים לצורות אנאיזוטרופי. הסרט דק 2D מתיחה המכשיר מורכב של שני צירים עם טעינות אלומיניום כי אחיזתו הסרט. הצירים מכילים עופרת ברגים בכיוונים מנוגדים כך שהם יזוזו אחד מהשני. כדי להפוך לאוטומטי את ההליך מתיחה, מחובר מיקרו USB מקושרים שני מנהלי מנועים stepper ממסר אותות אל unipolar stepper מוטורס דרך כבל תרמי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: ניתוח יחס גובה-רוחב וגודל כדורית, אליפסואידי חלקיקים PLGA. (א) TEM, SEM (ב) תמונות של כדורית, 1 י נמתח prolate אליפסואידי ולאחר 2D נמתח גולגלת אליפסואידי PLGA (א) חלקיקים ו- microparticles (B). חלקיקי כדורית (ג) היו בגודל מאת נ ונחוש להיות 224 nm בקוטר. תמונות SEM של PLGA microparticles נותחו (D) התפלגות גודל חלקיקי כדורית, יחסי גודל (E) של כל הצורות של חלקיקים. (ג) לשכפל ומותאמות עם רשות מן קטן13, 2015 ווילי-VCH זכויות יוצרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: אפיון והערכה תפקודית של כדורית, prolate אליפסואידי מיקרו-aAPC. (א) ההטיה יעילות מתויג fluorescently טעון-פפטיד MHC IgG דיימר ו- anti-CD28 נוגדנים על פני השטח של microparticles אליפסואידי כדורית, prolate. (ב) CD8 + T תאים בלוחיות הסבר CFSE, מודגרות עם מיקרו כדוריות ומתח על-ידי 1 י-aAPC מינון 0.01, 0.1 ו- 1 מ ג, או פקדים שאינם cognate. לאחר 3 ימים, התאים הוערכו על ידי cytometry זרימה כדי להעריך את התפשטות. (ג) T תאים הוערכו גם לאחר 7 ימים על ידי ספירת ידנית. תא ספירת היו מנורמל כדי הספירה ההתחלתית לחישוב קיפול-הרחבה. לשם השוואה בין קיפול אליפסואידי שונות prolate הרחבה, * = p < 0.05, * * = p < 0.01, ו * * * = 0.001 < p . קווי שגיאה מייצגים שגיאת התקן של הממוצע (SEM) עבור משכפל 3. שועתק ומותאמות עם רשות מן Biomaterials12, זכויות יוצרים Elsevier 2014. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: אפיון והערכה תפקודית של כדורית, prolate אליפסואידי ננו-aAPC. (א) ההטיה יעילות מתויג fluorescently טעון-פפטיד MHC IgG דיימר ו- anti-CD28 נוגדנים על פני השטח של חלקיקים אליפסואידי כדורית, prolate. (ב) CD8 + T תאים בלוחיות הסבר CFSE, מודגרות עם כדורית, prolate אליפסואידי ננו-aAPC של קיפול שונות-מתיחה במינונים 0.01, 0.1 ו- 1 מ ג. לאחר 3 ימים, התאים הוערכו על ידי cytometry זרימה כדי להעריך את התפשטות. (ג) T תאים מודגרות עם חלקיקי אליפסואידי prolate שונות רצועת הקיפול (הנע בין 1.5 ל 3.5) הוערכו גם לאחר 7 ימים על ידי ספירת ידנית. תא ספירת היו מנורמל ל תנאי שאינו מטופל כדי לחשב קיפול-הרחבה. * = p < 0.05, * * = p < 0.01, ו * * * = p < 0.001 בהשוואה כדורית. קווי שגיאה מייצגים שגיאת התקן של הממוצע (SEM) עבור משכפל 3. שועתק ומותאמות עם רשות מן קטן13, 2015 ווילי-VCH זכויות יוצרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מפרט שיטה רב-תכליתי לדור מדויק של חלקיקים פולימרים אנאיזוטרופי. הסרט דק מותח בטכניקה המתוארת כאן היא מדרגית, לשחזור וזולה מאוד. טכניקות חלופיות ליצירת חלקיקים אניסוטרופי סובלים מגבלות רבות, כולל עלות גבוהה, תפוקה נמוכה, גודל החלקיקים מוגבלת. הסרט דק מותח הגישה גם יתרון כי החלקיקים משתנים כדי להתאים אניסוטרופי לאחר הסינתזה, כתוצאה מכך, הוא תואם עם מגוון רחב של גודל החלקיקים וטכניקות סינתזה. איור 1 מפרט את ההתקנה של המכשיר מתיחה אוטומטית דו מימדי. מכשיר זה יכול לשמש גם ללא הרכיבים האלקטרוניים על-ידי הפעלת באופן ידני את הברגים עד הסרט הגיע מידת הרצוי מתיחה. עם זאת, מצאנו כי תהליך אוטומטי היא עקבית ומהירה הרבה יותר מאשר ידני15. טכניקות שונות פותחו לסנתז חלקיקים אנאיזוטרופי, כגון microfluidic גישות17,18,19, שכבה אחרי שכבה ציפוי21גישות אחרות מלמטה למעלה סינתזה21 ,22. עם זאת, גישות אלה תאפשר שליטה חזקה על הגיאומטריה של חלקיק ואינם רב תכליתית במובן של צורות יכולה להפיק וחומרים החלקיקים שניתן להשתמש בהם. שיטה מלמעלה פופולרי בדיית חלקיקים nonspherical הוא חלקיק שכפול Non-הרטבה תבניות (הדפס)24. למרות הדפסה מאפשר שליטה מדויקת של חלקיקים צורה, הוא דורש מכונות יקר, הוא לא נגיש, פשוט ליישם כמו הסרט דק מותח בשיטה.
הטכניקה אמולסיה יחיד יכול לשמש כדי לבדות PLGA חלקיקים בגדלים שונים, החל nano12,microscale13. מאת משתנות המגון מהירות או sonication משרעת, microparticle וגודל ננו-חלקיק, בהתאמה, יכול להיות מאופנן. ברגע שהיא נוצרה חלקיקי כדורית, הסרט דק מותח בשיטה המתוארת כאן יכול לשמש כדי לעוות את החלקיקים לתוך צורות שונות15. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים את הדור של חלקיקים אליפסואידי prolate, גולגלת על ידי מתיחת אחד או שני ממדים, בהתאמה. חלקיקי כדורית מושלך אל הסרט פלסטיק דק, אשר מחומם מעל טמפרטורת המעבר זכוכית PLGA, נמתח בממדים אחד או שניים כדי לעוות את החלקיקים. יחס הגובה-רוחב של החלקיקים היא מאוד לשליטה. על-ידי כוונון מידת המתיחה הסרט, יכול להיות מאופנן יחס הגובה-רוחב של החלקיקים, מצאנו שאת יחס הגובה-רוחב של חלקיקים נמדד מאוד הוא מתואם עם12,הערך החזוי13. ניתן להפיק מגוון צורות אחרות על-ידי שינוי הטמפרטורה בזמן מתיחות או מידת מתיחה. לדוגמה, biconcave חלקיקים discoidal דמוי צורת תאי הדם האדומים יכול להיווצר על ידי מתיחת microparticles 1.5-fold בתוך שתי מידות ב- 90 ° C. 15. סרט זה מתיחה טכניקה שימש גם להפוך את חלקיקי כדורית פוליסטירן צורות אניסוטרופי רבות, כולל תולעים, חביות של דיסקים מלבני21. הסרט מותח המכשיר יכול לשמש על ידי שליטה ידנית את הברגים או המכשיר יכול להיות אוטומטי כמוצג באיור 1 לבצע התהליך יותר יעילה ועקבית15. טכניקה זו פשוטה אמינה מייצרת חלקיקים אניסוטרופי לשמור על צורתם תחת תנאים הפיזיולוגיות24. יתר על כן, שיטה זו הוחלה על חומרים פולימריים אחרים, בנוסף ל PLGA, כגון polycaprolactone (PCL) ועשה היברידית חלקיקים של PLGA, פוליפוני (בטא-אמינו אסתר) (PBAE).
בנוסף, פרוטוקול זה מתאר איך PLGA חלקיקי בצורה ובגודל מגוונת יכול להיות מצומדת עם החלבונים השטח הנדרש להפעלת תא CD8 + T לשמש aAPC. חלבונים ניתן covalently מצומדת אניסוטרופי ו כדורית PLGA מיקרו - חלקיקים זיווגו EDC/NHS מתווכת של ראשי אמינים על חלבונים לקבוצות carboxyl על פני השטח של חלקיקים. היעילות של חלבון ההטיה נמדד על ידי צימוד חלבון fluorescently שכותרתו השטח של חלקיקים כפי שמתואר פרוטוקול זה, מצאנו כי טכניקה זו זוגות חלבון חלקיקי ב 15-20% יעילות12, 13. מיקרו אליפסואידי prolate - ו nanoparticle aAPC יעילים יותר מאשר עמיתיהם הכדורית שלהם להפעלת CD8 + T תאים התפשטות והתרחבות במבחנה12,13. AAPC אליפסואידי פופולארים מחייב ואינטראקציה עם תאי T עקב שלהם שטח פנים גדול יותר קשר12. חלקיקים אניסוטרופי יש גם מאפיינים מעולה על חלקיקי כדורית ויוו עקב שלהם biodistribution משופרת והתנגדות phagocytosis13. פלטפורמה זו היא מודולרית מאוד ויש לו פוטנציאל להיות מותאם ויישומים רבים אחרים סמים משלוח. באמצעות הליך זה, ניתן להפיק חלקיקים פולימרים של גודל וצורה tunable, השטח חלקיק יכול להיות מצומדת עם חלבון בכל עניין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
EBA (DGE-1746891), KRR (DGE-1232825) תודה התוכנית NSF מלגת מחקר לתארים מתקדמים לקבלת תמיכה. רם תודה את נבחרת מחקר שירות פרס NIH NCI F31 (F31CA214147), הגמול הישג עבור מכללת אחווה מדענים לקבלת תמיכה. המחברים תודה NIH (R01EB016721 ו- R01CA195503), מחקר כדי למנוע עיוורון ג'יימס ופרס קרול חינם זרז, ו מכון בלומברג-קימל JHU על חיסוני סרטן לקבלת תמיכה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly(vinyl alcohol), MW 25000, 88% hydrolyzed | Polysciences, Inc. | 02975-500 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Digital Thermometer | Fluke | N/A | Model name: Fluke 52 II |
| Immersion Temperature Probe | Fluke | N/A | Model name: Fluke 80PK 22 |
| Digital Hotplate & Stirrer | Benchmark Scientific | H3760-HS | |
| Multipoint stirrer | Thermo Fisher Scientific | 50093538 | |
| Resomer RG 504 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide) | Sigma-Aldrich | 719900 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | D65100 | |
| Homogenizer | IKA | 0003725001 | |
| Sonicator | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Model number: VC 505 |
| Sonicator sound abating enclosure | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0427 |
| Sonicator probe | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0220 |
| Sonicator microtip | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0423 |
| High speed centrifuge | Beckman Coulter | N/A | Model number: J-20XP (discontinued), alternative model: J-26XP |
| High speed centrifuge rotor | Beckman Coulter | 369691 | Model number: JA-17 |
| High speed polycarbonate centrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific | 3118-0050 | 50 mL, screw cap |
| Rectangular disposable petri dish | VWR International | 25384-322 | 75 x 50 x 10 mm |
| Square disposable petri dish | VWR International | 10799-140 | 100 mm x 100 mm |
| LEAF Purified anti-mouse CD3ε Antibody | Biolegend | 100314 | |
| InVivoMab anti-mouse CD28, clone 37.51 | Bio X Cell | BE0015-1 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | E6383 | |
| N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt | Sigma-Aldrich | 56485 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100212 | |
| APC anti-mouse CD28 Antibody | Biolegend | 102109 | |
| Corning 96 Well Solid Polystyrene Microplate | Sigma-Aldrich | CLS3915 | flat bottom, black polystyrene |
| Protein LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431081 | |
| RPMI 1640 Medium (+ L-Glutamine) | ThermoFisher Scientific | 11875093 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | Heat Inactivated, sterile-filtered |
| Ciprofloxacin | Sigma-Aldrich | 17850 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Recombinant Human IL-2 (carrier-free) | Biolegend | 589102 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| MEM Vitamin Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11120052 | |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyi Biotech | 130-104-075 | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFisher Scientific | C34554 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| MACS Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Flow Cytometer | Accuri C6 | ||
| Synergy 2 Multi-Detection Microplate Reader | BioTek | ||
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi BIotech | 130-091-221 | |
| Cell Strainer | ThermoFisher Scientific | 22363548 | Sterile, 70 µm nylon mesh |
| ACK Lysing Buffer | ThermoFisher Scientific | A1049201 | |
| C57BL/6J (Black 6) Mouse | The Jackson Laboratory | 000664 | Male, at least 7 weeks old |
| U-Bottom Tissue Culture Plates | VWR | 353227 | Sterile, 96-well tissue culture treated polystyrene plates |
| 40 V DC Power Supply | Probotix | LPSK-4010 | |
| PTFE Coated Wire | Mouser | 602-5858-100-01 | This is for a 100 ft. spool but an equivalent wire will work |
| Stepper Motor Driver | Probotix | MondoStep5.6 | |
| IDC Connector Kit | Probotix | IDCM-10-12 | |
| Microcontroller | Probotix | PBX-RF | |
| 4A Fuses | Radio Shack | 2701026 | Equivalent fuses will work as well |
| DB25 Male to Male Cable | Probotix | DB25-6 | |
| USB-A to USB-B Cable | Staples | 2094915 | Equivalent cable will work as well |
| 8-Pin Amphenol Connectors Male and Female | Mouser | 654-97-3100A-20-7P and 654-97-3106A20-7S | |
| Stepper Motor | Probotix | HT23-420-8 | |
| Right Hand Lead Screw | Roton | 60722 | |
| Left Hand Lead Screw | Roton | 60723 | |
| Screws | McMaster Carr | 92196A151 | |
| Neoprene Rubber | McMaster Carr | 8698K51 | |
| Right Handed Flanged Lead Nut | Roton | 91962 | |
| Left Handed Flanged Lead Nut | Roton | 91963 | |
| Linux Control Computer | Probotix | LCNC-PC | Any computer with matching specification and Linux operating system will work |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma-Aldrich | CLS431097 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4 % | ThermoFisher Scientific | 15250061 |
References
- Eggermont, L. J., Paulis, L. E., Tel, J., Figdor, C. G. Towards efficient cancer immunotherapy: Advances in developing artificial antigen-presenting cells. Trends in Biotechnology. 32 (9), 456-465 (2014).
- Maus, M. V., Riley, J. L., Kwok, W. W., Nepom, G. T., June, C. H. HLA tetramer-based artificial antigen-presenting cells for stimulation of CD4+ T cells. Clinical Immunology. 106 (1), 16-22 (2003).
- Oelke, M., et al. Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells. Nature Medicine. 9 (5), 619-624 (2003).
- Rudolf, D., et al. Potent costimulation of human CD8 T cells by anti-4-1BB and anti-CD28 on synthetic artificial antigen presenting cells. Cancer Immunology, Immunotherapy. 57 (2), 175-183 (2008).
- Tham, E. L., Jensen, P. L., Mescher, M. F. Activation of antigen-specific T cells by artificial cell constructs having immobilized multimeric peptide-class I complexes and recombinant B7-Fc proteins. Journal of Immunological Methods. 249 (1-2), 111-119 (2001).
- Perica, K., et al. Magnetic field-induced T cell receptor clustering by nanoparticles enhances T cell activation and stimulates antitumor activity. ACS Nano. 8 (3), 2252-2260 (2014).
- Steenblock, E. R., Fadel, T., Labowsky, M., Pober, J. S., Fahmy, T. M. An artificial antigen-presenting cell with paracrine delivery of IL-2 impacts the magnitude and direction of the T cell response. The Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34883-34892 (2011).
- Zhang, L., et al. Paracrine release of IL-2 and anti-CTLA-4 enhances the ability of artificial polymer antigen-presenting cells to expand antigen-specific T cells and inhibit tumor growth in a mouse model. Cancer Immunology, Immunotherapy. 66 (9), 1229-1241 (2017).
- Mescher, M. F. Surface contact requirements for activation of cytotoxic T lymphocytes. The Journal of Immunology. 149 (7), 2402-2405 (1992).
- Steenblock, E. R., Fahmy, T. M. A comprehensive platform for ex vivo T-cell expansion based on biodegradable polymeric artificial antigen-presenting cells. Molecular Therapy. 16 (4), 765-772 (2008).
- Fifis, T., et al. Size-dependent immunogenicity: therapeutic and protective properties of nano-vaccines against tumors. The Journal of Immunology. 173 (5), 3148-3154 (2004).
- Sunshine, J. C., Perica, K., Schneck, J. P., Green, J. J. Particle shape dependence of CD8+ T cell activation by artificial antigen presenting cells. Biomaterials. 35 (1), 269-277 (2014).
- Meyer, R. A., et al. Biodegradable nanoellipsoidal artificial antigen presenting cells for antigen specific T-cell activation. Small. 11 (13), 1519-1525 (2015).
- Champion, J. A., Katare, Y. K., Mitragotri, S. Particle shape: a new design parameter for micro- and nanoscale drug delivery carriers. Journal of Controlled Release. 121 (1-2), 3-9 (2007).
- Meyer, R. A., Meyer, R. S., Green, J. J. An automated multidimensional thin film stretching device for the generation of anisotropic polymeric micro- and nanoparticles. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (8), 2747-2757 (2015).
- Ho, C. C., Keller, A., Odell, J. A., Ottewill, R. H. Preparation of monodisperse ellipsoidal polystyrene particles. Colloid and Polymer Science. 271 (5), 469-479 (1993).
- Shum, H. C., et al. Droplet microfluidics for fabrication of non-spherical particles. Macromolecular Rapid Communications. 31 (2), 108-118 (2010).
- Lan, W., Li, S., Xu, J., Luo, G. Controllable preparation of nanoparticle-coated chitosan microspheres in a co-axial microfluidic device. Lab on a Chip. 11 (4), 652-657 (2011).
- Yang, S., et al. Microfluidic synthesis of multifunctional Janus particles for biomedical applications. Lab on a Chip. 12 (12), 2097-2102 (2012).
- Zhou, Z., Anselmo, A. C., Mitragotri, S. Synthesis of protein-based, rod-shaped particles from spherical templates using layer-by-layer assembly. Advanced Materials. 25 (19), 2723-2727 (2013).
- Jang, S. G., et al. Striped, ellipsoidal particles by controlled assembly of diblock copolymers. Journal of the American Chemical Society. 135 (17), 6649-6657 (2013).
- Petzetakis, N., Dove, A. P., O'Reilly, R. K. Cylindrical micelles from the living crystallization-driven self-assembly of poly(lactide)-containing block copolymers. Chemical Science. 2 (5), 955-960 (2011).
- Rolland, J. P., et al. Direct fabrication and harvesting of monodisperse, shape-specific nanobiomaterials. Journal of the American Chemical Society. 127 (28), 10096-10100 (2005).
- Meyer, R. A., et al. Anisotropic biodegradable lipid coated particles for spatially dynamic protein presentation. Acta Biomaterialia. 72, 228-238 (2018).
