Summary
Aquí, presentamos un protocolo de forma rápida y reproducible generar biológicamente inspirado, biodegradable articifical antígeno que presenta las células (aAPC) con tamaño ajustable, forma y presentación de proteína de la superficie de la célula de T expansión ex vivo o en vivo .
Abstract
Antígeno artificial que presenta las células (aAPC) son una prometedora plataforma para modulación inmune debido a su potente capacidad para estimular las células T. Acelulares sustratos ofrecen ventajas sobre aAPC basadas en células, incluyendo un control preciso de los parámetros de presentación de señal y las características físicas de la superficie de la aAPC para modular las interacciones con las células de T. aAPC construido a partir de partículas anisotrópicas, partículas especialmente elipsoidales, han demostrado ser más eficaz que sus contrapartes esféricas a estimulantes células T debido a la mayor unión y mayor superficie disponible para la célula de T de contacto, así disminución de la absorción no específica y propiedades farmacocinéticas mejoradas. A pesar del creciente interés partículas anisotrópicas, incluso ampliamente aceptados métodos de generar partículas anisotrópicas como estiramiento de película delgada puede ser un desafío implementar y usar de manera reproducible.
Para ello, describimos un protocolo para la fabricación rápida y estandarizada de biodegradable anisotrópico aAPC basada en partículas con tamaño ajustable, forma y señal de presentación de la célula de T expansión ex vivo o en vivo, junto con métodos para caracterizan su tamaño, morfología y superficie contenido en proteínas y para evaluar su funcionalidad. Esta forma de fabricación de aAPC anisotrópico es escalable y reproducible, lo que es ideal para la generación de aAPC para inmunoterapias "estándares".
Introduction
Las células que presenta antígenos artificiales (aAPC) han demostrado promesa como agentes inmunomoduladores porque pueden generar una respuesta robusta célula de T antígeno-específica. Esencial para estas plataformas son su capacidad para presentar eficientemente señales cruciales para la activación de células T. AAPC acelular son una alternativa atractiva a aAPC celulares porque son más fáciles y menos costosos de fabricar, menos dificultades durante el escalado y traducción y mitigar los riesgos asociados con las terapias basadas en células. AAPC acelular también permiten un alto grado de control sobre los parámetros de presentación de señal y características físicas de la superficie que se une con las células de T1.
aAPC debe recapitular un mínimo de dos señales esenciales para la activación de células T. Señal 1 proporciona el reconocimiento del antígeno y se produce cuando el receptor T (TCR) reconoce y compromete con un MHC de clase I o II con su antígeno cognado, culminando en la señalización a través del complejo TCR. Para omitir el requisito de especificidad de antígeno, aAPC sistemas a menudo llevan un agonístico anticuerpo monoclonal contra el receptor CD3, que estimula un complejo TCR. Formas recombinantes de MHC, particularmente MHC Multímeros, han utilizado también en la superficie de aAPC para proporcionar especificidad de antígeno2,3. Señal 2 es una señal costimulatory que dirige la actividad de las células T. Para proporcionar la coestimulación necesaria para la activación de células T, el receptor CD28 generalmente es estimulado con un anticuerpo agonístico presentado en la superficie de la aAPC, aunque otros receptores costimulatory como 4-1BB han dirigido con éxito4. Proteínas de señal 1 y 2 normalmente son inmovilizadas en la superficie de partículas rígidas para sintetizar aAPC. Históricamente, aAPC han sido fabricados de una variedad de materiales, incluyendo poliestireno4,5 y hierro dextrano6. Los sistemas más nuevos utilizan polímeros biodegradables como poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) para generar aAPC que puede acoplarse fácilmente para señalar las proteínas, es convenientes para la administración directa en vivoy puede facilitar la liberación de encapsulado de citocinas o factores solubles al aumentar la activación de la célula de T7,8.
Además de la presencia de proteínas de señal necesario, compromiso del receptor sobre una superficie suficientemente grande durante la interacción de la célula de la aAPC/T es esencial para la activación de células T. Así, parámetros físicos de la aAPC tales como tamaño y forma drásticamente alteran su área disponible de contacto y afectan su capacidad para estimular las células T. AAPC tamaño micrométrico han demostrado ser más eficaz en estimular las células de T que sus contrapartes de nanoescala9,10. Sin embargo, puede tener nano-aAPC biodistribución superior y mejor drenaje a los ganglios linfáticos que pueden mejorar su rendimiento en vivo sobre micro-aAPC11. La forma es otra variable de interés en sistemas basados en partículas aAPC. AAPC anisotrópico se han demostrado recientemente para ser más eficaz que partículas isotrópicas a estimular las células T, debido principalmente a la mayor interacción con las células diana junto con captación reducida celular inespecífica. Células se unen preferentemente al eje longitudinal de las partículas elipsoidales, y el mayor radio de curvatura y la superficie plana permite más contacto entre la aAPC y de la célula de T12. El eje largo de las partículas elipsoidales también desalienta la fagocitosis, dando por resultado la circulación creciente de tiempo que las partículas esféricas siguiendo en vivo administración12,13. Debido a estas ventajas, las partículas elipsoidales median una mayor expansión de específica de antígeno las células T en vitro y en vivo en comparación con las partículas esféricas, un efecto observado en el micro y nanoscales12, 13. Hay varias estrategias para fabricar partículas anisotrópicas, pero película delgada que se extiende es un método simple, ampliamente aceptado para generar una amplia gama de partículas diversas formas14. Tras la síntesis, las partículas son en películas y se extendía en una o dos dimensiones a una temperatura por encima de la temperatura de transición vítrea del material de partículas. La película entonces se disuelve para recuperar las partículas. A pesar de un creciente interés en las partículas anisotrópicas, enfoques actuales de fabricación aAPC basada en partículas en su mayoría se limitan a isotrópicos sistemas y métodos de alterar la forma de la partícula pueden ser difícil de implementar, incompatibles con determinadas síntesis de aAPC estrategias y falta de precisión y reproducibilidad15. Nuestra técnica de estiramiento de película delgada puede ser realizado manualmente o en forma automática para generar rápidamente las partículas anisotrópicas sintetizadas a partir de una variedad de polímeros biodegradables, se extendía a una relación de aspecto deseada en una o dos dimensiones15.
Basado en nuestro trabajo anterior, hemos desarrollado un enfoque basados en partículas biodegradable combinado con escalable tecnología de película delgada que estira para rápidamente generar aAPC con forma y tamaño ajustable de manera estandarizada para la expansión de la célula de T ex vivo o en vivo. Nuestra estrategia verbal de proteína se puede utilizar para acoplar cualquier proteína de interés a los grupos carboxilo en la superficie de la partícula en una densidad deseada, dando un alto grado de flexibilidad a este sistema aAPC. También se describen métodos para caracterizar el tamaño, la morfología y la proteína de la superficie de aAPC y para evaluar su funcionalidad en vitro. Este protocolo puede ser muy fácilmente adaptable para expandir las células inmunes ex vivo o en vivo para una variedad de aplicaciones de inmunoterapia.
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Protocol
Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad Johns Hopkins.
1. fabricación de partículas esféricas PLGA de tamaño ajustable
- Preparación de materiales para la síntesis de partículas
- Preparar la solución al 5% p/p, alcohol de polivinilo (PVA).
- Añadir 500 mL de agua desionizada (DI) a un matraz de Erlenmeyer con una barra de agitación magnética y colocar en placa caliente agitador a 500 rpm y monitor de temperatura con termómetro. Cubrir el matraz con papel de estaño para evitar la evaporación.
- Cuando la temperatura del agua llega aproximadamente a 70 ° C, añadir total 25 g de PVA en lotes pequeños con el tiempo, esperando PVA a disolver antes de añadir más.
- Una vez que los PVA se disuelve (normalmente 30-60 min), que filtro de solución fría y estéril. Almacenar a 4 ° C para su uso futuro.
- Preparar solución de casting de película de 10% w/w PVA y glicerol de 2% w/w.
- Añadir 500 mL de agua desionizada en un matraz de Erlenmeyer con una barra de agitación magnética. Añada 8 mL de glicerol a temperatura ambiente y mezcla por trituración.
- Mufla en placa caliente agitador a 500 rpm y monitor de temperatura con termómetro. Cubrir el matraz con papel de estaño para evitar la evaporación.
- Cuando la temperatura de la solución alcanza aproximadamente 70 ° C, añadir total 50 g de PVA en lotes pequeños con el tiempo, esperando PVA a disolver antes de añadir más.
- Una vez que los PVA se disuelve (típicamente 60 min), que solución fría y estéril el filtro utiliza un sistema de filtro de vacío superior de la botella con un tamaño de poro de 0,22 μm. Almacenar a temperatura ambiente para su uso futuro.
- Preparar una solución PVA de 50 mL de 1% w/w. Añadir 40 mL de agua desionizada y 10 mL de solución al 5% PVA (hecho en 1.1.1) a un vaso de precipitados de 100-150 mL.
- Preparar una solución PVA 100 mL de 0.5% w/w. Añadir 90 mL de agua desionizada y 10 mL de solución al 5% PVA a un vaso de precipitados de 150-250 mL.
- Añadir una barra de agitación magnética a la solución PVA de 0,5% y el lugar en una campana química en una placa de agitación a temperatura ambiente a 500 rpm.
- Preparar la solución al 5% p/p, alcohol de polivinilo (PVA).
- Síntesis de micropartículas
- Pesar 100 mg de poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) en un vial de centelleo y disolver en 5 mL de diclorometano (DCM). Vortex para disolver el EGLP.
- Poner homogeneizador en la solución PVA de 50 mL de 1% que el homogeneizador está tan cerca de la parte inferior del vaso como sea posible sin tocarlo. Encienda el homogeneizador y ajuste a la velocidad deseada: 3.200 rpm para las partículas de diámetro de 5 μm, 5.000 rpm de 3 μm, 15.000 rpm de 1 μm (aumento de tamaño de partícula de disminuciones de velocidad de homogeneización). Una vez a la velocidad deseada, agregar la solución PLGA vaso de precipitados y homogeneizar durante 1 minuto.
- Después de la homogeneización, verter el 1% PVA, PLGA micropartículas solución en la solución PVA de 0,5% 100 mL en un plato de agitar y mezclar durante al menos 4 horas para evaporación de solvente en una campana química.
- Lavar las partículas 3 veces en agua desionizada.
- Verter la solución de partículas en tubos cónicos de 50 mL y centrifugar a 3000 x g durante 5 minutos. Vaciar el sobrenadante y agregar aproximadamente 20 mL de agua desionizada.
- Resuspender las partículas con un vórtex. Una vez suspendidas, llenar tubos cónicos de 50 mL con agua desionizada.
- Lavar otra vez la misma forma dos veces más.
- Síntesis de nanopartículas
- Pesar 200 mg de PLGA en un vial de centelleo y disolver en 5 mL de DCM. Vortex para disolver el EGLP.
- Coloque un vaso de precipitados con 50 mL 1% PVA solución en recipiente llenado de hielo. Coloque la sonda del sonicador en el vaso como cerca del fondo posible sin tocar. Comenzar a sonicación y agregar inmediatamente solución PLGA en el vaso. Someter a ultrasonidos con una potencia de 12 W durante 2 minutos para generar nanopartículas con un diámetro aproximado de 200 nm.
- Después de la sonicación, verter el 1% PVA, PLGA nanopartículas solución en una solución PVA de 0,5% 100 mL en un plato de agitar y mezclar durante al menos 4 horas para evaporación de solvente en una campana química.
- Verter la solución de partículas en tubos cónicos de 50 mL y centrifugar a 3.000 x g durante 5 minutos para eliminar las micropartículas. Eliminar el sobrenadante y verter en tubos de centrífuga de alta velocidad.
- Lavar las partículas 3 veces con agua desionizada. Centrifugue a 40.000 x g durante 15 minutos. Vaciar el sobrenadante y resuspender en agua desionizada con un vórtex. Lavar otra vez la misma forma dos veces más.
2. fabricación de partículas poliméricas de forma armoniosa
- Después de lavar las partículas PLGA tres veces, resuspender las partículas en aproximadamente 1 mL de agua desionizada. Añadir la solución de casting de la película a las partículas para la concentración de la partícula final de partículas de 2.5 mg/mL.
- Pipetear la suspensión de partículas en alícuotas de 10 mL en platos de Petri rectangular de 75 x 50 mm para estirar unidimensional o en alícuotas de 15 mL en platos de Petri cuadrada 100 x 100 mm para estirar bidimensional. Quite las burbujas con una pipeta u o burbujas empuja a un lado y deje que seque durante la noche películas en una campana química.
- Una vez que las películas se han secado, saque películas platos de plástico con pinzas y cortar los bordes de las películas con las tijeras. Guardar los bordes en un tubo cónico de 50 mL para ser utilizado como partículas esféricas.
- Carga una película en la película delgada automatizada dispositivo de estiramiento por el montaje de una película sobre los bloques de aluminio. Para 1D estirar, Monte film sobre los bloques de aluminio de un eje de la camilla (figura 2) colocando dos bordes cortos de película entre dos trozos de goma de neopreno. Utilizando una llave Allen, tornillo agarra el metal encima de goma para sostener la película en su lugar. Para estirar 2D, Monte los cuatro bordes en cuatro bloques de aluminio para estirar en ambos ejes (figura 2).
- Mida y registre la longitud de la película entre bloques de aluminio en un eje para estirar 1 D o ambos ejes para estirar 2D. Calcular la distancia necesaria para estirar la película en una o dos direcciones basadas en tramo de doblez deseado.
- El aparato de estiramiento película carga en un horno a 90 ° C y llevar la película a temperatura durante 10 minutos. Coloque un vaso grande en el horno con una pequeña cantidad de agua.
- Película de estiramiento.
- Cuando se completa el estiramiento, retire el dispositivo de estiramiento del horno y deje que la película se enfríe a temperatura ambiente durante 20 minutos.
- 1D estirar, cortar la película por el dispositivo de estiramiento en los bordes. Para 2D estirar, cortar y guárdelo el centro cuadrado de película que se extiende uniformemente en ambos ejes. Colocar películas en tubos cónicos con 2 películas por el tubo y desechar el resto de la película.
- Añadir aproximadamente 25 mL de agua desionizada a cada tubo cónico y agitar hasta que se disuelvan las películas.
- Una vez que las películas son partículas disueltas, Lave 3 veces con agua desionizada.
- Para micropartículas, llenar tubos cónicos de 50 mL y centrifugar a 3000 x g durante 5 minutos, vaciar el sobrenadante, agregar aproximadamente 20 mL de agua desionizada y agitar para resuspender las partículas.
- Para las nanopartículas, las partículas de la transferencia a tubos de centrífuga de alta velocidad y centrifugar a 40.000 x g durante 15 minutos, vaciar el sobrenadante, agregar aproximadamente 20 mL de agua desionizada y agitar para resuspender las partículas.
- Después del tercer lavado, resuspender partículas en aproximadamente 1 mL de agua desionizada. Registrar el peso del tubo de microcentrífuga y añadir partículas al tubo. Partículas de congelar en un congelador de-80 ° C por 1 hora o flash congelan en nitrógeno líquido. Una vez congelado, liofilizar las partículas durante la noche.
- Una vez liofilizados, pesan las partículas en el tubo de microcentrífuga y restar peso registrado del tubo vacío para determinar el peso de las partículas liofilizados.
3. superficie de la proteína verbal para crear Artificial antígeno células presentadoras
- Preparar 2-(N-morfolino) (n-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-ácido tampón de ácido (MES). Una solución de 0,1 M de MES en agua y ajustar el pH a 6.0 por titulación con hidróxido de sodio de 1 M (NaOH).
- Resuspender liofilizado PLGA/PBAE micro/nanopartículas a 20 μg/mL en tampón MES con un vórtex. Llene un tubo de microcentrífuga de polipropileno con 900 μL de tampón MES y añadir 100 μL de la solución de la partícula en el tubo.
- Preparar solución EDC/NHS. Disolver 40 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimida (EDC) y N-hydroxysulfoxuccinimide (NHS) de 48 mg en 1 mL de tampón de MES.
- Añadir 100 μL EDC/NHS solución a las partículas y vortex para mezclar.
- Incubar el tubo a un inversor a temperatura ambiente durante 30 minutos.
- Girar por micropartículas a 5.000 x g durante 5 minutos, o nanopartículas a 17.000 x g durante 5 minutos. Deseche el sobrenadante y resuspender en 1 mL de PBS por Vortex (micropartículas) o sonicando en W 2-3 durante 5 segundos (nanopartículas).
- Para micropartículas, añadir 8 μg de la proteína de señal 1 y 10 μg de anti-ratón CD28 (clon 37.51) a las partículas. Para las nanopartículas, agregue 16 μg señal 1 y 20 μg anti-ratón CD28. Añadir PBS para el volumen en el tubo 1.1 mL.
- Incubar el tubo a un inversor a 4 ° C durante la noche.
- Al día siguiente, lavar las partículas. Girar por micropartículas a 5.000 x g durante 5 minutos, o nanopartículas a 17.000 x g durante 5 minutos. Deseche el sobrenadante y resuspender las partículas en 1 mL de PBS estéril por Vortex (micropartículas) o sonicación en W 2-3 durante 5 segundos (nanopartículas). Repetir dos veces.
- Resuspender las partículas en la concentración deseada en el medio de cultivo para su uso inmediato. Para el almacenamiento a largo plazo, resuspender partículas 10 mg/ml en una solución de sacarosa 100 mM. Congelar, liofilizar y almacenar las partículas de a-80 ° C.
4. Caracterización y evaluación de la aAPC
- Caracterización de tamaño de la aAPC y de forma (figura 3)
- Caracterizar micropartículas de tamaño y forma de partículas mediante microscopía electrónica (SEM). Para SEM imagen, extensión partículas liofilizadas en cinta de carbón adhirieron a un aluminio virar y sputter coat con oro paladio.
- Analizar el tamaño y la proporción de partículas usando software de análisis de imagen.
- Para determinar el tamaño de partícula, ajustar escala uso de barra de escala y medir el diámetro de la partícula. Repita para que aproximadamente 100 partículas determinar el diámetro medio de partícula y generar un histograma de los tamaños de partícula.
- Para determinar el cociente de aspecto, mida la distancia entre el eje largo y eje corto de las partículas y dividir el eje por eje corto. Repita para las partículas aproximadamente 50 de cada forma para determinar la proporción de aspecto de partícula promedio para cada forma y generar histogramas.
- Caracterizar nanopartículas de tamaño y forma de partículas usando microscopia electrónica de transmisión (TEM) la proyección de imagen. Analizar el tamaño y proporción de aspecto de nanopartículas usando software de análisis de imagen como se describe en 5.1.2. Por otra parte, medir el tamaño de nanopartícula esférica con dispersión ligera dinámica (DLS) o nanopartículas seguimiento análisis (NTA).
- Eficiencia de proteína verbal
- Preparar aAPC según métodos 1-3, pero en paso 3.7 utiliza la señal de fluorescencia etiquetada 1 proteína y anti-ratón CD28. Después de la conjugación y lavado, Resuspender la aAPC en 1 mL de PBS para una concentración final de 2 mg/mL aAPC.
- Preparar estándares de proteína en una microplaca de 96 pocillos poliestireno negro. Añadir 5 μg de proteína fluorescente etiquetado señal 1 a PBS en el primer pocillo de la placa y hacer diluciones de 1:2 10 en PBS a través de la fila de la placa. Deje el espacio en blanco bien pasado. Repita este paso para generar otro conjunto de normas con fluorescencia etiquetada anti-CD28.
- Pipetee 100 μL de la solución de la aAPC en repetidos pocillos de la microplaca de poliestireno negro por triplicado.
- Leer la fluorescencia en un lector de fluorescencia en las longitudes de onda apropiadas. Utilizar las lecturas de la fluorescencia de los estándares de proteína para generar curvas estándar para cada anticuerpo fluorescente. Usando la curva estándar, calcular las concentraciones de señal 1 y anti-CD28 en cada pocillo de la muestra y luego calcular la cantidad de proteína de la superficie y eficiencia verbal (Figura 4A, figura 5A).
- Evaluación de la aAPC en vitro la estimulación de células T CD8 +
- Preparar medios de B' (Medio RPMI suplementado con glutamina 10% FBS, solución de aminoácidos no esenciales 1%, 1% piruvato de sodio, solución al 1% MEM vitamina, 92 μM β-mercaptoetanol, 10 ng/mL ciprofloxacin y 30 U/mL IL-2.
- Sacrificar un ratón negro 6 mediante exposición de dióxido de carbono.
- La cosecha del bazo del ratón según un protocolo previamente establecido16. Recoger el bazo en un tubo cónico de 50 mL con 10 - 15 mL de PBS. Usando un mortero, machaque el bazo a través de un tamiz celular de 70 μm en un tubo cónico de 50 mL. Durante la maceración, lave el filtro con 40 mL de PBS.
- Girar los esplenocitos a 300 x g durante 5 minutos. Retirar el sobrenadante y resuspender los esplenocitos en 4 mL de tampón de lisis de Ack para lisar los glóbulos rojos. Deje el tubo para sentarse tranquilo durante 1 minuto y luego añadir PBS para el volumen en el tubo de 20 mL.
- Girar las células a 300 x g durante 5 minutos. Retirar el sobrenadante y resuspender las células en 1 mL de PBS. Contar las células usando un hemocitómetro.
- Girar las células a 300 x g durante 5 minutos y resuspender en el volumen de tampón de separación celular. Aislar células de CD8 + T de la suspensión de la célula usando una CD8 + selección negativa kit de aislamiento de la célula de T, siguiendo el protocolo del fabricante.
- Después de la separación magnética, spin de células T CD8 + a 300 x g durante 5 minutos y retirar el tampón de separación celular. Resuspender las células en 1 mL de PBS y contar las células. Células con éster de succinyl carboxyfluorescein (CFSE) según protocolo del fabricante de la etiqueta.
- Incubar 8.333 células T CD8 + y 0,0833 mg o dosis deseada de aAPC en medios 150 B μL en cada pocillo de una 96 placa de cultivo de tejidos tratados bien U inferior.
- Incubar a 37 ° C durante 7 días. Después de 3-4 días, actualizar el medio de cultivo mediante la adición de medio fresco de 75 μL a cada pocillo.
- Después de 3 días de incubación, analizar CFSE con células en un citómetro de flujo para evaluar la proliferación. Cada pico en el histograma CFSE de citometría de flujo representa una generación de células debido a la dilución de la CFSE con cada división celular sucesiva.
- Después de 7 días, utilizar un hemocitómetro para contar el número de células en cada pozo. Antes de contar, se tiñen las células muertas con una solución de azul de tripano. Excluir las células muertas del recuento final. Normalizar la concentración celular final a la concentración inicial para calcular la expansión de doblez (figura 4 y figura 5).
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Representative Results
Un esquema de la película fina 2D automatizado dispositivo de estiramiento se da en la figura 1. Un esquema y una descripción de una película fina de 1D dispositivo de estiramiento se da en Ho et al.17 la camilla está hecha de piezas de aluminio mediante fresado y mecanizado técnicas estándar. Similar a la camilla de 1D, la camilla 2D consiste en puños metálicos y guías. Se utilizan tornillos bidireccional para traducir lineal en movimiento rotatorio. Los tornillos son la vía grifos mecánicos para motores idénticos con suficiente esfuerzo de torsión. Los cables de control de motor paso a paso 8 pueden soldarse sobre conectores amphenol resistente al calor de 8 pines para la conexión fácil a la consola de control en un horno de película delgada que se extiende. Debe utilizarse alambre revestido del politetrafluoetileno (PTFE) de longitud suficiente para conectar los motores paso a paso a los controladores en la consola de control. El esquema de control de computadora recomendada es dada en la figura 1A. Los dos motores deben estar conectados mediante cables a prueba de calor para 2 conductores independientes. Los dos pilotos luego deben conectarse a un microcontrolador para interfaz con un ordenador. Los conductores deben ser conectados al eje x y eje y salidas en el microcontrolador. Tanto los controladores como microcontrolador requieren una fuente externa. Antes de conectar la alimentación a estos tres componentes se recomienda que un fusible de 4 a insertarse entre cada una de las conexiones de potencia para proteger los componentes contra sobrecarga de corriente. Finalmente, el microcontrolador puede vincularse a través de una entrada de puerto paralelo a un ordenador mediante un DB25 macho a macho cable. La electrónica que se utiliza para controlar los motores paso a paso es sensibles al calor y por lo tanto debe colocarse fuera de cualquier fuente de calor (como un horno) utilizado durante la operación para calentar las láminas delgadas a temperatura suficiente para permitir el estiramiento. Aunque los motores recomendados son resistentes al calor hasta la temperatura especificada en el presente Protocolo de estiramiento de las partículas, los motores y los controladores se acumulan más calor mientras están conectados a la fuente de alimentación principal. Por lo tanto, se recomienda que el dispositivo sólo en marcha durante el período de la película real para minimizar la potencial acumulación de calor.
PLGA de nano y micropartículas fueron sintetizadas usando las técnicas de emulsión simple se describe en este protocolo y reflejada usando TEM (Figura 3A) y SEM (figura 3B), respectivamente. Las nanopartículas esféricas tenían un diámetro de 237.3 ± 4.0 nm medida por DLS y 224 nm medida por NTA (figura 3). Se sintetizaron micropartículas de homogeneización a 5000 rpm para generar partículas esféricas con un diámetro promedio de 3 ± 1 μm (figura 3D). Las partículas fueron estiradas utilizando la película automatizada dispositivo de estiramiento a 90 ° C en una dimensión para generar prolate elipsoidal nano y micropartículas y se extendía a 70 ° C en dos dimensiones para generar partículas elipsoidales Oblatas. Se analizaron las proporciones de aspecto de las micropartículas de todas tres formas midiendo el eje largo y eje corto distancia de partículas y dividiendo los dos. Micropartículas esféricas tenían un cociente de aspecto de 1.05 ± 0.04, mientras que 1D estirado prolate partículas elipsoidales tenían una mayor proporción de 3,6 ± 0.8 (figura 3E). Partículas elipsoidales Oblatas se extendía 2D tenían un cociente de aspecto de 1,2 ± 0,2, manteniendo aproximadamente un cociente de aspecto de una.
EDC/NHS reacción química se utiliza conjugar una fluorescencia etiquetada cargado de péptido MHC dimero y anti-CD28 anticuerpo IgG a la superficie de partículas PLGA estiradas y esféricas. Resultados de eficiencia verbal demuestran cantidades similares de proteína en la superficie de la aAPC-micro esférica y elipsoidal (Figura 4A) y nano-aAPC (figura 5A) y demostrar que la proteína de acoplamiento durante la síntesis de la aAPC se produce en un manera dependiente de la concentración. Para evaluar el efecto de la forma en la funcionalidad de la aAPC, esférico y prolato aAPC elipsoidal conjugados con gp100 cargado dímero de IgG de MHC y anti-CD28 se utilizaron para estimular las células T CD8 + transgénicas PMEL. Las células de T fueron etiquetadas con CFSE y evaluadas por citometría de flujo después de 3 días para evaluar la proliferación (Figura 4B, 5B). Prolate aAPC elipsoidal se encontró que inducen niveles más altos de la proliferación de la célula de T en dosis sub-saturador que aAPC esférico, con la separación mejor lograda en una dosis de 0.01 mg. Después de 7 días, las células T se contaron manualmente. Prolate aAPC elipsoidal más eficazmente estimula las células de T en comparación con sus contrapartes esféricas en la microescala (figura 4) y nanoescala (figura 5), y se observó la expansión de la célula de T dependiente de la dosis.
Figura 1: representación esquemática de camilla de película fina automatizada. (A) esquema de consola de mando para camilla de película delgada. (B) esquema de hardware mecánico para camilla de película delgada. (Izquierda) Vista aérea de hardware mecánico. (Derecha) Sección de sujeción mecanismo de películas delgadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: fotografías de camilla montada película fina automatizada para estirar las partículas poliméricas en formas anisotrópicos. La película fina 2D dispositivo de estiramiento se compone de dos ejes con soportes de aluminio que se agarran de la película. Los dos ejes contienen tornillos en direcciones opuestas de modo que se mueven aparte de uno a. Para automatizar el procedimiento de estiramiento, un microcontrolador USB vinculado está conectado a dos controladores de motor paso a paso que retransmiten las señales de paso a paso unipolar motores a través de un cable térmico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Análisis de tamaño y proporción de partículas PLGA esféricas y elipsoidales. (A) TEM y SEM (B) imágenes de esférico, 1D estirado prolate elipsoidal y 2D se extendía oblatos elipsoidal PLGA (A) nanopartículas y micropartículas (B). (C) esférica nanopartículas fueron dimensionadas por NTA y determine que 224 nanómetro en diámetro. Se analizaron imágenes de SEM de PLGA micropartículas para (D) distribución de tamaño de partículas esféricas y (E) proporciones de todas las formas de partículas. (C) reproducido y adaptado con permiso de pequeño13, 2015 de Wiley-VCH de derechos de autor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: caracterización y valoración funcional del esférico y prolato elipsoidal micro-aAPC. (A) eficiencia Conjugación de fluorescencia etiquetada cargado de péptido MHC dimero y anti-CD28 anticuerpo IgG a la superficie de micropartículas elipsoidal esférica y prolate. (B) de células T CD8 + fueron etiquetadas con CFSE y se incubaron con micro-aAPC esférico y estirado de 1D en dosis de 0.01, 0.1 y 1 mg, o controles no cognado. Después de 3 días, las células fueron evaluadas por citometría de flujo para evaluar la proliferación. Las células de T (C) también fueron evaluadas después de 7 días por conteo manual. Recuento se normalizaron a la cuenta inicial para calcular doble expansión. Para la comparación entre expansión prolate veces elipsoidal y esférica, * = p < 0.05, ** = p < 0.01, y *** = p < 0.001. Barras de error representan el error estándar de la media (SEM) para 3 repeticiones. Reproducido y adaptado con permiso de biomateriales12, Copyright Elsevier 2014. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: caracterización y valoración funcional del nano-aAPC elipsoidal esférica y prolate. (A) eficacia Conjugación de fluorescencia etiquetada cargado de péptido MHC dimero y anti-CD28 anticuerpo IgG a la superficie de nanopartículas esféricas y prolato elipsoidales. (B) de células T CD8 + fueron etiquetadas con CFSE y se incubaron con esférico y prolato nano elipsoidal-aAPC de doblez-estiramiento diferente a dosis de 0.01, 0.1 y 1 mg. Después de 3 días, las células fueron evaluadas por citometría de flujo para evaluar la proliferación. (C) las células de T incubadas con partículas elipsoidales prolato de diferentes doble tramo (desde 1.5 a 3.5) también fueron evaluadas después de 7 días por conteo manual. Un recuento fueron normalizado a una condición sin tratamiento para calcular doble expansión. * = p < 0.05, ** = p < 0.01, y *** = p < 0,001 comparado con el esférico. Barras de error representan el error estándar de la media (SEM) para 3 repeticiones. Reproducido y adaptado con permiso de pequeño13, 2015 de Wiley-VCH de derechos de autor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo detalla un método versátil para la generación precisa de anisotrópicas partículas poliméricas. La película fina estiramiento técnica descrita aquí es escalable, altamente reproducible y económica. Técnicas alternativas para la generación de partículas anisotrópicas sufren muchas limitaciones, incluyendo alto costo, bajo rendimiento y tamaño de partícula limitada. La película fina estiramiento enfoque también es ventajosa porque las partículas se modifican para ser anisotrópicas después de síntesis y como resultado, es compatible con una amplia gama de tamaños de partículas y técnicas de síntesis. Figura 1 detalla la configuración del dispositivo extensión bidimensional automatizado. Este dispositivo también puede utilizarse sin los componentes electrónicos girando manualmente los tornillos hasta que la película ha alcanzado el grado de estiramiento deseado. Sin embargo, hemos encontrado que el proceso automatizado es mucho más consistente y rápida de operación manual15. Se han desarrollado varias técnicas para sintetizar partículas anisotrópicas como microfluidos enfoques17,18,19, capa por capa la capa21y otros enfoques de abajo hacia arriba síntesis21 ,22. Sin embargo, estos enfoques no permiten un control fuerte sobre la geometría de la partícula y no son tan versátiles en términos de formas que se pueden generar y partículas materiales que se pueden utilizar. Un método popular de arriba hacia abajo para la fabricación de partículas nonspherical es la replicación de la partícula en plantillas no humectantes (impresión)24. Aunque impresión permite un control preciso sobre la forma de la partícula, se requiere maquinaria costosa y no es tan accesible y fácil de aplicar como la delgada película método de estiramiento.
La técnica de emulsión simple puede utilizarse para fabricar partículas PLGA de varios tamaños, que van desde el nano a microescala12,13. Por variable amplitud velocidad o sonicación de homogeneización, micropartículas y nanopartículas de tamaño, respectivamente, puede ser modulado. Una vez que se han generado las partículas esféricas, la película fina estiramiento método descrito aquí puede utilizarse para deformar las partículas en diferentes formas15. En este protocolo, se describe la generación de partículas elipsoidales prolate y Oblatas estirando en una o dos dimensiones, respectivamente. Partículas esféricas se echan en una película plástica fina, que se calienta por encima de la temperatura de transición vítrea de PLGA y estirada en una o dos dimensiones a deformar las partículas. La proporción de las partículas es altamente controlable. Ajuste el grado de estiramiento de la película, la proporción de las partículas puede ser modulada, y hemos encontrado que cociente de aspecto de partícula medido está muy relacionada con el valor predicho12,13. Varias otras formas pueden generarse mediante la modificación de la temperatura durante el estiramiento o el grado de estiramiento. Por ejemplo, bicóncavas partículas discoidales que se asemeja a la forma de glóbulos rojos pueden ser generadas por micropartículas 1.5-fold en dos dimensiones que se extiende a 90 ° C. 15. esta película estiramiento técnica también se ha utilizado para transformar las partículas esféricas de poliestireno en muchas formas anisotrópicos, incluyendo gusanos, barriles y discos rectangular21. La película de estiramiento de dispositivo puede ser utilizada por controlar manualmente los tornillos o puede automatizarse el dispositivo como se muestra en la figura 1 para hacer el proceso más eficiente y constante15. Esta simple técnica fiable produce anisotropic partículas que conservan su forma bajo condiciones fisiológicas24. Además, este método ha sido aplicado a otros materiales poliméricos, además al EGLP, como la policaprolactona (PCL) y partículas híbridas de PLGA y poli (beta-amino éster) (PBAE).
Este protocolo describe también cómo partículas PLGA de variado tamaño y forma pueden ser conjugadas con las proteínas de la superficie necesarias para que la activación de células T CD8 + como aAPC. Las proteínas pueden ser covalentemente conjugado anisotrópico y esférico PLGA micro - y nanopartículas por EDC/NHS mediada por acoplamiento de aminas primarias de proteínas a los grupos carboxilo en la superficie de la partícula. La eficacia de la conjugación de proteínas puede ser medida por la proteína fluorescente etiquetada de acoplamiento a la superficie de las partículas tal como se describe en el presente Protocolo, y hemos encontrado que esta técnica parejas proteínas a las partículas de 15-20% eficiencia12, 13. Prolate elipsoidal micro y nanopartículas aAPC son más efectivos que sus contrapartes esféricas en activación de CD8 + T célula proliferación y expansión en vitro12,13. AAPC elipsoidal han mejorado la Unión y la interacción con células T debido a su mayor superficie de contacto12. Anisotrópicas partículas también tienen características superiores sobre partículas esféricas en vivo debido a su biodistribución mejorada y resistencia a la fagocitosis13. Esta plataforma es altamente modular y tiene el potencial para ser adaptado a muchas otras aplicaciones de entrega de drogas. Mediante este procedimiento, pueden generarse partículas poliméricas de forma armoniosa y el tamaño y la superficie de la partícula puede ser conjugada con alguna proteína de interés.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
EBA (DGE-1746891) y KRR (DGE-1232825) gracias al programa de beca de investigación postgrado NSF para apoyo. Memoria RAM gracias a la investigación nacional servicio Premio NIH NCI F31 (F31CA214147) y las recompensas del logro para colegio científicos becas de apoyo. Los autores agradecen los NIH (R01EB016721 y R01CA195503), la investigación para prevenir ceguera James y Carole gratis Premio de catalizador y el Instituto de Bloomberg-Kimmel JHU de inmunoterapia del cáncer para la ayuda.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly(vinyl alcohol), MW 25000, 88% hydrolyzed | Polysciences, Inc. | 02975-500 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Digital Thermometer | Fluke | N/A | Model name: Fluke 52 II |
| Immersion Temperature Probe | Fluke | N/A | Model name: Fluke 80PK 22 |
| Digital Hotplate & Stirrer | Benchmark Scientific | H3760-HS | |
| Multipoint stirrer | Thermo Fisher Scientific | 50093538 | |
| Resomer RG 504 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide) | Sigma-Aldrich | 719900 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | D65100 | |
| Homogenizer | IKA | 0003725001 | |
| Sonicator | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Model number: VC 505 |
| Sonicator sound abating enclosure | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0427 |
| Sonicator probe | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0220 |
| Sonicator microtip | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0423 |
| High speed centrifuge | Beckman Coulter | N/A | Model number: J-20XP (discontinued), alternative model: J-26XP |
| High speed centrifuge rotor | Beckman Coulter | 369691 | Model number: JA-17 |
| High speed polycarbonate centrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific | 3118-0050 | 50 mL, screw cap |
| Rectangular disposable petri dish | VWR International | 25384-322 | 75 x 50 x 10 mm |
| Square disposable petri dish | VWR International | 10799-140 | 100 mm x 100 mm |
| LEAF Purified anti-mouse CD3ε Antibody | Biolegend | 100314 | |
| InVivoMab anti-mouse CD28, clone 37.51 | Bio X Cell | BE0015-1 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | E6383 | |
| N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt | Sigma-Aldrich | 56485 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100212 | |
| APC anti-mouse CD28 Antibody | Biolegend | 102109 | |
| Corning 96 Well Solid Polystyrene Microplate | Sigma-Aldrich | CLS3915 | flat bottom, black polystyrene |
| Protein LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431081 | |
| RPMI 1640 Medium (+ L-Glutamine) | ThermoFisher Scientific | 11875093 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | Heat Inactivated, sterile-filtered |
| Ciprofloxacin | Sigma-Aldrich | 17850 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Recombinant Human IL-2 (carrier-free) | Biolegend | 589102 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| MEM Vitamin Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11120052 | |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyi Biotech | 130-104-075 | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFisher Scientific | C34554 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| MACS Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Flow Cytometer | Accuri C6 | ||
| Synergy 2 Multi-Detection Microplate Reader | BioTek | ||
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi BIotech | 130-091-221 | |
| Cell Strainer | ThermoFisher Scientific | 22363548 | Sterile, 70 µm nylon mesh |
| ACK Lysing Buffer | ThermoFisher Scientific | A1049201 | |
| C57BL/6J (Black 6) Mouse | The Jackson Laboratory | 000664 | Male, at least 7 weeks old |
| U-Bottom Tissue Culture Plates | VWR | 353227 | Sterile, 96-well tissue culture treated polystyrene plates |
| 40 V DC Power Supply | Probotix | LPSK-4010 | |
| PTFE Coated Wire | Mouser | 602-5858-100-01 | This is for a 100 ft. spool but an equivalent wire will work |
| Stepper Motor Driver | Probotix | MondoStep5.6 | |
| IDC Connector Kit | Probotix | IDCM-10-12 | |
| Microcontroller | Probotix | PBX-RF | |
| 4A Fuses | Radio Shack | 2701026 | Equivalent fuses will work as well |
| DB25 Male to Male Cable | Probotix | DB25-6 | |
| USB-A to USB-B Cable | Staples | 2094915 | Equivalent cable will work as well |
| 8-Pin Amphenol Connectors Male and Female | Mouser | 654-97-3100A-20-7P and 654-97-3106A20-7S | |
| Stepper Motor | Probotix | HT23-420-8 | |
| Right Hand Lead Screw | Roton | 60722 | |
| Left Hand Lead Screw | Roton | 60723 | |
| Screws | McMaster Carr | 92196A151 | |
| Neoprene Rubber | McMaster Carr | 8698K51 | |
| Right Handed Flanged Lead Nut | Roton | 91962 | |
| Left Handed Flanged Lead Nut | Roton | 91963 | |
| Linux Control Computer | Probotix | LCNC-PC | Any computer with matching specification and Linux operating system will work |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma-Aldrich | CLS431097 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4 % | ThermoFisher Scientific | 15250061 |
References
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