Summary
Nous présentons ici un protocole pour générer rapidement et de façon reproductible des inspirée, biodégradable articifical cellules présentatrices (VAMP) avec taille ajustable, forme et présentation de la protéine de surface des lymphocytes T expansion ex vivo ou in vivo .
Abstract
Cellules présentatrices d’antigène artificiel (VAMP) sont une plate-forme prometteuse pour la modulation du système immunitaire en raison de leur capacité puissante pour stimuler les lymphocytes T. Substrats acellulaires offrent des avantages clés sur vamp basés sur les cellules, y compris un contrôle précis des paramètres de présentation de signal et les propriétés physiques de la surface de VAMP pour moduler ses interactions avec les lymphocytes T. Vamp, construit à partir de particules anisotropes, particules particulièrement ellipsoïdales, auraient dû être divulgués plus efficaces que leurs homologues sphériques de stimulation des cellules T en raison de la liaison accrue et de plus grande surface disponible pour les lymphocytes T contact, aussi bien réduit l’absorption non spécifique et des propriétés pharmacocinétiques améliorées. Malgré un intérêt accru dans les particules anisotropes, encore largement acceptée méthodes de génération de particules anisotropes comme minces étirement peut être difficile à implémenter et utiliser de façon reproductible.
À cette fin, nous décrivons un protocole pour la fabrication rapide et standardisé de vamp d’axée sur les particules anisotrope biodégradable avec taille ajustable, forme et signal de présentation pour les lymphocytes T expansion ex vivo ou in vivo, ainsi que les méthodes de caractériser leur taille, la morphologie et la protéine de surface contenue et d’évaluer leur fonctionnalité. Cette approche à la fabrication de vamp anisotrope est évolutive et reproductible, idéale pour générer VAMP pour immunothérapies « sur étagère ».
Introduction
Cellules présentatrices d’antigène artificiel (VAMP) ont montré prometteur comme agents immunomodulateurs, parce qu’ils peuvent générer une réponse des lymphocytes T spécifiques de l’antigène robuste. Essentielles à ces plates-formes sont leur capacité à présenter efficacement les signaux cruciaux pour l’activation des cellules T. Vamp acellulaire sont une alternative intéressante aux cellulaires vamp parce qu’ils sont plus facile et moins coûteux à fabriquer, relever des défis moins pendant l’intensification et de la traduction et atténuer les risques associés à des thérapies à base cellulaire. Vamp acellulaire permettent également un degré élevé de contrôle sur les paramètres de présentation de signal et les propriétés physiques de la surface qui sera en interface avec les cellules de T1.
Vamp doit récapituler un minimum de deux signaux essentiels pour l’activation des cellules T. Signal 1 prévoit la reconnaissance de l’antigène et se produit lorsque le récepteur des cellules T (TCR) reconnaît et s’engage avec un CMH de classe I ou II portant son antigène apparenté, culminant dans la signalisation à travers le complex TCR. Afin de contourner l’exigence de spécificité d’antigène, vamp systèmes portent souvent un agoniste monoclonal dirigé contre le récepteur CD3, qui stimule non spécifique du complexe TCR. Des formes recombinantes du CMH, particulièrement des multimères de MHC, ont également servis à la surface de vamp d’antigène spécificité2,3. Signal 2 est un signal de costimulation qui dirige l’activité des cellules T. Pour fournir la costimulation nécessaire pour l’activation des cellules T, le récepteur CD28 est généralement stimulé avec un anticorps agoniste présenté sur la surface de Vamp, bien que les autres récepteurs de costimulation telles que 4-1BB ont été correctement ciblée4. Protéines de signal 1 et 2 sont généralement immobilisées sur la surface des particules rigides pour synthétiser la vamp. Historiquement, vamp ont été fabriquées à partir d’une variété de matériaux, y compris en polystyrène4,5 et fer dextran6. Les systèmes plus récents utilisent des polymères biodégradables comme poly (acide lactique-co-glycolique) (PLGA) pour générer la VAMP qui peut être facilement couplé pour signaler des protéines, est destinés à l’administration directe en vivoet peut faciliter la libération de Résumé des cytokines ou des facteurs solubles pour augmenter l’activation de lymphocytes T7,8.
En plus de la présence de protéines de signal nécessaire, l’engagement du récepteur sur une surface suffisamment grande au cours de l’interaction de cellule de vamp/T est indispensable pour l’activation des cellules T. Ainsi, les paramètres physiques de la VAMP tels que la taille et la forme radicalement modifient leurs surfaces de contact disponible et influer sur leur capacité à stimuler les lymphocytes T. Vamp taille micron ont démontré d’être plus efficace à la stimulation des cellules T à leur échelle nanométrique homologues9,10. Toutefois, les nano-vamp peut avoir biodistribution supérieure et meilleur drainage vers les ganglions lymphatiques qui peuvent améliorer leur performance en vivo sur micro-vamp11. La forme est une autre variable d’intérêt pour les systèmes axés sur les particules de vamp. Vamp anisotrope ont récemment démontré pour être plus efficace que les particules isotropes à stimulation des cellules T, principalement en raison de l’interaction améliorée avec les cellules cibles couplé avec l’absorption réduite des cellules non spécifiques. Cellules fixent de préférence à l’axe long de particules ellipsoïdales, et le plus grand rayon de courbure et plus plat surface permettent plus de contact entre la vamp et les lymphocytes T12. L’axe long de particules ellipsoïdales décourage également la phagocytose, résultant en temps de circulation accrue par rapport aux particules sphériques suit en vivo administration12,,13. En raison de ces avantages, les particules ellipsoïdales véhiculent une plus grande expansion de spécifiques à l’antigène T cellules in vitro et in vivo par rapport aux particules sphériques, un effet observé à la micro et nanoscales12, 13. Il existe différentes stratégies pour fabriquer des particules anisotropes, mais minces stretching est une méthode simple et largement acceptée, utilisée pour générer un ensemble de particules diverses formes14. Suite à la synthèse, les particules sont jetés dans les films et étirés dans une ou deux dimensions à une température supérieure à la température de transition vitreuse du matériau particulaire. Le film est ensuite dissous pour récupérer les particules. Malgré l’intérêt croissant pour les particules anisotropes, les approches actuelles de fabrication axée sur les particules vamp se limitent principalement aux systèmes isotropes et méthodes de modifier la forme des particules peuvent être difficiles à mettre en œuvre, incompatible avec la synthèse de certains vamp stratégies et manque de précision et reproductibilité15. Notre technique d’étirement minces peut être effectuée manuellement ou de manière automatisée pour générer rapidement des particules anisotropes synthétisées dans une variété de polymères biodégradables, s’étendait à un format d’image désiré dans une ou deux dimensions15.
Issu de nos travaux antérieurs, nous avons développé une approche axée sur les particules biodégradable combinée avec scalable minces étirement technologie pour générer rapidement des vamp avec taille ajustable et la forme de manière standardisée pour les lymphocytes T expansion ex vivo ou en vivo. Notre stratégie de conjugaison de protéines permet de coupler les protéines d’intérêt aux groupes carboxyle sur la surface de la particule à une densité désirée, ce qui donne à ce système de vamp un haut degré de flexibilité. Nous décrivons également des méthodes pour caractériser la taille, la morphologie et la protéine de surface contenue de Vamp et d’évaluer leur fonctionnalité in vitro. Ce protocole peut être facilement adapté pour développer des cellules immunitaires ex vivo ou in vivo pour une variété d’applications immunothérapeutiques.
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Protocol
Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université Johns Hopkins.
1. fabrication de particules PLGA sphériques de taille ajustable
- Préparation des matériaux pour la synthèse de la particule
- Préparer la solution à 5 % p/p d’alcool polyvinylique (PVA).
- Ajouter 500 mL d’eau désionisée de (DI) dans un erlenmeyer avec une barre magnétique remuer et placer sur la plaque chauffante agitateur à 500 tr/min et moniteur de température avec thermomètre. Couvrir la fiole avec du papier d’aluminium pour éviter l’évaporation.
- Lorsque la température de l’eau atteint environ 70 ° C, ajouter 25 g total de PVA par petits lots au fil du temps, en attente de PVA de dissoudre avant d’ajouter plus.
- Une fois tous les PVA est dissous (généralement 30 à 60 min), laisser filtre cool et stérile de solution. Conserver à 4 ° C pour une utilisation future.
- Préparer la solution de casting de film de 10 % p/p PVA et 2 % w/w glycérol.
- Verser 500 mL de l’eau distillée dans un erlenmeyer avec une barre magnétique remuer. Ajoutez 8 mL de glycérol à température ambiante et mélanger par trituration.
- Placer le ballon sur plaque chauffante agitateur à 500 tr/min et moniteur de température avec le thermomètre. Couvrir la fiole avec du papier d’aluminium pour éviter l’évaporation.
- Lorsque la température de la solution atteint environ 70 ° C, ajouter 50 g total de PVA par petits lots au fil du temps, en attente de PVA de dissoudre avant d’ajouter plus.
- Une fois tous les PVA est dissous (généralement 60 min), laisser le filtre cool et stérile de solution en utilisant un système de filtre à vide flacon avec une porosité de 0,22 μm. Conserver à température ambiante pour une utilisation future.
- Préparer une solution PVA 50 mL 1 % w/w. Ajouter 40 mL de l’eau distillée et 10 mL de solution PVA de 5 % (fabriquée en 1.1.1) dans un bécher de 100-150 mL.
- Préparer une solution PVA 100 mL 0,5 % p/p. Ajoutez 90 mL de l’eau distillée et 10 mL de solution PVA de 5 % dans un bécher de 150 à 250 mL.
- Ajouter une barre d’agitation magnétique 0,5 % solution PVA et les introduire dans une hotte chimique sur une plaque d’agitation à température ambiante à 500 tr/min.
- Préparer la solution à 5 % p/p d’alcool polyvinylique (PVA).
- Synthèse de microparticules
- Peser 100 mg de poly (acide lactique-co-glycolique) (PLGA) dans un flacon à scintillation et les dissoudre dans 5 mL de dichlorométhane (DCM). Vortex pour dissoudre la PLGA.
- Placez homogénéisateur dans la solution PVA de 1 % de 50 mL de sorte que l’homogénéisateur est aussi proche de la base du gobelet que possible sans le toucher. Homogénéisateur et régler à la vitesse désirée — 3 200 tr/min pour les particules de diamètre 5 μm, 5 000 tr/min pour 3 μm, 15 000 t/mn pour 1 μm (augmentant l’homogénéisation vitesse diminue la taille des particules). Une fois à la vitesse désirée, ajouter la solution PLGA dans le bécher et homogénéiser pendant 1 minute.
- Après homogénéisation, verser le 1 % PVA, solution au moyen de microparticules PLGA dans la solution PVA 100 mL 0,5 % sur une assiette pour mélanger et remuer pendant au moins 4 heures pour l’évaporation des solvants dans une hotte chimique.
- Laver les particules 3 fois dans l’eau distillée.
- Verser la solution de la particule dans tubes conique de 50 mL et centrifuger à 3000 x g pendant 5 minutes. Versez surnageant, ajouter environ 20 mL de l’eau distillée.
- Remettre en suspension les particules au vortex. Une fois remis en suspension, remplissez les tubes coniques à 50 mL avec de l’eau distillée.
- Lavez à nouveau de la même façon deux fois plus.
- Synthèse de nanoparticules
- Peser 200 mg de PLGA dans un flacon à scintillation et dissoudre dans 5 mL de DCM. Vortex pour dissoudre la PLGA.
- Mettre un bécher avec 50 mL de solution de PVA 1 % dans le récipient rempli de glaçons. Placer la sonde sonicateur dans le bécher au plus près le bas que possible sans toucher. Commencer la sonication et immédiatement ajouter PLGA solution dans le bécher. Laisser agir avec une puissance de 12 W pendant 2 minutes pour générer des nanoparticules avec un diamètre approximatif de 200 nm.
- Après la sonication, verser le 1 % PVA, solution de nanoparticules PLGA dans une solution PVA 100 mL 0,5 % sur une assiette pour mélanger et remuer pendant au moins 4 heures pour l’évaporation des solvants dans une hotte chimique.
- Verser la solution de particules dans les tubes coniques de 50 mL et centrifuger à 3 000 x g pendant 5 minutes pour éliminer les microparticules. Éliminer le surnageant et versez dans des tubes à centrifuger haute vitesse.
- Laver les particules 3 fois avec l’eau distillée. Centrifuger à 40 000 x g pendant 15 minutes. Versez sur le surnageant et remettre en suspension dans l’eau distillée au vortex. Lavez à nouveau de la même façon deux fois plus.
2. fabrication de particules polymères de forme accordable
- Après avoir lavé les particules PLGA trois fois, remettre en suspension les particules dans environ 1 mL de l’eau distillée. Ajouter la solution de casting de film de particules pour la concentration de la particule finale des particules de 2,5 mg/mL.
- Pipetter, la suspension de particules en portions de 10 mL dans les plats de Pétri rectangulaire 75 x 50 mm pour les étirements unidimensionnel ou en aliquotes de 15 mL en plats de Pétri carré 100 x 100 mm pour deux dimensions qui s’étend. Enlever les bulles soit la pipette ou bulles poussant sur le côté et laisser sécher pendant la nuit dans une hotte chimique films.
- Une fois que les films sont secs, enlever les films de vaisselle en plastique avec des pincettes et couper les bords des films avec des ciseaux. Enregistrer les bords dans un tube conique de 50 mL à utiliser sous forme de particules sphériques.
- Charger un film sur la couche mince automatisé qui s’étend du dispositif par le montage d’un film dans des blocs d’aluminium. Pour 1D étirement, monter le film dans des blocs d’aluminium d’un axe de la civière (Figure 2) en plaçant les deux bords courts du film entre deux morceaux de caoutchouc néoprène. À l’aide d’une clé Allen, visser les poignées métalliques sur le dessus de caoutchouc pour maintenir le film en place. Pour les étirements 2D, monter quatre bords sur quatre blocs d’aluminium s’étirer sur les deux axes (Figure 2).
- Mesurer et noter la longueur du film entre les blocs d’aluminium sur un axe pour les étirements 1D ou les deux axes pour les étirements 2D. Calculer la distance nécessaire d’étirer le film dans une ou deux directions en fonction désirée pli-stretch.
- Placez l’appareil d’étirement film-chargé dans un four à 90 ° C et ramener le film à température pendant 10 minutes. Placer un grand bécher dans le four avec un peu d’eau.
- Film étirable.
- Lors de l’étirement est terminée, retirer l’appareil qui s’étend du four et laisser le refroidir de film à température ambiante pendant 20 minutes.
- Pour 1D étirement, couper le film hors de l’appareil qui s’étend sur les bords. Pour les étirements 2D, couper dehors et enregistrer le centre carré de film qui est étiré uniformément sur les deux axes. Placer les films dans des tubes coniques avec 2 films par tube et jeter le reste du film.
- Ajouter environ 25 mL de l’eau distillée à chaque tube à fond conique et vortex jusqu'à ce que les films sont dissous.
- Une fois que les films sont des particules dissoutes, laver 3 fois avec l’eau distillée.
- Pour les microparticules, remplir des tubes coniques à 50 mL et centrifuger à 3000 x g pendant 5 minutes, déverser du liquide surnageant, ajouter environ 20 mL de l’eau distillée et vortex pour remettre en suspension les particules.
- Pour les nanoparticules, particules de transfert pour tubes de centrifugeuse de haute vitesse et centrifuger à 40 000 x g pendant 15 minutes, versez surnageant, ajouter environ 20 mL de l’eau distillée et vortex pour remettre en suspension les particules.
- Après le troisième lavage, remettre en suspension des particules dans environ 1 mL de l’eau distillée. Noter le poids du tube microcentrifuge et ajouter des particules dans le tube. Congeler des particules dans un congélateur à-80 ° C pendant 1 heure ou congélation flash dans l’azote liquide. Une fois congelé, lyophiliser particules durant la nuit.
- Une fois lyophilisé, peser des particules dans le tube de microcentrifuge et soustraire le poids enregistré du tube vide pour déterminer le poids des particules lyophilisés.
3. surface Protein conjugaison pour créer des cellules présentatrices de l’antigène artificiel
- Préparer 2-(N-Morpholino) tampon d’ethanesulfonic acide (MES). Préparer une solution de 0,1 M de MES dans l’eau et ajuster le pH à 6.0 par titrage avec 1M d’hydroxyde de sodium (NaOH).
- Resuspendre lyophilisée PLGA/PBAE micro/nanoparticules à 20 μg/mL dans le tampon MES au vortex. Remplir un tube de microcentrifuge polypropylène avec 900 μL de tampon de MES et ajouter 100 μL de la solution de particules dans le tube.
- Préparer la solution d’EDC/NHS. Dissoudre 40 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) et 48 mg de N-hydroxysulfoxuccinimide (NHS) dans 1 mL de tampon de MES.
- Ajouter 100 μL EDC/NHS solution pour les particules et le vortex pour mélanger.
- Incuber le tube sur un onduleur à température ambiante pendant 30 minutes.
- Tournez en bas des microparticules à 5 000 x g pendant 5 minutes, ou nanoparticules à 17 000 x g pendant 5 minutes. Jeter le surnageant et remettre en suspension dans 1 mL de PBS par Vortex (microparticules) ou la sonification à 2-3 W pendant 5 secondes (nanoparticules).
- Pour les microparticules, ajouter 8 μg de la protéine du signal désiré 1 et 10 μg de anti-souris CD28 (clone 37,51) aux particules. Pour les nanoparticules, ajouter 16 μg signal 1 et 20 μg anti-souris CD28. Ajouter PBS pour porter le volume du tube à 1,1 mL.
- Incuber le tube sur un variateur de fréquence à 4 ° C durant la nuit.
- Le lendemain, laver les particules. Tournez en bas des microparticules à 5 000 x g pendant 5 minutes, ou nanoparticules à 17 000 x g pendant 5 minutes. Jeter le surnageant et remettre en suspension des particules dans 1 mL de PBS stérile par Vortex (microparticules) ou la sonication à 2-3 W pendant 5 secondes (nanoparticules). Répéter deux fois.
- Remettre en suspension les particules à la concentration voulue dans le milieu de culture pour un usage immédiat. Pour le stockage à long terme, remettre en suspension les particules à 10 mg/mL dans une solution de saccharose de 100 mM. Geler, lyophiliser et stocker les particules à-80 ° C.
4. caractérisation et évaluation de Vamp
- Caractérisation de vamp taille et la forme (Figure 3)
- Caractériser les microparticules de taille et de forme par imagerie de particules à l’aide de la microscopie électronique à balayage (SEM). Pour SEM particules lyophilisées d’imagerie, étalées sur une bande carbone ont adhéré à un aluminium louvoyer et bredouiller manteau avec or-palladium.
- Analyser la taille et les proportions de particules à l’aide de logiciels d’analyse image.
- Pour déterminer la taille des particules, définissez l’échelle à l’aide de la barre d’échelle et mesurer le diamètre des particules. Répétez pour environ 100 particules déterminer le diamètre moyen de particules et de générer un histogramme de tailles de particules.
- Pour déterminer le ratio d’aspect, mesurez la distance entre l’axe longitudinal et l’axe court des particules et diviser le long axe par axe court. Répétez pour environ 50 particules de chaque forme pour déterminer les proportions de moyenne des particules pour chaque forme et générer des histogrammes.
- Caractériser des nanoparticules de taille et de forme par imagerie de particules à l’aide de la microscopie électronique à transmission (TEM). Analyser la taille et les proportions des nanoparticules avec logiciel d’analyse d’image tel que décrit en 5.1.2. Vous pouvez également mesurer la taille des nanoparticules sphériques utilisant la diffusion dynamique de la lumière (DLS) ou nanoparticules suivi d’analyse (NTA).
- Efficacité de la protéine conjugaison
- Préparer la VAMP selon les méthodes 1 à 3, mais étape 3.7 utiliser le signal fluorescent étiquetés 1 protéine et CD28 anti-souris. Après conjugaison et lavage, resuspendre la VAMP dans 1 mL de PBS pour une concentration finale de 2 mg/mL vamp.
- Élaborer des normes de la protéine dans une microplaque de 96 puits en polystyrène noire. Ajouter 5 μg de protéines du signal fluorescent étiquetés 1 à PBS dans le premier puits de la plaque et faire des dilutions de 1:2 10 dans du PBS à travers la ligne de la plaque. Laisser le dernier vide bien. Répétez cette étape pour générer un autre ensemble de normes avec anti-CD28 fluorescent étiquetés.
- Pipetter 100 μL de la solution de vamp dans puits répétées de la microplaque de polystyrène noire en trois exemplaires.
- Lire la fluorescence sur un lecteur de fluorescence dans les longueurs d’onde appropriées. Les lectures de fluorescence dans les normes de la protéine permet de générer des courbes d’étalonnage pour chaque anticorps fluorescents. À l’aide de la courbe d’étalonnage, calculer les concentrations de signal 1 et anti-CD28 dans chaque puits échantillon et ensuite de calculer la quantité de protéine de surface et d’efficacité de conjugaison (Figure 4 a, Figure 5 a).
- Évaluation de VAMP pour in vitro la stimulation des cellules T CD8 +
- Préparer les médias B' (RPMI additionné L glutamine, 10 % FBS, solution d’acides aminés Non essentiels 1 %, pyruvate de Sodium 1 %, solution de 1 % de vitamines MEM, 92 μM β-mercaptoéthanol et 10 ng/mL ciprofloxacin 30 U/mL IL-2.
- Sacrifier une souris noire 6 par l’exposition du dioxyde de carbone.
- Récolter la rate de la souris selon un protocole établi précédemment16. Recueillir la rate dans un tube conique de 50 mL avec 10 - 15 mL de PBS. À l’aide d’un pilon, écraser la rate à travers un tamis de cellule de 70 µm dans un tube conique de 50 mL. Au cours de brassage, lavez le tamis avec 40 mL de PBS.
- Tournez les splénocytes à 300 x g pendant 5 minutes. Décanter le liquide surnageant et remettre en suspension les splénocytes dans 4 mL de tampon de lyse Ack à lyser les globules rouges. Permettre le tube s’asseoir non perturbés pendant une minute, puis ajoutez les PBS pour porter le volume dans le tube de 20 mL.
- Tournez les cellules à 300 x g pendant 5 minutes. Décanter le liquide surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1 mL de PBS. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
- Faire tourner les cellules à 300 x g pendant 5 minutes et remettre en suspension dans le volume souhaité de tampon de séparation cellulaire. Isoler les cellules T CD8 + de la suspension de la cellule à l’aide d’une sélection négative de CD8 + kit d’isolation de lymphocytes T, suivant le protocole du fabricant.
- Après la séparation magnétique, spin des cellules T CD8 + à 300 x g pendant cinq minutes et retirer le tampon de séparation cellulaire. Remettre en suspension des cellules dans 1 mL de PBS et compter les cellules non vides. Cellules avec carboxyfluorescéine succinyl ester (CFSE) selon le protocole du fabricant de l’étiquette.
- Incuber 8 333 lymphocytes t CD8 + et 0,0833 mg (ou dose souhaitée) de vamp dans les milieux de 150 μL B' à chaque puits d’un 96 bien U-traitée pour la culture de tissu plaque de fond.
- Incuber à 37 ° C pendant 7 jours. Après 3-4 jours, actualisez le milieu de culture en ajoutant un milieu frais 75 μl à chaque puits.
- Après 3 jours d’incubation, analyser CFSE étiquetés cellules sur un cytomètre en flux afin d’évaluer la prolifération. Chaque pic sur l’histogramme CFSE de cytométrie de flux représente une génération de cellules en raison de la dilution CFSE avec chaque division cellulaire successifs.
- Après 7 jours, utilisez un hémocytomètre pour compter le nombre de cellules dans chaque puits. Avant le comptage, colorer les cellules mortes avec une solution de bleu de Trypan. Exclure les cellules mortes de globules final. Normaliser la concentration de la dernière cellule de la concentration initiale pour calculer le pli-expansion (Figure 4 et Figure 5).
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Representative Results
Une représentation schématique du film mince 2D automatisé, qui s’étend de dispositif est donnée à la Figure 1. Un schéma et une description pour un film mince de 1D qui s’étend du dispositif est donné en Ho et al.17 la civière est construite à partir de pièces d’aluminium à l’aide de techniques d’usinage et de fraisage standard. Semblable à la civière 1D, la civière 2D se compose de poignées métalliques et de rails de guidage. Vis de plomb bidirectionnel sont utilisés pour traduire linéaires à mouvement de rotation. Les vis de plomb sont les attachés via les robinets mécaniques pour moteurs identiques avec un couple suffisant. Les fils de commande de moteur pas à pas 8 peuvent être soudées sur connecteurs amphenol résistant à la chaleur 8 broches pour une fixation facile sur la console de contrôle dans un four à film mince qui s’étend. Fil de polytétrafluoroéthylène (PTFE) recouvert d’une longueur suffisante doit être utilisé pour connecter les moteurs pas à pas pour les pilotes dans la console de contrôle. Le schéma de contrôle informatiques recommandées est donné dans la Figure 1 a. Les deux moteurs doivent être connectés par le biais de câblage résistant à la chaleur à 2 conducteurs indépendants. Les deux pilotes doivent alors être connectés à un microcontrôleur en interface avec un ordinateur. Axe y sorties du microcontrôleur et les conducteurs doivent être reliés à l’axe des abscisses. Les pilotes et le microcontrôleur nécessitent une alimentation externe. Avant de brancher l’alimentation sur ces trois composantes, il est recommandé d’insérer un fusible A 4 entre chacune des connexions sous tension pour protéger les pièces contre les surcharges de courant. Enfin, le microcontrôleur peut être relié via une entrée Port parallèle à un ordinateur en utilisant une DB25 mâle à mâle câble. Le système électronique utilisé pour contrôler les moteurs pas à pas est sensibles à la chaleur et doit donc être placé en dehors de toute source de chaleur (comme un four) utilisée au cours de l’opération pour chauffer les films minces à une température suffisante pour permettre l’étirement. Bien que les moteurs recommandés sont résistants à la chaleur jusqu’aux températures spécifiées dans le présent protocole pour étirer les particules, les moteurs et les pilotes seront accumulent la chaleur supplémentaire alors qu’ils sont attachés à l’alimentation principale. Par conséquent, il est recommandé que l’appareil seulement être allumé pendant la période d’un film qui s’étend pour minimiser l’accumulation de chaleur potentielle.
PLGA nano - et microparticules ont été synthétisés en utilisant les techniques d’émulsion unique décrite dans le présent protocole et photographié à l’aide de TEM (Figure 3 a) et SEM (Figure 3 b), respectivement. NANOPARTICULES sphériques avaient un diamètre de 237.3 nm ± 4,0 mesurée par DLS et 224 nm telle que mesurée par le LTN (Figure 3). Microparticules ont été synthétisés par homogénéisation à 5000 tr/min pour générer des particules sphériques d’un diamètre moyen de 3 ± 1 μm (Figure 3D). Les particules étaient étirés à l’aide du film automatisé qui s’étend de dispositif à 90 ° C dans une seule dimension pour générer prolate ellipsoïdal nano - et microparticules et s’étendait à 70 ° C en deux dimensions pour générer des particules ellipsoïdales aplatie aux pôles. Les allongements des microparticules de toutes formes de trois ont été analysés en mesurant l’axe le plus long et la distance axe court des particules et en divisant les deux. Microparticules sphériques avaient un aspect ratio de 1,05 ± 0,04, bien que 1D étiré prolate particules ellipsoïdales avaient un plus grand ratio d’aspect de 3,6 ± 0,8 (Figure 3E). 2D étirées particules ellipsoïdes Oblates avaient un aspect ratio de 1,2 ± 0,2, maintenir à peu près un allongement d’un.
Chimie de réaction EDC/NHS servait à conjuguer un fluorescent étiqueté chargés en peptide MHC dimère et anti-CD28 anticorps IgG à la surface des particules PLGA étirées et sphériques. Conjugaison efficacité résultats démontrent des quantités similaires de protéine à la surface de l’ellipsoïde et sphérique micro-VAMP (Figure 4 a) et de nano-VAMP (Figure 5 a) et démontrent que la protéine accouplement pendant la synthèse de vamp se produit dans un manière de concentration-dépendante. Pour évaluer l’effet de forme sur la fonctionnalité de Vamp, sphérique et prolate vamp ellipsoïdal conjugués avec chargement gp100 MHC IgG dimère et anti-CD28 ont été utilisées pour stimuler les cellules T CD8 + transgéniques PMEL. Les cellules T ont été étiquetés avec CFSE et évaluées par cytométrie en flux après 3 jours pour évaluer la prolifération (Figure 4 b, 5 b). Prolate vamp ellipsoïdal trouvées pour induire des niveaux plus élevés de prolifération des lymphocytes T à doses infra saturantes que vamp sphérique, avec la meilleure séparation obtenue à une dose de 0,01 mg. Après 7 jours, les cellules T ont été comptés manuellement. Vamp ellipsoïde allongé plus efficacement stimulée par les cellules de T par rapport à leurs homologues sphériques à la micro-échelle (Figure 4) et l’échelle nanométrique (Figure 5), et expansion des cellules de T de dose-dépendante a été observée.
Figure 1 : représentation schématique de la civière de film mince automatisé. (A) Représentation schématique du pupitre de commande pour civière de film mince. (B) Représentation schématique du matériel mécanique pour civière de film mince. (Gauche) Vue aérienne de matériel mécanique. (Droit) Coupe transversale du mécanisme de films minces de préhension. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : photographies de civière assemblé minces automatisé pour étirer les particules de polymères en formes anisotropes. La couche mince 2D qui s’étend de dispositif est composée de deux axes avec monture en aluminium qui tenez le film. Les deux axes contiennent des vis dans des directions opposées afin qu’ils se déplacent indépendamment de l’autre. Pour automatiser la procédure d’étirement, un microcontrôleur USB lié est relié à deux conducteurs de moteur pas à pas qui transmettent les signaux aux moteurs pas à pas unipolaire moteurs via un câble thermique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : analyse de taille et les proportions de particules PLGA sphériques et ellipsoïdales. (A) images TEM et (B) SEM de sphérique, 1D étiré prolate ellipsoïdal et 2D étirée oblat ellipsoïde PLGA (A) nanoparticules et microparticules (B). (C) sphérique nanoparticules ont été dimensionnés par NTA et établie à 224 nm de diamètre. Images de SEM de PLGA microparticules ont été analysées (D) granulométrie des particules sphériques et allongements (E) de toutes les formes de particules. (C) reproduite et adaptée avec autorisation du petit13, Copyright Wiley-VCH 2015. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : caractérisation et l’évaluation fonctionnelle des sphérique et allongé ellipsoïdaux micro-vamp. (A) efficacité la conjugaison de fluorescent marqué chargés en peptide MHC dimère et anti-CD28 anticorps de type IgG sur la surface de microparticules ellipsoïdes allongés et sphériques. (B) lymphocytes t CD8 + ont été étiquetés avec CFSE et incubées avec micro-vamp sphérique et 1D-tendu à des doses de 0,01, 0,1 et 1 mg, ou contrôles non apparenté. Après 3 jours, les cellules ont été évalués par cytométrie de flux pour évaluer la prolifération. Lymphocytes T (C) ont été également évalués après 7 jours de comptage manuel. Des numérations globulaires ont été normalisées pour le compteur initial pour calculer pli-expansion. Pour la comparaison entre l’expansion prolate pli ellipsoïdal et sphériques, * = p < 0,05, ** = p < 0,01, et *** = p < 0,001. Barres d’erreur représentent l’écart-type de la moyenne (SEM) pour 3 répétitions. Reproduit et adaptée avec autorisation de biomatériaux12, Copyright Elsevier 2014. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : caractérisation et l’évaluation fonctionnelle des sphérique et allongé ellipsoïdaux nano-vamp. (A) efficacité la conjugaison de fluorescent marqué chargés en peptide MHC dimère et anti-CD28 anticorps à la surface des nanoparticules ellipsoïdes allongés et sphériques. (B) lymphocytes t CD8 + ont été étiquetés avec CFSE et incubées avec sphérique et prolate ellipsoïdal nano-vamp de pli-stretch différents à des doses de 0,01, 0,1 et 1 mg. Après 3 jours, les cellules ont été évalués par cytométrie de flux pour évaluer la prolifération. (C) cellules T incubés avec des particules ellipsoïdales allongées de la variation de tronçon de pli (allant de 1,5 à 3,5) ont également évalués après 7 jours de comptage manuel. Nombre de cellules ont été normalisé à une condition non traitée pour calculer pli-expansion. * = p < 0,05, ** = p < 0,01, et *** = p < 0,001 par rapport à sphériques. Barres d’erreur représentent l’écart-type de la moyenne (SEM) pour 3 répétitions. Reproduit et adaptée avec autorisation du petit13, Copyright Wiley-VCH 2015. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Ce protocole décrit une méthode polyvalente pour la génération précise des particules de polymères anisotropes. La couche mince qui s’étend de la technique décrite ici est évolutif, hautement reproductible et peu coûteux. Des techniques alternatives pour générer des particules anisotropes souffrent de nombreuses limites, y compris le coût élevé, un débit faible et limitée de granulométrie. La couche mince qui s’étend de la démarche est également avantageuse car les particules sont modifiées afin d’être anisotrope après synthèse et, par conséquent, est compatible avec un large éventail de tailles de particules et de techniques de synthèse. Figure 1 détaille le programme d’installation de l’automatisation qui s’étend à deux dimensions. Ce dispositif peut également servir sans les composants électroniques en tournant manuellement les vis jusqu'à ce que le film a atteint le degré souhaité de l’étirement. Cependant, nous avons constaté que le processus automatisé est beaucoup plus cohérente et plus rapide que le fonctionnement manuel15. Diverses techniques ont été développées pour synthétiser des particules anisotropes, comme microfluidique approches17,18,19, couche par couche enduit21et autres approches ascendantes synthèse21 ,,22. Cependant, ces approches ne permettent pas de forte maîtrise de la géométrie de particules et ne sont pas aussi polyvalents en termes de formes qui peuvent être générés et particules de matières qui peuvent être utilisés. Une méthode populaire de haut en bas pour fabriquer des particules non sphériques est la réplication de particules Non mouillant modèles (PRINT)24. Bien que PRINT permet un contrôle précis sur la forme des particules, il nécessite des machines chères et n’est pas aussi accessible et simple à mettre en oeuvre la couche mince qui s’étend de la méthode.
La technique de l’émulsion unique peut servir à fabriquer des particules PLGA de tailles variées, allant de la nano à micro-échelle12,13. Par variable amplitude de vitesse ou la sonication homogénéisation, la taille au moyen de microparticules et nanoparticules, respectivement, peut être modulée. Une fois que les particules sphériques ont été générées, la couche mince qui s’étend de la méthode décrite ici peut servir à déformer les particules dans diverses formes15. Dans ce protocole, nous décrivons la génération de particules ellipsoïdales allongées et aplatie aux pôles en étirant en une ou deux dimensions, respectivement. Particules sphériques sont jetés dans une mince pellicule de plastique qui est chauffée au-dessus de la température de transition vitreuse de PLGA et étirée dans une ou deux dimensions à déformer les particules. Les proportions des particules est très contrôlable. En ajustant le degré d’étirement du film, les proportions des particules peut être modulée, et nous avons trouvé que ce ratio d’aspect de particule mesurée est fortement corrélé avec la valeur prédite12,13. Diverses autres formes peuvent être générés en modifiant la température pendant l’étirement ou le degré d’étirement. Par exemple, biconcaves particules discoïdale ressemblant à la forme des globules rouges peuvent être générés par l’étirement de microparticules 1,5 fois en deux dimensions à 90 ° C. 15. ce film qui s’étend de la technique a également été utilisé pour transformer des particules sphériques de polystyrène en beaucoup de formes anisotrope, y compris les vers, les tonneaux et les disques rectangulaire21. Le film qui s’étend de dispositif peut être utilisé en contrôlant manuellement les vis ou le périphérique peut être automatisé, comme illustré à la Figure 1 pour rendre le processus plus efficace et cohérente15. Cette technique simple produit fiable des particules anisotropes qui conservent leur forme sous conditions physiologiques24. En outre, cette méthode a été appliquée aux autres matériaux polymères, en outre aux PLGA, telles que polycaprolactone (PCL) et particules hybrides fait de PLGA et poly (esters bêta-amino) (PBAE).
Ce protocole décrit également comment les particules PLGA de dimensions variées et peuvent être conjugués avec les protéines de surface nécessaires pour l’activation des lymphocytes T CD8 + servir de vamp. Les protéines peuvent être conjugués par covalence à anisotrope et sphériques PLGA micro - et nanoparticules par EDC/NHS véhiculée par le couplage des amines primaires sur les protéines à des groupes carboxyle sur la surface de la particule. L’efficacité de la conjugaison de protéine peut être mesurée en couplant des protéines fluorescent étiquetés à la surface des particules, comme décrit dans le présent protocole, et nous avons trouvé que cette technique couple protéine à particules à 15-20 % efficacité12, 13. Prolate ellipsoïdal micro - et nanoparticules vamp sont plus efficaces que leurs homologues sphériques à l’activation T CD8 + cellules de prolifération et expansion in vitro12,13. Vamp ellipsoïde ont amélioré la liaison à et interaction avec les cellules T en raison de leur plus grande surface de contact12. Particules anisotropes ont également des propriétés supérieures sur les particules sphériques en vivo grâce à leur biodistribution accrue et la résistance à la phagocytose13. Cette plateforme est très modulaire et a le potentiel pour s’adapter aux nombreuses autres applications de livraison de drogue. En utilisant cette procédure, des particules de polymères d’accordable forme et la taille peuvent être générés et la surface de la particule peut se conjuguer avec une protéine d’intérêt.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
EBA (DGE-1746891) et KRR (DGE-1232825) remercie le programme de bourses de recherche diplômés NSF pour prise en charge. RAM Merci le National Research Service Award NIH NCI F31 (F31CA214147) et les récompenses de réalisation pour les bourses scientifiques College pour le soutien. Les auteurs remercient les NIH (R01EB016721 et R01CA195503), les recherches pour prévenir la cécité James et Carole Free Catalyst Award et l’Institut de Bloomberg-Kimmel JHU pour immunothérapie des cancers pour la prise en charge.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly(vinyl alcohol), MW 25000, 88% hydrolyzed | Polysciences, Inc. | 02975-500 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Digital Thermometer | Fluke | N/A | Model name: Fluke 52 II |
| Immersion Temperature Probe | Fluke | N/A | Model name: Fluke 80PK 22 |
| Digital Hotplate & Stirrer | Benchmark Scientific | H3760-HS | |
| Multipoint stirrer | Thermo Fisher Scientific | 50093538 | |
| Resomer RG 504 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide) | Sigma-Aldrich | 719900 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | D65100 | |
| Homogenizer | IKA | 0003725001 | |
| Sonicator | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Model number: VC 505 |
| Sonicator sound abating enclosure | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0427 |
| Sonicator probe | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0220 |
| Sonicator microtip | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0423 |
| High speed centrifuge | Beckman Coulter | N/A | Model number: J-20XP (discontinued), alternative model: J-26XP |
| High speed centrifuge rotor | Beckman Coulter | 369691 | Model number: JA-17 |
| High speed polycarbonate centrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific | 3118-0050 | 50 mL, screw cap |
| Rectangular disposable petri dish | VWR International | 25384-322 | 75 x 50 x 10 mm |
| Square disposable petri dish | VWR International | 10799-140 | 100 mm x 100 mm |
| LEAF Purified anti-mouse CD3ε Antibody | Biolegend | 100314 | |
| InVivoMab anti-mouse CD28, clone 37.51 | Bio X Cell | BE0015-1 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | E6383 | |
| N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt | Sigma-Aldrich | 56485 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100212 | |
| APC anti-mouse CD28 Antibody | Biolegend | 102109 | |
| Corning 96 Well Solid Polystyrene Microplate | Sigma-Aldrich | CLS3915 | flat bottom, black polystyrene |
| Protein LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431081 | |
| RPMI 1640 Medium (+ L-Glutamine) | ThermoFisher Scientific | 11875093 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | Heat Inactivated, sterile-filtered |
| Ciprofloxacin | Sigma-Aldrich | 17850 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Recombinant Human IL-2 (carrier-free) | Biolegend | 589102 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| MEM Vitamin Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11120052 | |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyi Biotech | 130-104-075 | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFisher Scientific | C34554 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| MACS Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Flow Cytometer | Accuri C6 | ||
| Synergy 2 Multi-Detection Microplate Reader | BioTek | ||
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi BIotech | 130-091-221 | |
| Cell Strainer | ThermoFisher Scientific | 22363548 | Sterile, 70 µm nylon mesh |
| ACK Lysing Buffer | ThermoFisher Scientific | A1049201 | |
| C57BL/6J (Black 6) Mouse | The Jackson Laboratory | 000664 | Male, at least 7 weeks old |
| U-Bottom Tissue Culture Plates | VWR | 353227 | Sterile, 96-well tissue culture treated polystyrene plates |
| 40 V DC Power Supply | Probotix | LPSK-4010 | |
| PTFE Coated Wire | Mouser | 602-5858-100-01 | This is for a 100 ft. spool but an equivalent wire will work |
| Stepper Motor Driver | Probotix | MondoStep5.6 | |
| IDC Connector Kit | Probotix | IDCM-10-12 | |
| Microcontroller | Probotix | PBX-RF | |
| 4A Fuses | Radio Shack | 2701026 | Equivalent fuses will work as well |
| DB25 Male to Male Cable | Probotix | DB25-6 | |
| USB-A to USB-B Cable | Staples | 2094915 | Equivalent cable will work as well |
| 8-Pin Amphenol Connectors Male and Female | Mouser | 654-97-3100A-20-7P and 654-97-3106A20-7S | |
| Stepper Motor | Probotix | HT23-420-8 | |
| Right Hand Lead Screw | Roton | 60722 | |
| Left Hand Lead Screw | Roton | 60723 | |
| Screws | McMaster Carr | 92196A151 | |
| Neoprene Rubber | McMaster Carr | 8698K51 | |
| Right Handed Flanged Lead Nut | Roton | 91962 | |
| Left Handed Flanged Lead Nut | Roton | 91963 | |
| Linux Control Computer | Probotix | LCNC-PC | Any computer with matching specification and Linux operating system will work |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma-Aldrich | CLS431097 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4 % | ThermoFisher Scientific | 15250061 |
References
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