Summary

تنبيب الشفوي من الزرد الكبار: نموذج لتقييم امتصاص الأمعاء للمركبات النشطة بيولوجيا

Published: September 27, 2018
doi:

Summary

وصف البروتوكول تنبيب الزرد الكبار مع البيولوجية؛ ثم تشريح وإعداد الأمعاء للخلوي والفحص المجهري [كنفوكل] وقبكر. هذا الأسلوب يسمح لإدارة مركبات النشطة بيولوجيا لرصد امتصاص الأمعاء والتحفيز المناعي المحلية آثار. أنها ذات صلة لاختبار المعوية ديناميات الوقائية عن طريق الفم.

Abstract

معظم مسببات الأمراض تغزو الكائنات عن طريق الغشاء المخاطي بهم. وهذا صحيح بصفة خاصة في الأسماك كما أنهم يتعرضون باستمرار لبيئة مياه الغنية بالجراثيم. تطوير أساليب فعالة لإيصال الفم immunostimulants أو اللقاحات، وتنشيط الجهاز المناعي ضد الأمراض المعدية، مرغوب فيه للغاية. في استنباط أدوات وقائية، هناك حاجة جيدة نماذج تجريبية لاختبار أدائها. هنا، نحن إظهار أسلوب تنبيب الشفوي من الزرد الكبار ومجموعة من الإجراءات لتشريح وإعداد الأمعاء للخلوي ومجهرية [كنفوكل] وتحليل سلسلة من ردود الفعل (qPCR) بوليميريز الكمية. مع أحكام هذا البروتوكول، ونحن تحديداً إدارة وحدات تخزين ما يصل إلى 50 ميليلتر الأسماك تزن حوالي 1 ز ببساطة وسرعة، دون الأضرار بالحيوانات. هذا الأسلوب يسمح لنا باستكشاف مباشرة في فيفو امتصاص مركبات فلوريسسينتلي المسمى مخاطية الأمعاء، وقدرة immunomodulatory مثل البيولوجي في الموقع المحلي بعد التنبيب. عن طريق الجمع بين أساليب المصب مثل التدفق الخلوي، علم الأنسجة، وقبكر ومجهرية [كنفوكل] الأنسجة المعوية، يمكننا أن نفهم كيف إيمونوستيمولانتس أو اللقاحات قادرة على عبور الحواجز المخاطية المعوية، وتمر من خلال بروبريا الصفيحة، و تصل العضلات، وممارسة تأثير على جهاز المناعة المخاطية المعوية. يمكن استخدام النموذج لاختبار المرشح عن طريق الفم الوقائية ومنظومات إيصالها أو تأثير المحلية أي مركب النشطة بيولوجيا تدار شفويا.

Introduction

والهدف من هذه المادة وصف في عمق طريقة واضحة تنبيب الشفوي من الزرد، جنبا إلى جنب مع الإجراءات المتلقين للمعلومات المفيدة المرتبطة بها. تنبيب الشفوي استخدام الزرد أصبح نموذج عملي في دراسة ديناميات الأمراض المعدية واللقاحات الفموية/منبه المناعة والإقبال على المخدرات/نانوحبيبات ونجاعة وحصانة المخاطية المعوية. على سبيل المثال، استخدمت الزرد تنبيب الشفوي في دراسة الإصابة بكتريا مارينوم و بكتريا بيريجرينوم 1. لوفمو et al. كما استخدمت بنجاح هذا النموذج لتقديم جسيمات نانوية و M. marinum للقناة الهضمية الزرد الكبار2. وبالإضافة إلى ذلك، يستخدم تشن et al. الزرد تنبيب الشفوي لإظهار أن المخدرات مغلفة بجسيمات نانوية، عندما تدار عبر المسالك المعدية المعوية، ونقلت عبر حاجز الدم الدماغ3. أجرى المؤلفون هذه تنبيب استناداً إلى أسلوب جوفاجي وصف كوليمور et al. 4 مع بعض التعديلات. بيد أنها لا توفر بروتوكول مفصلة للغاية وصف الإجراء تنبيب الشفوي. وهنا نقدم طريقة للفم تنبيب للكبار الزرد بناء على كوليمور et al. 4 ونحن كذلك تشمل إعداد الأمعاء لتحليل المتلقين للمعلومات ذات الصلة الخلوي والفحص المجهري [كنفوكل] و qPCR.

الأمعاء، ولا سيما في الغشاء المخاطي هو الخط الأول للدفاع ضد العدوى والموقع الرئيسي لامتصاص المغذيات5. عند الخلايا الظهارية وعرض مستضد الخلايا ضمن الحواجز المخاطية يرون إشارات الخطر، يتم تشغيل استجابة فورية للمناعة فطرية. المقبل، هي الاستجابة المناعية التكيفية محددة للغاية الذي حددته تي وب لمفاوية6،7. تطوير اللقاحات الفموية مجال تركيز الحالي في اللقاحات. هذه اللقاحات ستكون أداة فعالة لحماية الكائنات الحية في مواقع مكشوفة نظراً لاستجابة محددة من الخلايا المناعية في8،الأنسجة اللمفاوية المرتبطة بالغشاء المخاطي (الشعير)9. في تربية الأحياء المائية، واللقاحات المخاطية قد مزايا واضحة مقارنة باللقاحات عن طريق الحقن. أنها هي العملية لتطعيم، أقل كثيفة العمالة وهي أقل إرهاقاً للأسماك ويمكن أن تدار لصغار الأسماك. ومع ذلك، يجب أن تصل إلى المرشحين لقاح مخاطية الجزء الثاني المتعلق بالقناة الهضمية دون يجري التشويه والتحريف في البيئة عن طريق الفم. أنها أيضا يجب أن تعبر الحواجز المخاطية بغية الوصول إلى مستضد تقديم الخلايا (Apc) للحث على الاستجابات المحلية و/أو النظمية10. ومن ثم اختبار امتصاص المخاطية التي حققها مرشح المستضدات الشفوي ومنظومات إيصالها، فضلا عن الاستجابة المناعية أثارت، أمر ضروري في تطوير اللقاحات الفموية.

في إطار الطب الحيوي، وضع نموذج لاختبار الآثار البيولوجية للمركبات بعد تنبيب الشفوي باهتمام متزايد. العديد من الميزات التشريحية والفسيولوجية للامعاء يتم المحافظة عليها بين الأنساب بيلاتيريان، مع الثدييات والأسماك العظمية11. نموذج تنبيب الشفوي هذا متصلاً بتحليل المتلقين للمعلومات يمكن أن يكون أداة لتوفير رؤى في البيولوجيا البشرية، فضلا عن ساحة اختبار للبيولوجي أو المركبات الأخرى في فيفو.

يمكن أن يؤديها البروتوكول تنبيب الشفوي إلى عامل واحد، مثلاً، إدارة بنجاح يصل إلى 50 ميليلتر من تعليق نانوحبيبات بروتين الأسماك تزن 1 غ، مع معدل البقاء على قيد الحياة عالية. الإجراء إجراء بسيط لإعداد وسريعة؛ يمكن تنبيب الأسماك 30 في ح 1. البروتوكول المتعلق بإعداد الأمعاء هو المفتاح لتوفير نوعية الخلايا والأنسجة وعينات لتحليلها لاحقاً. ترد أمثلة للنتائج النهائية التي تظهر فائدة البروتوكول في الحصول على البيانات ذات الصلة بامتصاص الأمعاء وعزل الحمض النووي الريبي نوعية ل qPCR. البروتوكول ستكون ذات فائدة كبيرة لأولئك الذين يحتاجون إلى نموذج مناسب لاختبار ديناميات الوقائية عن طريق الفم أو غيرها من المركبات في الأمعاء.

Protocol

إذن جميع الإجراءات التجريبية التي تنطوي على الزرد (دانيو rerio) لجنة الأخلاقيات التابعة لجامعة المستقلة دي برشلونة (سيه رقم 1582) يتفق مع “المبادئ التوجيهية الدولية” “البحوث المتعلقة بالحيوانات” ( EU 2010/63). أجريت جميع التجارب مع الزرد يعيش في 26-28 درجة مئوية. 1. إعداد المعدات التنب…

Representative Results

الزرد (متوسط الوزن: 1.03 ± ز 0.16) من الجنس المختلط تم تنبيب بنجاح مع البروتين المؤتلف مختلفة جسيمات نانوية (البكتيرية إدراج الهيئات) باستخدام لدينا جهاز محلية الصنع تنبيب الشفوي (الشكل 1). لدينا بنجاح إجراء تنبيب الشفوي وتحقق من معدل وفيات منخفض متوسط النسبة م?…

Discussion

هذا البروتوكول تحسين تقنية هو موضح سابقا تنبيب الشفوي من كوليمور et al. 4 لدينا بروتوكول يصف بالتفصيل طريقة تنبيب الشفوي ويشمل إعداد الأمعاء لتحليلات المتلقين للمعلومات. لدينا طريقة تحسين سرعة التلاعب الأسماك السماح لشخص واحد لتنفيذ البروتوكول كله سريعاً، دون تباين كبير ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل المنح المقدمة من الوزارة الإسبانية للعلوم واللجنة الأوروبية والصناديق عجور للمجلة (AGL2015-65129 آر مينيكو/FEDER وعجور 2014SGR-345). RT يحمل دكتوراه قبل منحة دراسية من عجور (إسبانيا)، ي ي وأيده على زمالة دكتوراه من “مجلس المنح الدراسية الصيني” (الصين) وتقرير وطني معتمد من قبل البرنامج رامون y كيال (تأهيل-2010-06210، 2010، مينيكو). ونحن نشكر الدكتور توريالبا على مشورة الخبراء في إنتاج البروتين، باربا أ من “ميكروسكوبيا دي سيرفي” والدكتور م. كوستا من “سيتوميتريا دي سيرفي” للمستقلة جامعة برشلونة للمساعدة التقنية مفيدة.

Materials

Silicon tube Dow Corning 508-001 0.30 mm inner diameter and 0.64 mm outer diameter
Luer lock needle Hamilton 7750-22 31 G, Kel-F Hub
Luer lock syringe Hamilton 81020/01 100 μL, Kel-F Hub
Filtered pipette tip Nerbe Plus 07-613-8300 10 μL
MS-222 Sigma Aldrich E10521 powder
10x PBS Sigma Aldrich P5493
Filter paper  Filter-Lab RM14034252
Collagenase Gibco 17104019
DMEM  Gibco 31966 Dulbecco's modified eagle medium
Penicillin and streptomycin Gibco 15240
Cell strainer Falcon 352360
CellTrics filters  Sysmex Partec 04-004-2326 (Wolflabs) 30 µm mesh size filters with 2 mL reservoir
Tissue-Tek O.C.T. compound SAKURA 4583
Plastic molds for cryosections SAKURA 4557 Disposable Vinyl molds. 25 mm x 20 mm x 5 mm
Slide Thermo Scientific 10149870 SuperFrost Plus slide
Cover glasses Labbox  COVN-024-200 24´24 mm
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich 158127
Atto-488 NHS ester Sigma-Aldrich 41698
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761
DMSO Sigma-Aldrich D8418
Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit Promega AS1340
1-Thioglycerol/Homogenization solution Promega Inside of Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit adding 20 μl 1-Thioglycerol to 1 ml homogenization solution (2%)
vertical laboratory rotator  Suministros Grupo Esper 10000-01062
Cryostat Leica  CM3050S
Homogenizer KINEMATICA Polytron PT1600E
Flow cytometer  Becton Dickinson FACS Canto
5 mL round bottom tube Falcon 352058
Confocal microscope Leica SP5
Fume Hood Kottermann 2-447 BST
Nanodrop 1000 Thermo Fisher Scientific ND-1000 Spectrophotometer
Agilent 2100 Bioanalyzer System Agilent G2939A RNA bioanalyzer
Maxwell Instrument Promega AS4500 
iScript cDNA synthesis kit  Bio-rad 1708891
CFX384 Real-Time PCR Detection System Bio-Rad 1855485
iTaq universal SYBR Green Supermix kit Bio-rad 172-5120
Water  Sigma-Aldrich W4502
Cryogenic vial  Thermo Fisher Scientific 375418 CryoTube vial
Mounting medium Sigma-Aldrich F6057 Fluoroshield with DAPI

References

  1. Harriff, M. J., Bermudez, L. E., Kent, M. L. Experimental exposure of zebrafish, Danio rerio (Hamilton), to Mycobacterium marinum and Mycobacterium peregrinum reveals the gastrointestinal tract as the primary route of infection: A potential model for environmental mycobacterial infection. Journal of Fish Diseases. 30 (10), 587-600 (2007).
  2. Lovmo, S. D., et al. Translocation of nanoparticles and Mycobacterium marinum across the intestinal epithelium in zebrafish and the role of the mucosal immune system. Developmental and Comparative Immunology. 67, 508-518 (2017).
  3. Chen, T., et al. Small-Sized mPEG-PLGA Nanoparticles of Schisantherin A with Sustained Release for Enhanced Brain Uptake and Anti-Parkinsonian Activity. ACS Applied Materials and Interfaces. 9 (11), 9516-9527 (2017).
  4. Collymore, C., Rasmussen, S., Tolwani, R. J. Gavaging Adult Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (78), e50691-e50691 (2013).
  5. Kim, S. H., Jang, Y. S. Antigen targeting to M cells for enhancing the efficacy of mucosal vaccines. Experimental and Molecular Medicine. 46 (3), 85 (2014).
  6. Iwasaki, A., Medzhitov, R. Regulation of adaptive immunity by the innate immune system. Science. 327 (5963), 291-295 (2010).
  7. Kunisawa, J., Kiyono, H. A marvel of mucosal T cells and secretory antibodies for the creation of first lines of defense. Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (12), 1308-1321 (2005).
  8. Rombout, J. H., Yang, G., Kiron, V. Adaptive immune responses at mucosal surfaces of teleost fish. Fish Shellfish Immunology. 40 (2), 634-643 (2014).
  9. Salinas, I. The Mucosal Immune System of Teleost Fish. Biology. 4, 525-539 (2015).
  10. Munang’andu, H. M., Mutoloki, S., Evensen, O. &. #. 2. 4. 8. ;. An overview of challenges limiting the design of protective mucosal vaccines for finfish. Frontiers in Immunology. 6, 542 (2015).
  11. Lickwar, C. R., et al. Genomic dissection of conserved transcriptional regulation in intestinal epithelial cells. PLoS Biology. 15 (8), 2002054 (2017).
  12. Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish. 261, 7-37 (2002).
  13. Rességuier, J., et al. Specific and efficient uptake of surfactant-free poly(lactic acid) nanovaccine vehicles by mucosal dendritic cells in adult zebrafish after bath immersion. Frontiers in Immunology. 8, 190 (2017).
  14. Kephart, D., Terry, G., Krueger, S., Hoffmann, K., Shenoi, H. High-Performance RNA Isolation Using the Maxwell 16 Total RNA Purification Kit. Promega Notes. , (2006).
  15. . Thermo Fisher Scientific NanoDrop 1000 spectrophotometer V3.8 user’s manual. Thermo Fisher Scientific Incorporation. , (2010).
  16. Lightfoot, S. Quantitation comparison of total RNA using the Agilent 2100 bioanalyzer, ribogreen analysis, and UV spectrometry. Agilent Application Note. , (2002).
  17. Huggett, J. F., et al. The digital MIQE guidelines: Minimum information for publication of quantitative digital PCR experiments. Clinical Chemistry. 59 (6), 892-902 (2013).
  18. Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR Journal. 53 (2), 192-204 (2012).
  19. Renshaw, S., Loynes, C. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  20. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), (2011).

Play Video

Cite This Article
Ji, J., Thwaite, R., Roher, N. Oral Intubation of Adult Zebrafish: A Model for Evaluating Intestinal Uptake of Bioactive Compounds. J. Vis. Exp. (139), e58366, doi:10.3791/58366 (2018).

View Video