Intubazione orale di Zebrafish adulto: un modello per valutare l'assorbimento intestinale di sostanze bioattive
Summary
Il protocollo descrive intubating zebrafish adulto con un biologico; quindi di dissezione e preparando l’intestino per citometria, microscopia confocale e qPCR. Questo metodo consente la somministrazione di composti bioattivi per monitorare l’assorbimento intestinale e lo stimolo immune locale evocato. È rilevante per il test la dinamica intestinale di profilassi orale.
Abstract
Maggior parte dei patogeni invadono gli organismi attraverso loro mucosa. Questo è particolarmente vero nei pesci come sono continuamente esposti a un ambiente microbico-ricco di acqua. Lo sviluppo di metodi efficaci per la consegna orale di immunostimolanti o vaccini, che attivano il sistema immunitario contro le malattie infettive, è altamente auspicabile. Nell’elaborazione di strumenti profilattici, buoni modelli sperimentali sono necessari per testare le loro prestazioni. Qui, vi mostriamo un metodo per intubazione orale di zebrafish adulto e una serie di procedure per sezionare e preparare l’intestino cytometry, microscopia confocale e l’analisi quantitativa della polimerasi reazione a catena (qPCR). Con questo protocollo, precisamente possiamo erogare volumi fino a 50 µ l a pescare circa 1 g di peso semplicemente e rapidamente, senza danneggiare gli animali. Questo metodo ci permette di esplorare l’assorbimento diretto in vivo di composti fluorescente etichettati da mucosa intestinale e la capacità immunomodulatoria di tali farmaci biologici nel sito locale dopo intubazione. Combinando metodi a valle come flusso cytometry, istologia, qPCR e microscopia confocale del tessuto intestinale, possiamo capire come immunostimolanti o vaccini sono in grado di attraversare le barriere della mucosa intestinale, passano attraverso la lamina propria, e raggiungere il muscolo, esercitando un effetto sul sistema immunitario della mucosa intestinale. Il modello potrebbe essere utilizzato per testare i sistemi di consegna e profilassi orale candidato o l’effetto locale di qualsiasi composto bioactive oralmente amministrato.
Introduction
L’obiettivo di questo articolo è di descrivere in profondità un metodo semplice per intubazione orale di zebrafish, insieme a utili procedure associate a valle. Intubazione orale utilizzando zebrafish è diventato un modello pratico nello studio delle dinamiche di malattia infettiva, orale vaccino/immunostimolante, droga/nanoparticella assorbimento e l’efficacia e l’immunità mucosa intestinale. Ad esempio, intubazione orale zebrafish è stato utilizzato nello studio di infezione da Mycobacterium marinum e Mycobacterium peregrinum 1. Lovmo et al. anche usato con successo questo modello per fornire le nanoparticelle e M. marinum a tratto gastro-intestinale di zebrafish adulto2. Inoltre, Chen et al. usato intubazione orale zebrafish per mostrare che farmaci incapsulati da nanoparticelle, quando somministrata tramite il tratto gastro-intestinale, sono stati trasportati attraverso il sangue del cervello barriera3. Questi autori hanno effettuato intubazione sulla base del metodo di gauvage descritto da Collymore et al. 4 con alcune modifiche. Tuttavia, non forniscono un protocollo altamente dettagliato che descrive la procedura di intubazione orale. Qui, presentiamo un metodo per intubazione orale di zebrafish adulto sulla base di Collymore et al. 4 includiamo ulteriormente la preparazione dell’intestino per rilevanti dell’analisi a valle da cytometry, microscopia confocale e qPCR.
L’intestino e particolarmente relativo mucosa è la prima linea di difesa contro le infezioni e il sito primario di assorbimento dei nutrienti5. Quando le cellule epiteliali e cellule presentanti l’antigene all’interno della mucosa barriere percepiscono segnali di pericolo, viene attivata un’immediata risposta immunitaria innata. Successivamente, la risposta immunitaria adattativa altamente specifica è stabilita da T e B linfociti6,7. Sviluppo di vaccini orali è una area di interesse attuale in vaccinologia. Tali vaccini sarebbe uno strumento efficace per proteggere l’organismo in luoghi esposti a causa della risposta specifica delle cellule immunitarie nei tessuti linfoidi mucosa-collegato (malto)8,9. In acquacoltura, vaccini mucosali hanno evidenti vantaggi rispetto ai vaccini iniettabili. Sono pratici per la vaccinazione di massa, meno laborioso, sono meno stressanti per i pesci e può essere somministrati ai pesci giovani. Tuttavia, mucosa vaccini candidati devono raggiungere il secondo segmento di intestino senza essere denaturato nell’ambiente orale. Anche devono passare le barriere della mucosa per avere accesso alle cellule (APC) per indurre risposte locali e/o sistemica10presentanti l’antigene. Quindi, test di assorbimento della mucosa raggiunto dagli antigeni orali candidati e loro sistemi di consegna, così come la risposta immunitaria evocata, è essenziale nello sviluppo di vaccini orali.
In un contesto biomedico, sviluppando un modello per testare gli effetti biologici dei composti dopo intubazione orale è di crescente interesse. Molte delle caratteristiche anatomiche e fisiologiche dell’intestino sono conservate tra Spriggina lignaggi, con mammiferi e pesci ossei11. Questo modello di intubazione orale collegato alla analisi a valle può essere uno strumento per fornire intuizioni in biologia umana, così come un terreno di sperimentazione per biologics o altri composti in vivo.
Il protocollo di intubazione orale può essere eseguito da un operatore, ad esempio, amministrare con successo fino a 50 µ l della sospensione di nanoparticelle proteina a pesare 1 g, con un alto tasso di sopravvivenza di pesce. La procedura è semplice da impostare e veloce; 30 pesci possono essere intubati in 1h. Il protocollo per la preparazione dell’intestino è fondamentale per fornire campioni di cellule e tessuti di qualità per la successiva analisi. Esempi di risultati a valle sono dati che mostrano la utilità del protocollo nell’ottenere i dati relazionati all’assorbimento intestinale e nell’isolamento del RNA di qualità per qPCR. Il protocollo sarebbe di grande utilità per coloro che necessitano di un modello adatto per testare le dinamiche della profilassi orale o altri composti nell’intestino.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo è un miglioramento della tecnica precedentemente descritta per intubazione orale di Collymore et al. 4 il nostro protocollo viene descritto in dettaglio il metodo di intubazione orale e prevede la preparazione dell’intestino per analisi successive. Il nostro metodo migliora la velocità di manipolazione di pesce permettendo una persona di svolgere l’intero protocollo rapidamente, senza molta variazione tra gli operatori. Una differenza principale del nostro protocollo c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal Ministero spagnolo della scienza, AGAUR fondi al NR (AGL2015-65129-R MINECO/FEDER e 2014SGR-345 AGAUR) e Commissione europea. RT ha conseguito una borsa di studio pre-dottorato AGAUR (Spagna), JJ è stata sostenuta da una borsa di dottorato del Consiglio di borsa di studio della Cina (Cina) e NR è supportato dal programma Ramón y Cajal (RYC-2010-06210, 2010, MINECO). Ringraziamo il dottor Torrealba per consulenza di esperti nella produzione di proteine, N. Barba dal “Servei de Microscopia” e Dr. M. Costa da “Servei de Citometria” della Universitat Autònoma de Barcelona per assistenza tecnica disponibile.
Materials
| Silicon tube | Dow Corning | 508-001 | 0.30 mm inner diameter and 0.64 mm outer diameter |
| Luer lock needle | Hamilton | 7750-22 | 31 G, Kel-F Hub |
| Luer lock syringe | Hamilton | 81020/01 | 100 μL, Kel-F Hub |
| Filtered pipette tip | Nerbe Plus | 07-613-8300 | 10 μL |
| MS-222 | Sigma Aldrich | E10521 | powder |
| 10x PBS | Sigma Aldrich | P5493 | |
| Filter paper | Filter-Lab | RM14034252 | |
| Collagenase | Gibco | 17104019 | |
| DMEM | Gibco | 31966 | Dulbecco's modified eagle medium |
| Penicillin and streptomycin | Gibco | 15240 | |
| Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| CellTrics filters | Sysmex Partec | 04-004-2326 (Wolflabs) | 30 µm mesh size filters with 2 mL reservoir |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | SAKURA | 4583 | |
| Plastic molds for cryosections | SAKURA | 4557 | Disposable Vinyl molds. 25 mm x 20 mm x 5 mm |
| Slide | Thermo Scientific | 10149870 | SuperFrost Plus slide |
| Cover glasses | Labbox | COVN-024-200 | 24´24 mm |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Atto-488 NHS ester | Sigma-Aldrich | 41698 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit | Promega | AS1340 | |
| 1-Thioglycerol/Homogenization solution | Promega | Inside of Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit | adding 20 μl 1-Thioglycerol to 1 ml homogenization solution (2%) |
| vertical laboratory rotator | Suministros Grupo Esper | 10000-01062 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| Homogenizer | KINEMATICA | Polytron PT1600E | |
| Flow cytometer | Becton Dickinson | FACS Canto | |
| 5 mL round bottom tube | Falcon | 352058 | |
| Confocal microscope | Leica | SP5 | |
| Fume Hood | Kottermann | 2-447 BST | |
| Nanodrop 1000 | Thermo Fisher Scientific | ND-1000 | Spectrophotometer |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent | G2939A | RNA bioanalyzer |
| Maxwell Instrument | Promega | AS4500 | |
| iScript cDNA synthesis kit | Bio-rad | 1708891 | |
| CFX384 Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855485 | |
| iTaq universal SYBR Green Supermix kit | Bio-rad | 172-5120 | |
| Water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Cryogenic vial | Thermo Fisher Scientific | 375418 | CryoTube vial |
| Mounting medium | Sigma-Aldrich | F6057 | Fluoroshield with DAPI |
References
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