成年斑马鱼的口服插管: 一种评价生物活性化合物肠道吸收的模型
Summary
该协议描述插管成年斑马鱼与生物;然后对肠道进行解剖和制备, 用于细胞术、共焦显微镜和 qPCR。这种方法允许管理生物活性化合物, 以监测肠道摄取和局部免疫刺激诱发。对口腔预防手段的肠道动态检测有重要意义。
Abstract
大多数病原体通过其粘膜侵入生物体。这种情况在鱼类中尤其如此, 因为它们不断地接触到微生物丰富的水环境。开发有效的方法来口服免疫增强剂或疫苗, 激活免疫系统, 以抵御传染性疾病, 是非常可取的。在设计预防性工具时, 需要有良好的实验模型来测试其性能。在这里, 我们展示了一个成人斑马鱼口服插管的方法和一套程序, 以解剖和准备肠道的细胞术, 共焦显微镜和定量聚合酶链反应 (qPCR) 分析。通过这项协议, 我们可以精确地管理多达50µL 的鱼量, 它能简单快速地重约1克, 而不会伤害动物。通过这种方法, 我们可以探讨肠道粘膜对荧光标记化合物的直接体内吸收, 以及这种生物制剂在插管后局部部位的免疫调节能力。通过对肠道组织的流式细胞仪、组织学、qPCR 和共聚焦显微术等下游方法的结合, 我们可以了解免疫增强剂或疫苗如何能够跨越肠道粘膜屏障, 通过固有的层层, 并到达肌肉, 对肠道粘膜免疫系统产生影响。该模型可用于测试候选口服预防手段和分娩系统或任何口服生物活性化合物的局部效果。
Introduction
本文的目的是深入描述一种直接的方法, 对斑马鱼的口服插管, 连同有用的相关下游程序。使用斑马鱼进行口服插管已成为研究传染病动力学、口服疫苗/immunostimulant、药物/纳米微粒的摄取和功效以及肠道黏膜免疫的一个实用模型。例如, 斑马鱼口服插管已用于研究marinum 分枝杆菌和peregrinum 杆菌感染1。Lovmo等。还成功地利用该模型将纳米粒子和m marinum到成年斑马鱼2的胃肠道。此外, 陈等人使用斑马鱼口服插管, 以表明药物封装的纳米颗粒, 当通过胃肠道管理, 被运送到血脑屏障3。这些作者根据弗兰克·科利莫尔等gauvage 方法进行插管。4与一些修改。然而, 他们没有提供一个非常详细的协议描述口服插管程序。在这里, 我们提出了一个成人斑马鱼在弗兰克·科利莫尔等的口服插管方法。4我们还包括用细胞术、共焦显微镜和 qPCR 为相关下游分析准备肠道。
肠道和特别它的黏膜是第一行防御传染和营养素吸收的主要站点5。当粘膜屏障内的上皮细胞和抗原呈现细胞觉察到危险信号时, 就会触发直接的先天免疫反应。其次, 高度特异的自适应免疫应答是由 T 和 B 淋巴细胞6,7建立的。口服疫苗的研制是目前疫苗的一个重点领域。由于粘膜相关淋巴组织 (麦芽)8、9中的免疫细胞的特定反应, 这种疫苗将是保护暴露部位生物体的有效工具。在水产养殖中, 与注射疫苗相比, 黏膜疫苗具有明显的优势。它们对于大规模的疫苗接种是切实可行的, 较少劳动密集型, 对鱼的压力较小, 可以对幼鱼进行管理。然而, 黏膜疫苗候选者必须达到第二肠道部分, 而不变性的口腔环境。它们还必须穿过粘膜屏障, 以便获得抗原呈现细胞 (apc), 以诱导局部和/或系统性反应10。因此, 在口服疫苗的研制中, 对候选口服抗原及其运载系统所获得的粘膜吸收以及诱发的免疫应答的检测是必不可少的。
在生物医学的背景下, 建立一个模型来测试化合物在口服插管后的生物效应, 这是越来越多的兴趣。许多的解剖和生理特征的肠道是保守之间的 bilaterian 血统, 与哺乳动物和骨鱼类11。这种口服插管模型连接到下游分析可以是一个工具, 以提供对人类生物学的洞察力, 以及生物制剂或其他化合物在体内的测试场地。
口服插管协议可以由一个操作员执行,例如, 成功地管理多达50µL 的蛋白纳米颗粒悬浮到鱼重1克, 具有较高的存活率。该程序设置简单, 快速;30条鱼可以在1小时内插管。肠道准备的协议是提供质量细胞和组织样本的关键, 以供后续分析。给出了下游结果的例子, 表明该协议在获取与肠道摄取有关的数据和分离 qPCR 质量 RNA 方面是有用的。该协议将是非常有用的那些需要一个合适的模型来测试口腔预防手段或其他化合物在肠道的动态。
Protocol
Representative Results
Discussion
本协议是对先前描述的弗兰克·科利莫尔的口服插管技术的改进. 4我们的协议详细描述了口服插管方法, 包括为下游分析准备肠道。我们的方法提高了鱼的操作速度, 使得一个人能够快速执行整个协议, 而操作者之间没有太大的变化。我们的协议与前一项的主要区别是, 我们评估一个口服插管实验的成功, 不仅是观察动物的福祉 (如没有出血), 并没有泄漏的液体管理, 但…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到西班牙科学部、欧洲委员会和 AGAUR 基金提供的赠款的支持 (AGL2015-65129-R MINECO/菲德和 2014 sgr-345 AGAUR)。RT 持有来自 AGAUR (西班牙) 的博士预科奖学金, JJ 得到了中国奖学金理事会 (中国) 博士奖学金的支持, NR 由拉蒙 y Cajal 计划 (RYC-2010-06210, 2010, MINECO) 支持。我们感谢 Torrealba 博士在蛋白质生产方面的专家建议, n. 芭巴从 “Servei de Microscopia” 和 m. 哥斯达黎加博士, 从 Servei Citometria de 巴塞罗那的 “大学 de Autònoma” 得到了有益的技术援助。
Materials
| Silicon tube | Dow Corning | 508-001 | 0.30 mm inner diameter and 0.64 mm outer diameter |
| Luer lock needle | Hamilton | 7750-22 | 31 G, Kel-F Hub |
| Luer lock syringe | Hamilton | 81020/01 | 100 μL, Kel-F Hub |
| Filtered pipette tip | Nerbe Plus | 07-613-8300 | 10 μL |
| MS-222 | Sigma Aldrich | E10521 | powder |
| 10x PBS | Sigma Aldrich | P5493 | |
| Filter paper | Filter-Lab | RM14034252 | |
| Collagenase | Gibco | 17104019 | |
| DMEM | Gibco | 31966 | Dulbecco's modified eagle medium |
| Penicillin and streptomycin | Gibco | 15240 | |
| Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| CellTrics filters | Sysmex Partec | 04-004-2326 (Wolflabs) | 30 µm mesh size filters with 2 mL reservoir |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | SAKURA | 4583 | |
| Plastic molds for cryosections | SAKURA | 4557 | Disposable Vinyl molds. 25 mm x 20 mm x 5 mm |
| Slide | Thermo Scientific | 10149870 | SuperFrost Plus slide |
| Cover glasses | Labbox | COVN-024-200 | 24´24 mm |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Atto-488 NHS ester | Sigma-Aldrich | 41698 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit | Promega | AS1340 | |
| 1-Thioglycerol/Homogenization solution | Promega | Inside of Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit | adding 20 μl 1-Thioglycerol to 1 ml homogenization solution (2%) |
| vertical laboratory rotator | Suministros Grupo Esper | 10000-01062 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| Homogenizer | KINEMATICA | Polytron PT1600E | |
| Flow cytometer | Becton Dickinson | FACS Canto | |
| 5 mL round bottom tube | Falcon | 352058 | |
| Confocal microscope | Leica | SP5 | |
| Fume Hood | Kottermann | 2-447 BST | |
| Nanodrop 1000 | Thermo Fisher Scientific | ND-1000 | Spectrophotometer |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent | G2939A | RNA bioanalyzer |
| Maxwell Instrument | Promega | AS4500 | |
| iScript cDNA synthesis kit | Bio-rad | 1708891 | |
| CFX384 Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855485 | |
| iTaq universal SYBR Green Supermix kit | Bio-rad | 172-5120 | |
| Water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Cryogenic vial | Thermo Fisher Scientific | 375418 | CryoTube vial |
| Mounting medium | Sigma-Aldrich | F6057 | Fluoroshield with DAPI |
References
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