Summary

Intubación por vía oral de pez cebra adulto: un modelo para evaluar la absorción Intestinal de compuestos bioactivos

Published: September 27, 2018
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Summary

El protocolo describe intubating pez cebra adulto con un biológico; disección y preparación del intestino para microscopía confocal, citometría y qPCR. Este método permite la administración de compuestos bioactivos para controlar la absorción intestinal y el estímulo inmunológico local evocada. Es relevante para la dinámica intestinal de profilaxis orales de la prueba.

Abstract

La mayoría de patógenos invadirán organismos a través de su mucosa. Esto es particularmente cierto en los peces que están continuamente expuestas a un ambiente de agua rica en microbios. Desarrollo de métodos efectivos para la administración oral de inmunoestimulantes o vacunas, que activan el sistema inmunológico contra las enfermedades infecciosas, es altamente deseable. Al idear herramientas profilácticas, se necesitan buenos modelos experimentales para probar su funcionamiento. A continuación, os mostramos un método para la intubación por vía oral de pez cebra adulto y un conjunto de procedimientos para disecar y preparar el intestino para citometría, microscopia confocal y análisis de (qPCR) la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa. Con este protocolo, precisamente podemos administrar volúmenes hasta 50 μL para pescar aproximadamente 1 g de peso sencilla y rápida, sin dañar los animales. Este método nos permite explorar la absorción directa en vivo de fluorescencia con compuestos por la mucosa intestinal y la capacidad inmunomoduladora de estos productos biológicos en el sitio local después de la intubación. Combinando métodos aguas abajo como histología, qPCR, citometría de flujo y microscopia confocal del tejido intestinal, podemos entender cómo inmunoestimulantes o vacunas son capaces de cruzar las barreras de la mucosa intestinales, pasan a través de la lámina propia, y llegar a los músculos, ejerciendo un efecto sobre el sistema inmune de mucosa intestinal. El modelo podría utilizarse para probar la profilaxis oral candidato y sistemas de administración o el efecto local de cualquier compuesto bioactivo administrado por vía oral.

Introduction

El objetivo de este artículo es describir en profundidad un método sencillo para la intubación por vía oral del pez cebra, junto con útiles procedimientos asociados de aguas abajo. Intubación por vía oral utilizando el pez cebra se ha convertido en un modelo práctico en el estudio de la dinámica de enfermedades infecciosas, vacuna oral/inmunoestimulante, absorción de la droga/nanopartículas y eficacia e inmunidad mucosa intestinal. Por ejemplo, pez cebra intubación por vía oral se ha utilizado en el estudio del marinum de la micobacteria y Mycobacterium peregrinum infección1. Lovmo et al. también utilizado con éxito este modelo entregar nanopartículas y M. marinum del tracto gastro-intestinal de pez cebra adulto2. Además, Chen et al. usaron intubación oral de pez cebra para mostrar que las drogas encapsulan por nanopartículas, cuando administrados a través del tracto gastro-intestinal, fueron transportados a través de la barrera de cerebro de sangre3. Estos autores realizaron intubación basada en el método de gauvage descrito por Collymore et al. 4 con algunas modificaciones. Sin embargo, no presentó un protocolo muy detallado que describe el procedimiento de intubación por vía oral. Aquí, presentamos un método para la intubación por vía oral de pez cebra adulto partiendo de Collymore et al. 4 además incluimos la preparación del intestino para el pertinente análisis aguas abajo por microscopía confocal, citometría y qPCR.

El intestino y especialmente de su mucosa es la primera línea de defensa contra la infección y el sitio principal de absorción de los nutrientes5. Cuando las células epiteliales y células presentadoras de antígeno en las barreras mucosas perciban señales de peligro, se activa una respuesta inmune innata inmediata. A continuación, la respuesta inmune adaptativa altamente específica se establece por de6,de los linfocitos T y B7. Desarrollo de vacunas orales es una zona de enfoque actual en vacunología. Las vacunas sería una herramienta eficaz para proteger el organismo en lugares expuestos debido a la respuesta específica de las células inmunes de los tejidos linfoide mucosa-asociado (Malta)8,9. En acuicultura, mucosa vacunas tienen ventajas evidentes en comparación con las vacunas inyectables. Prácticas para la vacunación masiva, requiere menos mano de obra, son menos estresantes para los peces y puede ser administradas a los peces jóvenes. Sin embargo, los candidatos de vacuna contra la mucosa deben alcanzar el segundo segmento del intestino sin ser desnaturalizado en el ambiente oral. También debe cruzar las barreras mucosa para acceder al antígeno que presenta las células (APCs) para inducir respuestas locales o sistémicos10. Por lo tanto, la prueba de la absorción mucosa mediante antígenos orales candidato y sus sistemas vectores, así como de la respuesta inmunitaria evocada, es esencial en el desarrollo de vacunas orales.

En un contexto biomédico, desarrollando un modelo para probar los efectos biológicos de compuestos después de intubación por vía oral es de creciente interés. Se conservan muchas de las características anatómicas y fisiológicas del intestino entre los linajes de hojas, con mamíferos y peces óseos11. Este modelo de intubación oral conectado para análisis de aguas abajo puede ser una herramienta para proporcionar penetraciones en la biología humana, así como un campo de pruebas para productos biológicos u otros compuestos en vivo.

El protocolo de intubación por vía oral puede realizarse por un operador, por ejemplo, administrando con éxito hasta 50 μl de la suspensión de nanopartículas de proteína pescado pesa 1 g, con una tasa alta de supervivencia. El procedimiento es fácil de configurar y rápido; 30 peces pueden ser intubados en 1 h. El protocolo para la preparación del intestino es fundamental para proporcionar muestras de células y tejidos de calidad para su posterior análisis. Se dan ejemplos de los resultados posteriores que demuestran la utilidad del protocolo en la obtención de datos relacionados con la absorción intestinal y en el aislamiento de RNA de calidad para qPCR. El protocolo sería de gran utilidad para aquellos que necesitan un modelo conveniente para probar la dinámica de la profilaxis orales u otros compuestos en el intestino.

Protocol

Todos los procedimientos experimentales con el pez cebra (Danio rerio) fueron autorizados por el Comité de ética de la Universitat Autònoma de Barcelona (número CEEH 1582) de acuerdo con los principios rectores de la Internacional de la investigación que implica animales ( EU 2010/63). Todos los experimentos con el pez cebra vivo se realizaron en 26 – 28 ° C. 1. preparar el equipo para intubación Oral Coloque aproximadamente 1 cm de un tubo fino de silicona en una 3…

Representative Results

Pez cebra (peso promedio: 1.03 ± 0.16 g) del sexo mezclado con éxito fueron intubados con nanopartículas de diferentes proteínas recombinantes (cuerpos de inclusión bacterianas) usando nuestro dispositivo de intubación oral hecho en casa (figura 1). Con éxito hemos realizado la intubación oral y logra un bajo porcentaje promedio de mortalidad (6,8%) (Tabla 1). Pez cebra fueron bien intubado con 30 μL o 50 μl de las suspensiones de n…

Discussion

Este protocolo es una mejora de la técnica descrita para la intubación por vía oral por Collymore et al. 4 nuestro protocolo describe detalladamente el método de intubación por vía oral e incluye la preparación del intestino para análisis posteriores. Nuestro método mejora la velocidad de manipulación de pescado permitiendo a una persona realizar el protocolo completo rápidamente, sin mucha variación entre operadores. Una principal diferencia de nuestro protocolo con la anteri…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue financiado por becas del Ministerio de ciencia, Comisión Europea y los fondos AGAUR para NR (AGL2015-65129-R MINECO/FEDER y AGAUR 2014SGR-345). RT tiene una beca predoctoral AGAUR (España), JJ fue apoyada por una beca de doctorado del Consejo de becas de China (China) y NR es apoyado por el programa de Ramón y Cajal (RYC-2010-06210, 2010, MINECO). Agradecemos el asesoramiento experto en la producción de proteína, N. Barba desde el “Servei de Microscopia” Dr. Torrealba y Dr. M. Costa del “Servei de Citometria” de la Universitat Autònoma de Barcelona asistencia técnica útil.

Materials

Silicon tube Dow Corning 508-001 0.30 mm inner diameter and 0.64 mm outer diameter
Luer lock needle Hamilton 7750-22 31 G, Kel-F Hub
Luer lock syringe Hamilton 81020/01 100 μL, Kel-F Hub
Filtered pipette tip Nerbe Plus 07-613-8300 10 μL
MS-222 Sigma Aldrich E10521 powder
10x PBS Sigma Aldrich P5493
Filter paper  Filter-Lab RM14034252
Collagenase Gibco 17104019
DMEM  Gibco 31966 Dulbecco's modified eagle medium
Penicillin and streptomycin Gibco 15240
Cell strainer Falcon 352360
CellTrics filters  Sysmex Partec 04-004-2326 (Wolflabs) 30 µm mesh size filters with 2 mL reservoir
Tissue-Tek O.C.T. compound SAKURA 4583
Plastic molds for cryosections SAKURA 4557 Disposable Vinyl molds. 25 mm x 20 mm x 5 mm
Slide Thermo Scientific 10149870 SuperFrost Plus slide
Cover glasses Labbox  COVN-024-200 24´24 mm
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich 158127
Atto-488 NHS ester Sigma-Aldrich 41698
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761
DMSO Sigma-Aldrich D8418
Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit Promega AS1340
1-Thioglycerol/Homogenization solution Promega Inside of Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit adding 20 μl 1-Thioglycerol to 1 ml homogenization solution (2%)
vertical laboratory rotator  Suministros Grupo Esper 10000-01062
Cryostat Leica  CM3050S
Homogenizer KINEMATICA Polytron PT1600E
Flow cytometer  Becton Dickinson FACS Canto
5 mL round bottom tube Falcon 352058
Confocal microscope Leica SP5
Fume Hood Kottermann 2-447 BST
Nanodrop 1000 Thermo Fisher Scientific ND-1000 Spectrophotometer
Agilent 2100 Bioanalyzer System Agilent G2939A RNA bioanalyzer
Maxwell Instrument Promega AS4500 
iScript cDNA synthesis kit  Bio-rad 1708891
CFX384 Real-Time PCR Detection System Bio-Rad 1855485
iTaq universal SYBR Green Supermix kit Bio-rad 172-5120
Water  Sigma-Aldrich W4502
Cryogenic vial  Thermo Fisher Scientific 375418 CryoTube vial
Mounting medium Sigma-Aldrich F6057 Fluoroshield with DAPI

References

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Cite This Article
Ji, J., Thwaite, R., Roher, N. Oral Intubation of Adult Zebrafish: A Model for Evaluating Intestinal Uptake of Bioactive Compounds. J. Vis. Exp. (139), e58366, doi:10.3791/58366 (2018).

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