Summary

Intubação oral de Zebrafish adulto: um modelo para avaliar a absorção Intestinal de compostos bioativos

Published: September 27, 2018
doi:

Summary

O protocolo descreve intubação zebrafish adulto com um biológico; em seguida, dissecando e preparar o intestino para citometria, microscopia confocal e qPCR. Este método permite a administração de compostos bioativos para monitorar a absorção intestinal e o estímulo imune local evocado. É relevante para a dinâmica intestinal da profilaxia oral de teste.

Abstract

A maioria dos patógenos invadem organismos por meio de sua mucosa. Isto é particularmente verdadeiro em peixe como eles estão continuamente expostos a um ambiente de água rica em microbiana. Desenvolver métodos eficazes para entrega oral de Imunoestimuladores ou vacinas, que ativam o sistema imunológico contra doenças infecciosas, é altamente desejável. Na concepção de ferramentas profiláticas, bons modelos experimentais são necessários para testar seu desempenho. Aqui, nós mostramos um método para intubação oral de zebrafish adulto e um conjunto de procedimentos para dissecar e preparar o intestino para citometria, microscopia confocal e análise (qPCR) reação em cadeia de polimerase quantitativa. Com este protocolo, estamos precisamente pode administrar volumes até 50 µ l de pescar pesando cerca de 1 g simplesmente e rapidamente, sem prejudicar os animais. Este método nos permite explorar a absorção direta na vivo de compostos fluorescente rotulados pela mucosa intestinal e a capacidade de imunomoduladores de tais produtos biológicos no local após a intubação. Combinando métodos a jusante como citometria de fluxo, histologia, qPCR e microscopia confocal do tecido intestinal, podemos entender como Imunoestimuladores ou vacinas são capazes de atravessar as barreiras da mucosa intestinais, passar a lâmina própria, e atingir o músculo, exercendo um efeito sobre o sistema imunológico da mucosa intestinal. O modelo pode ser usado para testar a profilaxia oral candidato e sistemas de entrega ou o efeito local de qualquer composto Bioativo administrado por via oral.

Introduction

O objetivo deste artigo é descrever em profundidade um método simples para intubação oral de zebrafish, juntamente com procedimentos de jusante associados útil. Intubação oral usando zebrafish tornou-se um modelo prático no estudo da dinâmica de doenças infecciosas, vacina oral/imuno-estimulantes, drogas/nanopartículas absorção e eficácia e imunidade da mucosa intestinal. Por exemplo, zebrafish intubação oral tem sido usada no estudo de Mycobacterium marinum e Mycobacterium peregrinum infecção1. Lovmo et al . também utilizado com sucesso este modelo para entregar o trato gastro-intestinal de adultos do zebrafish2-nanopartículas e M. marinum . Além disso, Chen et al costumava intubação oral zebrafish para mostrar que drogas encapsuladas por nanopartículas, quando administrada através do trato gastro-intestinal, foram transportados através do sangue cérebro barreira3. Estes autores realizaram intubação baseada no método descrito por Collymore et al gauvage 4 , com algumas modificações. No entanto, eles não forneceu um protocolo altamente detalhado, descrevendo o procedimento de intubação oral. Aqui, apresentamos um método para intubação oral de adultos do zebrafish baseando Collymore et al 4 outras incluem a preparação do intestino para análise pertinente a jusante por citometria, microscopia confocal e qPCR.

O intestino e particularmente sua mucosa é a primeira linha de defesa contra a infecção e o local principal de absorção de nutrientes5. Quando as células epiteliais e células apresentadoras de antígeno dentro da mucosa barreiras percebem sinais de perigo, uma imediata resposta imune inata é acionada. Em seguida, a resposta imune adaptativa altamente específica é estabelecida por de6,de linfócitos T e B7. Desenvolvimento de vacinas orais é uma área de foco atual em Vacinologia. Essas vacinas seria uma ferramenta eficaz para proteger o organismo em locais expostos devido à resposta específica de células do sistema imunológico em tecidos linfoides associados a mucosa (MALT)8,9. Na aquicultura, vacinas da mucosa tem vantagens óbvias em comparação com as vacinas injetáveis. Eles são práticos para vacinação em massa, menos trabalhosa, são menos estressantes para os peixes e podem ser administrados para peixes jovens. No entanto, candidatos vacinais da mucosa devem chegar o segundo segmento de intestino sem ser desnaturada no meio oral. Eles também devem transpor as barreiras da mucosa para obter acesso a apresentadoras de antígenos (APCs) para induzir respostas locais e/ou sistêmica10de células. Portanto, testes de captação da mucosa alcançada pelo candidato oral antígenos e seus sistemas de entrega, bem como a resposta imune evocada, é essencial no desenvolvimento de vacinas orais.

Em um contexto biomédico, desenvolvendo um modelo para testar os efeitos biológicos de compostos após intubação oral é de interesse crescente. Muitas das características anatômicas e fisiológicas do intestino são conservadas entre linhagens é formado por, com mamíferos e peixes ósseos11. Este modelo de entubação oral ligado à análise a jusante pode ser uma ferramenta para fornecer insights sobre a biologia humana, bem como um campo de testes para produtos biológicos ou outros compostos na vivo.

O protocolo de intubação oral pode ser realizado por um operador, por exemplo, administrar com sucesso até 50 µ l de suspensão de nanopartículas de proteína para peixes pesando 1 g, com uma taxa de sobrevivência de alta. O procedimento é simples de configurar e rápido; 30 peixes podem ser intubados em 1h. O protocolo para a preparação do intestino é a chave para fornecer amostras de células e tecidos de qualidade para posterior análise. Exemplos de resultados a jusante são dados que mostram a utilidade do protocolo na obtenção de dados relacionados à absorção intestinal e no isolamento do RNA de qualidade para qPCR. O protocolo seria de grande utilidade para aqueles que necessitam de um modelo adequado para testar a dinâmica da profilaxia oral ou outros compostos no intestino.

Protocol

Todos os procedimentos experimentais envolvendo peixe-zebra (Danio rerio) foram autorizados pelo Comitê de ética da Universitat Autònoma de Barcelona (número CEEH 1582) de acordo com os princípios orientadores do Internacional para pesquisa envolvendo animais ( EU 2010/63). Todos os experimentos com zebrafish ao vivo foram realizados em 26 e 28 ° C. 1. preparar o equipamento para intubação Oral Coloque aproximadamente 1 cm de um tubo de silicone fino sobre uma agulha…

Representative Results

Zebrafish (peso médio: 1.03 ± 0,16 g) de sexo misturado com êxito foram intubados com nanopartículas de diferentes proteínas recombinantes (corpos de inclusão bacterianas) usando nosso dispositivo de intubação oral caseiro (Figura 1). Nós temos com sucesso realizada a intubação oral e alcançado uma percentagem média baixa mortalidade (6,8%) (Tabela 1). Zebrafish foram também intubado com 30 µ l ou 50 µ l de suspensões de nano…

Discussion

Este protocolo é um aperfeiçoamento da técnica descrita anteriormente para intubação oral por Collymore et al 4 nosso protocolo descreve em detalhes o método de intubação oral e inclui a preparação do intestino para análises a jusante. Nosso método melhora a velocidade de manipulação de peixes permitindo que uma pessoa para executar o protocolo rapidamente, sem muita variação entre os operadores. A principal diferença do nosso protocolo com a anterior é que avaliamos o s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado por concessões do Ministério da ciência, espanhol AGAUR fundos para NR (AGL2015-65129-R MINECO/FEDER e 2014SGR-345 AGAUR) e Comissão Europeia. RT detém uma bolsa doutorandos de AGAUR (Espanha), JJ foi apoiada por uma bolsa de doutorado do Conselho da bolsa de China (China) e NR é suportado pelo programa de Ramón y Cajal (RYC-2010-06210, 2010, MINECO). Agradecemos o Dr. Torrealba por consultoria especializada na produção de proteína, s. Botelho da “Servei de Microscopia” e Dr. M. Costa desde o “Servei de Citometria” da Universitat Autònoma de Barcelona, para assistência técnica útil.

Materials

Silicon tube Dow Corning 508-001 0.30 mm inner diameter and 0.64 mm outer diameter
Luer lock needle Hamilton 7750-22 31 G, Kel-F Hub
Luer lock syringe Hamilton 81020/01 100 μL, Kel-F Hub
Filtered pipette tip Nerbe Plus 07-613-8300 10 μL
MS-222 Sigma Aldrich E10521 powder
10x PBS Sigma Aldrich P5493
Filter paper  Filter-Lab RM14034252
Collagenase Gibco 17104019
DMEM  Gibco 31966 Dulbecco's modified eagle medium
Penicillin and streptomycin Gibco 15240
Cell strainer Falcon 352360
CellTrics filters  Sysmex Partec 04-004-2326 (Wolflabs) 30 µm mesh size filters with 2 mL reservoir
Tissue-Tek O.C.T. compound SAKURA 4583
Plastic molds for cryosections SAKURA 4557 Disposable Vinyl molds. 25 mm x 20 mm x 5 mm
Slide Thermo Scientific 10149870 SuperFrost Plus slide
Cover glasses Labbox  COVN-024-200 24´24 mm
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich 158127
Atto-488 NHS ester Sigma-Aldrich 41698
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761
DMSO Sigma-Aldrich D8418
Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit Promega AS1340
1-Thioglycerol/Homogenization solution Promega Inside of Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit adding 20 μl 1-Thioglycerol to 1 ml homogenization solution (2%)
vertical laboratory rotator  Suministros Grupo Esper 10000-01062
Cryostat Leica  CM3050S
Homogenizer KINEMATICA Polytron PT1600E
Flow cytometer  Becton Dickinson FACS Canto
5 mL round bottom tube Falcon 352058
Confocal microscope Leica SP5
Fume Hood Kottermann 2-447 BST
Nanodrop 1000 Thermo Fisher Scientific ND-1000 Spectrophotometer
Agilent 2100 Bioanalyzer System Agilent G2939A RNA bioanalyzer
Maxwell Instrument Promega AS4500 
iScript cDNA synthesis kit  Bio-rad 1708891
CFX384 Real-Time PCR Detection System Bio-Rad 1855485
iTaq universal SYBR Green Supermix kit Bio-rad 172-5120
Water  Sigma-Aldrich W4502
Cryogenic vial  Thermo Fisher Scientific 375418 CryoTube vial
Mounting medium Sigma-Aldrich F6057 Fluoroshield with DAPI

References

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Cite This Article
Ji, J., Thwaite, R., Roher, N. Oral Intubation of Adult Zebrafish: A Model for Evaluating Intestinal Uptake of Bioactive Compounds. J. Vis. Exp. (139), e58366, doi:10.3791/58366 (2018).

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