Summary

Устные интубации взрослых рыбок данио: модель для оценки кишечного поглощения биоактивных соединений

Published: September 27, 2018
doi:

Summary

Протокол описывает интубирование взрослых данио рерио с биологическими; затем рассечения и подготовка кишечника цитометрии, конфокальная микроскопия и ПЦР. Этот метод позволяет администрации биоактивных соединений для мониторинга кишечного поглощения и местной иммунной стимул вызывали. Это актуально для тестирования кишечных динамика устных профилактики.

Abstract

Большинство возбудителей вторгнуться организмов через их слизистой оболочки. Это особенно верно в рыбе, как они постоянно подвергаются воздействию микробной богатые водной среды. Разработка эффективных методов для перорального Иммуностимуляторы или вакцин, которые активируют иммунную систему против инфекционных заболеваний, является весьма желательным. В разработке профилактических средств, хорошие экспериментальные модели необходимо проверить их эффективность. Здесь мы показываем, метод для устного интубации взрослых рыбок данио и набор процедур для вскрыть и подготовки кишечника цитометрии, confocal микроскопии и анализа количественных полимеразной цепной реакции (ПЦР). Этот протокол мы точно можно администрировать тома до 50 мкл рыбы весом примерно 1 g просто и быстро, без ущерба для животных. Этот метод позволяет нам исследовать поглощения прямых в vivo дневно помечены соединений на слизистой оболочке кишечника и иммуномодулирующим потенциала таких биопрепаратов на локальном сайте после интубации. Объединив течению методы, такие как проточной цитометрии, гистология, ПЦР и confocal микроскопии кишечника ткани, мы можем понять, как возможность пересечь кишечной слизистой барьеров, проходят через lamina propria, иммуностимуляторы или вакцины и достичь мышцы, оказывая влияние на кишечной слизистой иммунной системы. Модель может использоваться для проверки кандидата устные профилактики и систем доставки или местное действие любого перорального биоактивных соединений.

Introduction

Цель этой статьи заключается в подробно описать простой метод для устного интубации данио рерио, наряду с полезной связанные течению процедур. Устные интубации, используя данио рерио стала практической моделью в изучении динамики инфекционного заболевания, устные вакцины/иммуностимулирующим, потребление наркотиков/наночастиц и эффективность и кишечной слизистой иммунитета. Например в исследовании Mycobacterium marinum и peregrinum микобактерий инфекции1был использован данио рерио устные интубации. Lovmo и др. также успешно используется эта модель для доставки наночастиц и м. marinum желудочно кишечного тракта у взрослых рыбок данио2. Кроме того, Чэнь et al. используется данио рерио устные интубации чтобы показать, что наркотики инкапсулируется наночастиц, когда управляемые через желудочно кишечного тракта, были перевезены через барьер мозга крови3. Эти авторы провели интубации, основанную на методе gauvage, характеризуется Коллимор et al. 4 с некоторыми изменениями. Однако они не обеспечивают весьма подробный протокол описания процедуры устного интубации. Здесь мы представляем метод для устного интубации взрослых рыбок данио, опираясь на Коллимор et al. 4 далее мы включают подготовку intestine для соответствующих течению анализа цитометрии, конфокальная микроскопия и ПЦР.

Кишечника и особенно ее слизистой оболочки является первой линией обороны против инфекции и основной сайт питательных5. Когда клетки эпителия и антиген представляющих клеток в слизистой барьеры воспринимают сигналы опасности, запускается немедленно врожденный иммунный ответ. Далее,6,лимфоцитов T и B7устанавливается весьма специфический адаптивного иммунного ответа. Развитие устной вакцин является текущее направление в вакцинологии. Такие вакцины будет эффективным инструментом для защиты организма на открытых участках из-за конкретный ответ иммунных клеток в слизистой оболочки связанных лимфоидной ткани (MALT)8,9. В аквакультуре слизистой вакцины имеют очевидные преимущества, по сравнению с инъекционные вакцины. Они практичны для массовой вакцинации, менее трудоемкой, менее стрессовым для рыб и может назначаться молоди рыб. Тем не менее слизистой вакцин-кандидатов должны достичь второго сегмента кишки без денатурировано в устной окружающей среды. Они также должны пересекать слизистой барьеров для того, чтобы получить доступ к антиген представляющих клеток (БТР), чтобы побудить местных или системных ответов10. Таким образом тестирование слизистой поглощения, достигнутые устные антигены кандидат и систем их доставки, а также иммунный ответ вызвал, имеет важное значение в развитии устных вакцин.

В рамках биомедицинских разработка модели для тестирования биологических эффектов соединений после интубации в Оральный растущий интерес. Многие анатомические и физиологические функции кишечника консервируют между bilaterian линий, с11млекопитающих и костистых рыб. Эта модель устные интубации, подключенных к течению анализа может быть инструментом обеспечить понимание биологии человека, а также полигоном для biologics или других соединений в естественных условиях.

Протокол устное интубации могут выполняться одним оператором, например, успешно администрирование до 50 мкл суспензии наночастиц белок рыбы весом 1 g, с высокой выживаемости. Процедура проста в настройке и быстро; 30 рыб может быть интубированных в 1 час. Протокол для кишечника подготовки является ключом к обеспечению качества образцов клеток и тканей для последующего анализа. Приведены примеры течению результаты, которые показывают полезность протокола в получении данных, относящиеся к кишечного поглощения и изолировать РНК качества для ПЦР. Протокол будет весьма полезным для тех, кто нуждается подходящую модель для проверки динамика устных профилактики или других соединений в кишечнике.

Protocol

Все экспериментальные процедуры с участием данио рерио (Danio рерио) были утверждены Комитетом по этике близлежащем автономном Университат де Барселона (CEEH номер 1582) по согласованию с международные руководящие принципы для исследований с участием животных ( EU 2010/63). Все эксперименты …

Representative Results

Данио рерио (средний вес: 1,03 ± 0,16 g) смешанного пола были успешно интубированных с различными рекомбинантных белков наночастиц (бактериальный включение органы) с помощью нашего дома сделал устные интубации устройства (рис. 1). Мы успешно выполнять устные…

Discussion

Этот протокол является улучшение ранее описанные методики для устного интубации на Коллимор et al. 4 наши протокол подробно описывает метод устные интубации и включает в себя подготовку intestine вниз по течению анализа. Наш метод улучшает скорость манипуляции рыбы, позволя…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана грантов от испанского министерства науки, Европейской Комиссии и AGAUR средства для NR (AGL2015-65129-R МИНЕКО/ФЕДЕР и 2014SGR-345 AGAUR). RT имеет предварительно докторской стипендии от AGAUR (Испания), JJ было поддержано PhD стипендии от Совета стипендию Китай (Китай) и NR поддерживается программой Ramón y Cajal (Исправительные-2010-06210, МИНЕКО, 2010). Мы благодарим д-р Торреальба для консультации экспертов в производстве белка, н. «Барба» от «Обслуживание де Microscopia» и д-р м. Коста от «Обслуживание de Citometria» на близлежащем автономном Университат де Барселона полезной технической помощи.

Materials

Silicon tube Dow Corning 508-001 0.30 mm inner diameter and 0.64 mm outer diameter
Luer lock needle Hamilton 7750-22 31 G, Kel-F Hub
Luer lock syringe Hamilton 81020/01 100 μL, Kel-F Hub
Filtered pipette tip Nerbe Plus 07-613-8300 10 μL
MS-222 Sigma Aldrich E10521 powder
10x PBS Sigma Aldrich P5493
Filter paper  Filter-Lab RM14034252
Collagenase Gibco 17104019
DMEM  Gibco 31966 Dulbecco's modified eagle medium
Penicillin and streptomycin Gibco 15240
Cell strainer Falcon 352360
CellTrics filters  Sysmex Partec 04-004-2326 (Wolflabs) 30 µm mesh size filters with 2 mL reservoir
Tissue-Tek O.C.T. compound SAKURA 4583
Plastic molds for cryosections SAKURA 4557 Disposable Vinyl molds. 25 mm x 20 mm x 5 mm
Slide Thermo Scientific 10149870 SuperFrost Plus slide
Cover glasses Labbox  COVN-024-200 24´24 mm
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich 158127
Atto-488 NHS ester Sigma-Aldrich 41698
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761
DMSO Sigma-Aldrich D8418
Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit Promega AS1340
1-Thioglycerol/Homogenization solution Promega Inside of Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit adding 20 μl 1-Thioglycerol to 1 ml homogenization solution (2%)
vertical laboratory rotator  Suministros Grupo Esper 10000-01062
Cryostat Leica  CM3050S
Homogenizer KINEMATICA Polytron PT1600E
Flow cytometer  Becton Dickinson FACS Canto
5 mL round bottom tube Falcon 352058
Confocal microscope Leica SP5
Fume Hood Kottermann 2-447 BST
Nanodrop 1000 Thermo Fisher Scientific ND-1000 Spectrophotometer
Agilent 2100 Bioanalyzer System Agilent G2939A RNA bioanalyzer
Maxwell Instrument Promega AS4500 
iScript cDNA synthesis kit  Bio-rad 1708891
CFX384 Real-Time PCR Detection System Bio-Rad 1855485
iTaq universal SYBR Green Supermix kit Bio-rad 172-5120
Water  Sigma-Aldrich W4502
Cryogenic vial  Thermo Fisher Scientific 375418 CryoTube vial
Mounting medium Sigma-Aldrich F6057 Fluoroshield with DAPI

References

  1. Harriff, M. J., Bermudez, L. E., Kent, M. L. Experimental exposure of zebrafish, Danio rerio (Hamilton), to Mycobacterium marinum and Mycobacterium peregrinum reveals the gastrointestinal tract as the primary route of infection: A potential model for environmental mycobacterial infection. Journal of Fish Diseases. 30 (10), 587-600 (2007).
  2. Lovmo, S. D., et al. Translocation of nanoparticles and Mycobacterium marinum across the intestinal epithelium in zebrafish and the role of the mucosal immune system. Developmental and Comparative Immunology. 67, 508-518 (2017).
  3. Chen, T., et al. Small-Sized mPEG-PLGA Nanoparticles of Schisantherin A with Sustained Release for Enhanced Brain Uptake and Anti-Parkinsonian Activity. ACS Applied Materials and Interfaces. 9 (11), 9516-9527 (2017).
  4. Collymore, C., Rasmussen, S., Tolwani, R. J. Gavaging Adult Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (78), e50691-e50691 (2013).
  5. Kim, S. H., Jang, Y. S. Antigen targeting to M cells for enhancing the efficacy of mucosal vaccines. Experimental and Molecular Medicine. 46 (3), 85 (2014).
  6. Iwasaki, A., Medzhitov, R. Regulation of adaptive immunity by the innate immune system. Science. 327 (5963), 291-295 (2010).
  7. Kunisawa, J., Kiyono, H. A marvel of mucosal T cells and secretory antibodies for the creation of first lines of defense. Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (12), 1308-1321 (2005).
  8. Rombout, J. H., Yang, G., Kiron, V. Adaptive immune responses at mucosal surfaces of teleost fish. Fish Shellfish Immunology. 40 (2), 634-643 (2014).
  9. Salinas, I. The Mucosal Immune System of Teleost Fish. Biology. 4, 525-539 (2015).
  10. Munang’andu, H. M., Mutoloki, S., Evensen, O. &. #. 2. 4. 8. ;. An overview of challenges limiting the design of protective mucosal vaccines for finfish. Frontiers in Immunology. 6, 542 (2015).
  11. Lickwar, C. R., et al. Genomic dissection of conserved transcriptional regulation in intestinal epithelial cells. PLoS Biology. 15 (8), 2002054 (2017).
  12. Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish. 261, 7-37 (2002).
  13. Rességuier, J., et al. Specific and efficient uptake of surfactant-free poly(lactic acid) nanovaccine vehicles by mucosal dendritic cells in adult zebrafish after bath immersion. Frontiers in Immunology. 8, 190 (2017).
  14. Kephart, D., Terry, G., Krueger, S., Hoffmann, K., Shenoi, H. High-Performance RNA Isolation Using the Maxwell 16 Total RNA Purification Kit. Promega Notes. , (2006).
  15. . Thermo Fisher Scientific NanoDrop 1000 spectrophotometer V3.8 user’s manual. Thermo Fisher Scientific Incorporation. , (2010).
  16. Lightfoot, S. Quantitation comparison of total RNA using the Agilent 2100 bioanalyzer, ribogreen analysis, and UV spectrometry. Agilent Application Note. , (2002).
  17. Huggett, J. F., et al. The digital MIQE guidelines: Minimum information for publication of quantitative digital PCR experiments. Clinical Chemistry. 59 (6), 892-902 (2013).
  18. Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR Journal. 53 (2), 192-204 (2012).
  19. Renshaw, S., Loynes, C. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  20. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), (2011).

Play Video

Cite This Article
Ji, J., Thwaite, R., Roher, N. Oral Intubation of Adult Zebrafish: A Model for Evaluating Intestinal Uptake of Bioactive Compounds. J. Vis. Exp. (139), e58366, doi:10.3791/58366 (2018).

View Video