Summary

Muntlig intubasjon av voksen sebrafisk: en modell for å vurdere Intestinal opptak av bioaktive forbindelser

Published: September 27, 2018
doi:

Summary

Protokollen beskriver intubere voksen sebrafisk med en biologisk; deretter dissekere og forbereder tarmen cytometri, AC confocal mikroskopi og qPCR. Denne metoden tillater administrasjon av bioaktive forbindelser å overvåke intestinal opptak og lokale immunforsvaret stimulans fremkalt. Det er relevant for testing intestinal dynamikken i muntlig profylaktiske ordninger.

Abstract

De fleste patogener invadere organismer gjennom deres mucosa. Dette gjelder særlig i fisk som de kontinuerlig utsatt for en mikrobiell-rik vann miljøet. Utvikle effektive metoder for muntlig levering av immunostimulants eller vaksiner, som aktiverer immunforsvaret mot smittsomme sykdommer, er svært ettertraktet. I utarbeide forebyggende verktøy, for god eksperimentelle modeller å teste resultatene. Her viser vi en metode for muntlig intubasjon av voksen sebrafisk og et sett av prosedyrer for å analysere og forberede tarmen cytometri, AC confocal mikroskopi og kvantitative polymerase kjedereaksjon (qPCR) analyse. Med denne protokollen, kan vi nettopp administrere volumer opptil 50 µL fiske veier ca 1 g enkelt og raskt, uten å skade dyr. Denne metoden tillater oss å utforske direkte i vivo opptaket av fluorescently merket forbindelser med tarmen og immunmodulerende kapasitet av slike biologiske på det lokale området etter intubasjon. Ved å kombinere nedstrøms metoder som flowcytometri, histology, qPCR og AC confocal mikroskopi av intestinal vev, kan vi forstå hvordan immunostimulants eller vaksiner er kunne krysse intestinal slimhinnene barrierer, passerer gjennom lamina propria, og nå muskler, øve en effekt på intestinal mucosal immunsystem. Modellen kan brukes til å teste kandidat muntlig profylaktiske ordninger og leveringssystemer eller lokale effekten av en muntlig-administrert bioaktive sammensatte.

Introduction

Målet med denne artikkelen er å beskrive i dybden en grei metode for muntlig intubasjon av sebrafisk, sammen med nyttige tilknyttede nedstrøms prosedyrer. Muntlig intubasjon bruker sebrafisk blitt en praktisk modell i studiet av infeksjonssykdommer dynamics, oral vaksine/immunostimulant, narkotika/hydrogenion opptak og effekt og intestinal slimhinnene immunitet. For eksempel har sebrafisk muntlig intubasjon blitt brukt i studiet av Mycobacterium marinum og Mycobacterium peregrinum infeksjon1. Lovmo et al. også brukt denne modellen til å levere nanopartikler og M. marinum til mage-tarmkanalen voksen sebrafisk2. I tillegg Chen et al. brukt sebrafisk muntlig intubasjon vise at narkotika innkapslet av nanopartikler, når administrert via mage-tarmkanalen, ble fraktet over blod hjernen barriere3. Disse forfatterne utført intubasjon basert på gauvage metoden beskrevet av Collymore et al. 4 med noen modifikasjoner. Men gir de ikke en svært detaljerte protokoll som beskriver muntlig intubasjon prosedyren. Her presenterer vi en metode for muntlig intubasjon av voksen sebrafisk bygger på Collymore et al. 4 vi videre inkluderer utarbeidelse av tarmen for relevante nedstrøms analyse av cytometri, AC confocal mikroskopi og qPCR.

Tarmen og spesielt dens mucosa er den første linjen i forsvaret mot infeksjon og hovedwebområdet av nærings-opptak5. Når de epitelceller og antigen-presentasjon innen mucosal barrierer oppfatter fare signaler, utløses en umiddelbar medfødte immunforsvaret. Neste, svært spesifikke adaptive immunforsvaret er etablert av T- og B-lymfocytter6,7. Utvikling av muntlig vaksiner er en gjeldende fokusområde i vaccinology. Slike vaksiner vil være et effektivt verktøy for å beskytte organismen utsatte områder på grunn av bestemte svaret av immunceller i mucosa-assosiert lymfoid vev (MALT)8,9. I akvakultur har mucosal vaksiner åpenbare fordeler sammenlignet med injiserbare vaksiner. De er praktisk for masse vaksinasjon, mindre arbeidskrevende, er mindre stressende for fisken, og kan administreres til unge fisken. Likevel må mucosal vaksine kandidater nå andre gut segmentet uten å bli denaturert i muntlig miljø. De må også krysse mucosal barrierer for å få tilgang til antigen presentere celler (APCs) å indusere lokale og/eller systemisk svar10. Derfor er testing av slimhinnene opptaket av kandidaten muntlig antigener og deres leveringsmidler, samt immunrespons fremkalt, viktig i utviklingen av muntlig vaksiner.

Utvikle en modell for å teste biologiske effekter av forbindelser etter muntlig intubasjon er økende interesse i biomedisinsk sammenheng. Mange av de anatomiske og fysiologiske funksjonene i tarmen er bevart mellom bilaterian linjene, pattedyr og bony fisker11. Denne muntlig intubasjon modellen koblet til nedstrøms kan være et verktøy for å gi innsikt i menneskets biologi, samt et prøvefelt for biologiske eller andre forbindelser i vivo.

Muntlig intubasjon protokollen kan utføres av en operatør, f.eksvellykket administrere opptil 50 µL av protein hydrogenion suspensjon fiske veiing 1 g, med en høy overlevelse. Fremgangsmåten er enkel å sette opp og rask; 30 fisk kan være intubated i 1 time. Protokollen for tarmen forberedelser er nøkkelen til å gi kvalitet celler og vev eksempler for senere analyse. Eksempler på nedstrømsresultater gis som viser protokollen nytte å skaffe data relatert til intestinal opptak og isolere kvalitet RNA for qPCR. Protokollen ville være for de som trenger en passende modell å teste dynamikken i muntlig profylaktiske ordninger eller andre forbindelser i tarmen.

Protocol

Alle eksperimentelle prosedyrer som involverer sebrafisk (Danio rerio) ble godkjent av den etiske komiteen av Universitat Autònoma de Barcelona (CEEH nummer 1582) med det internasjonale styrende prinsippet for forskning som involverer dyr ( EU 2010/63). Alle eksperimenter med live sebrafisk ble utført på 26-28 ° C. 1. forbereder utstyret muntlig intubasjon Legg ca 1 cm av en fin silikon rør på en 31 G Luer lås nål å dekke pinne-spissen. Kuttet en 10 µL st…

Representative Results

Sebrafisk (gjennomsnittlig vekt: 1,03 ± 0,16 g) av blandet sex var lykkes intubated med forskjellige rekombinante proteiner nanopartikler (bakteriell inkludering organer) ved hjelp av vårt hjemmelagde muntlig intubasjon enhet (figur 1). Vi har utført den muntlige intubasjon og oppnådde en lav gjennomsnittlig prosentandel dødelighet (6,8%) (Tabell 1). Sebrafisk var enten intubated med 30 µL eller 50 µL av hydrogenion suspensjoner og dø…

Discussion

Denne protokollen er en forbedring av den tidligere beskrevet teknikken for muntlig intubasjon ved Collymore et al. 4 vår beskriver i detalj metoden muntlig intubasjon og inkluderer utarbeidelse av tarmen for nedstrøms analyser. Vår metode forbedrer fisk manipulasjon fart slik at en person til å utføre hele protokollen raskt, uten mye variasjon mellom operatørene. Største forskjellen av våre protokollen med forrige er at vi evaluere hvor vellykket et muntlig intubasjon eksperiment…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra det spanske departementet for vitenskap, Europakommisjonen og AGAUR midler til NR (AGL2015-65129-R MINECO/FEDER og 2014SGR-345 AGAUR). RT har pre stipend fra AGAUR (Spania), JJ ble støttet av en PhD fellowship fra Kina stipend Council (Kina) og NR støttes av programmet Ramón y Cajal (RYC-2010-06210, 2010, MINECO). Vi takker Dr. Torrealba for ekspertråd i protein produksjon, N. Barba fra “Servei de Microscopia” og Dr. M. Costa fra “Servei de Citometria” av Universitat Autònoma de Barcelona for nyttig teknisk assistanse.

Materials

Silicon tube Dow Corning 508-001 0.30 mm inner diameter and 0.64 mm outer diameter
Luer lock needle Hamilton 7750-22 31 G, Kel-F Hub
Luer lock syringe Hamilton 81020/01 100 μL, Kel-F Hub
Filtered pipette tip Nerbe Plus 07-613-8300 10 μL
MS-222 Sigma Aldrich E10521 powder
10x PBS Sigma Aldrich P5493
Filter paper  Filter-Lab RM14034252
Collagenase Gibco 17104019
DMEM  Gibco 31966 Dulbecco's modified eagle medium
Penicillin and streptomycin Gibco 15240
Cell strainer Falcon 352360
CellTrics filters  Sysmex Partec 04-004-2326 (Wolflabs) 30 µm mesh size filters with 2 mL reservoir
Tissue-Tek O.C.T. compound SAKURA 4583
Plastic molds for cryosections SAKURA 4557 Disposable Vinyl molds. 25 mm x 20 mm x 5 mm
Slide Thermo Scientific 10149870 SuperFrost Plus slide
Cover glasses Labbox  COVN-024-200 24´24 mm
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich 158127
Atto-488 NHS ester Sigma-Aldrich 41698
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761
DMSO Sigma-Aldrich D8418
Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit Promega AS1340
1-Thioglycerol/Homogenization solution Promega Inside of Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit adding 20 μl 1-Thioglycerol to 1 ml homogenization solution (2%)
vertical laboratory rotator  Suministros Grupo Esper 10000-01062
Cryostat Leica  CM3050S
Homogenizer KINEMATICA Polytron PT1600E
Flow cytometer  Becton Dickinson FACS Canto
5 mL round bottom tube Falcon 352058
Confocal microscope Leica SP5
Fume Hood Kottermann 2-447 BST
Nanodrop 1000 Thermo Fisher Scientific ND-1000 Spectrophotometer
Agilent 2100 Bioanalyzer System Agilent G2939A RNA bioanalyzer
Maxwell Instrument Promega AS4500 
iScript cDNA synthesis kit  Bio-rad 1708891
CFX384 Real-Time PCR Detection System Bio-Rad 1855485
iTaq universal SYBR Green Supermix kit Bio-rad 172-5120
Water  Sigma-Aldrich W4502
Cryogenic vial  Thermo Fisher Scientific 375418 CryoTube vial
Mounting medium Sigma-Aldrich F6057 Fluoroshield with DAPI

References

  1. Harriff, M. J., Bermudez, L. E., Kent, M. L. Experimental exposure of zebrafish, Danio rerio (Hamilton), to Mycobacterium marinum and Mycobacterium peregrinum reveals the gastrointestinal tract as the primary route of infection: A potential model for environmental mycobacterial infection. Journal of Fish Diseases. 30 (10), 587-600 (2007).
  2. Lovmo, S. D., et al. Translocation of nanoparticles and Mycobacterium marinum across the intestinal epithelium in zebrafish and the role of the mucosal immune system. Developmental and Comparative Immunology. 67, 508-518 (2017).
  3. Chen, T., et al. Small-Sized mPEG-PLGA Nanoparticles of Schisantherin A with Sustained Release for Enhanced Brain Uptake and Anti-Parkinsonian Activity. ACS Applied Materials and Interfaces. 9 (11), 9516-9527 (2017).
  4. Collymore, C., Rasmussen, S., Tolwani, R. J. Gavaging Adult Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (78), e50691-e50691 (2013).
  5. Kim, S. H., Jang, Y. S. Antigen targeting to M cells for enhancing the efficacy of mucosal vaccines. Experimental and Molecular Medicine. 46 (3), 85 (2014).
  6. Iwasaki, A., Medzhitov, R. Regulation of adaptive immunity by the innate immune system. Science. 327 (5963), 291-295 (2010).
  7. Kunisawa, J., Kiyono, H. A marvel of mucosal T cells and secretory antibodies for the creation of first lines of defense. Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (12), 1308-1321 (2005).
  8. Rombout, J. H., Yang, G., Kiron, V. Adaptive immune responses at mucosal surfaces of teleost fish. Fish Shellfish Immunology. 40 (2), 634-643 (2014).
  9. Salinas, I. The Mucosal Immune System of Teleost Fish. Biology. 4, 525-539 (2015).
  10. Munang’andu, H. M., Mutoloki, S., Evensen, O. &. #. 2. 4. 8. ;. An overview of challenges limiting the design of protective mucosal vaccines for finfish. Frontiers in Immunology. 6, 542 (2015).
  11. Lickwar, C. R., et al. Genomic dissection of conserved transcriptional regulation in intestinal epithelial cells. PLoS Biology. 15 (8), 2002054 (2017).
  12. Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish. 261, 7-37 (2002).
  13. Rességuier, J., et al. Specific and efficient uptake of surfactant-free poly(lactic acid) nanovaccine vehicles by mucosal dendritic cells in adult zebrafish after bath immersion. Frontiers in Immunology. 8, 190 (2017).
  14. Kephart, D., Terry, G., Krueger, S., Hoffmann, K., Shenoi, H. High-Performance RNA Isolation Using the Maxwell 16 Total RNA Purification Kit. Promega Notes. , (2006).
  15. . Thermo Fisher Scientific NanoDrop 1000 spectrophotometer V3.8 user’s manual. Thermo Fisher Scientific Incorporation. , (2010).
  16. Lightfoot, S. Quantitation comparison of total RNA using the Agilent 2100 bioanalyzer, ribogreen analysis, and UV spectrometry. Agilent Application Note. , (2002).
  17. Huggett, J. F., et al. The digital MIQE guidelines: Minimum information for publication of quantitative digital PCR experiments. Clinical Chemistry. 59 (6), 892-902 (2013).
  18. Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR Journal. 53 (2), 192-204 (2012).
  19. Renshaw, S., Loynes, C. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  20. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), (2011).

Play Video

Cite This Article
Ji, J., Thwaite, R., Roher, N. Oral Intubation of Adult Zebrafish: A Model for Evaluating Intestinal Uptake of Bioactive Compounds. J. Vis. Exp. (139), e58366, doi:10.3791/58366 (2018).

View Video