Muntlig intubasjon av voksen sebrafisk: en modell for å vurdere Intestinal opptak av bioaktive forbindelser
Summary
Protokollen beskriver intubere voksen sebrafisk med en biologisk; deretter dissekere og forbereder tarmen cytometri, AC confocal mikroskopi og qPCR. Denne metoden tillater administrasjon av bioaktive forbindelser å overvåke intestinal opptak og lokale immunforsvaret stimulans fremkalt. Det er relevant for testing intestinal dynamikken i muntlig profylaktiske ordninger.
Abstract
De fleste patogener invadere organismer gjennom deres mucosa. Dette gjelder særlig i fisk som de kontinuerlig utsatt for en mikrobiell-rik vann miljøet. Utvikle effektive metoder for muntlig levering av immunostimulants eller vaksiner, som aktiverer immunforsvaret mot smittsomme sykdommer, er svært ettertraktet. I utarbeide forebyggende verktøy, for god eksperimentelle modeller å teste resultatene. Her viser vi en metode for muntlig intubasjon av voksen sebrafisk og et sett av prosedyrer for å analysere og forberede tarmen cytometri, AC confocal mikroskopi og kvantitative polymerase kjedereaksjon (qPCR) analyse. Med denne protokollen, kan vi nettopp administrere volumer opptil 50 µL fiske veier ca 1 g enkelt og raskt, uten å skade dyr. Denne metoden tillater oss å utforske direkte i vivo opptaket av fluorescently merket forbindelser med tarmen og immunmodulerende kapasitet av slike biologiske på det lokale området etter intubasjon. Ved å kombinere nedstrøms metoder som flowcytometri, histology, qPCR og AC confocal mikroskopi av intestinal vev, kan vi forstå hvordan immunostimulants eller vaksiner er kunne krysse intestinal slimhinnene barrierer, passerer gjennom lamina propria, og nå muskler, øve en effekt på intestinal mucosal immunsystem. Modellen kan brukes til å teste kandidat muntlig profylaktiske ordninger og leveringssystemer eller lokale effekten av en muntlig-administrert bioaktive sammensatte.
Introduction
Målet med denne artikkelen er å beskrive i dybden en grei metode for muntlig intubasjon av sebrafisk, sammen med nyttige tilknyttede nedstrøms prosedyrer. Muntlig intubasjon bruker sebrafisk blitt en praktisk modell i studiet av infeksjonssykdommer dynamics, oral vaksine/immunostimulant, narkotika/hydrogenion opptak og effekt og intestinal slimhinnene immunitet. For eksempel har sebrafisk muntlig intubasjon blitt brukt i studiet av Mycobacterium marinum og Mycobacterium peregrinum infeksjon1. Lovmo et al. også brukt denne modellen til å levere nanopartikler og M. marinum til mage-tarmkanalen voksen sebrafisk2. I tillegg Chen et al. brukt sebrafisk muntlig intubasjon vise at narkotika innkapslet av nanopartikler, når administrert via mage-tarmkanalen, ble fraktet over blod hjernen barriere3. Disse forfatterne utført intubasjon basert på gauvage metoden beskrevet av Collymore et al. 4 med noen modifikasjoner. Men gir de ikke en svært detaljerte protokoll som beskriver muntlig intubasjon prosedyren. Her presenterer vi en metode for muntlig intubasjon av voksen sebrafisk bygger på Collymore et al. 4 vi videre inkluderer utarbeidelse av tarmen for relevante nedstrøms analyse av cytometri, AC confocal mikroskopi og qPCR.
Tarmen og spesielt dens mucosa er den første linjen i forsvaret mot infeksjon og hovedwebområdet av nærings-opptak5. Når de epitelceller og antigen-presentasjon innen mucosal barrierer oppfatter fare signaler, utløses en umiddelbar medfødte immunforsvaret. Neste, svært spesifikke adaptive immunforsvaret er etablert av T- og B-lymfocytter6,7. Utvikling av muntlig vaksiner er en gjeldende fokusområde i vaccinology. Slike vaksiner vil være et effektivt verktøy for å beskytte organismen utsatte områder på grunn av bestemte svaret av immunceller i mucosa-assosiert lymfoid vev (MALT)8,9. I akvakultur har mucosal vaksiner åpenbare fordeler sammenlignet med injiserbare vaksiner. De er praktisk for masse vaksinasjon, mindre arbeidskrevende, er mindre stressende for fisken, og kan administreres til unge fisken. Likevel må mucosal vaksine kandidater nå andre gut segmentet uten å bli denaturert i muntlig miljø. De må også krysse mucosal barrierer for å få tilgang til antigen presentere celler (APCs) å indusere lokale og/eller systemisk svar10. Derfor er testing av slimhinnene opptaket av kandidaten muntlig antigener og deres leveringsmidler, samt immunrespons fremkalt, viktig i utviklingen av muntlig vaksiner.
Utvikle en modell for å teste biologiske effekter av forbindelser etter muntlig intubasjon er økende interesse i biomedisinsk sammenheng. Mange av de anatomiske og fysiologiske funksjonene i tarmen er bevart mellom bilaterian linjene, pattedyr og bony fisker11. Denne muntlig intubasjon modellen koblet til nedstrøms kan være et verktøy for å gi innsikt i menneskets biologi, samt et prøvefelt for biologiske eller andre forbindelser i vivo.
Muntlig intubasjon protokollen kan utføres av en operatør, f.eksvellykket administrere opptil 50 µL av protein hydrogenion suspensjon fiske veiing 1 g, med en høy overlevelse. Fremgangsmåten er enkel å sette opp og rask; 30 fisk kan være intubated i 1 time. Protokollen for tarmen forberedelser er nøkkelen til å gi kvalitet celler og vev eksempler for senere analyse. Eksempler på nedstrømsresultater gis som viser protokollen nytte å skaffe data relatert til intestinal opptak og isolere kvalitet RNA for qPCR. Protokollen ville være for de som trenger en passende modell å teste dynamikken i muntlig profylaktiske ordninger eller andre forbindelser i tarmen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen er en forbedring av den tidligere beskrevet teknikken for muntlig intubasjon ved Collymore et al. 4 vår beskriver i detalj metoden muntlig intubasjon og inkluderer utarbeidelse av tarmen for nedstrøms analyser. Vår metode forbedrer fisk manipulasjon fart slik at en person til å utføre hele protokollen raskt, uten mye variasjon mellom operatørene. Største forskjellen av våre protokollen med forrige er at vi evaluere hvor vellykket et muntlig intubasjon eksperiment…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra det spanske departementet for vitenskap, Europakommisjonen og AGAUR midler til NR (AGL2015-65129-R MINECO/FEDER og 2014SGR-345 AGAUR). RT har pre stipend fra AGAUR (Spania), JJ ble støttet av en PhD fellowship fra Kina stipend Council (Kina) og NR støttes av programmet Ramón y Cajal (RYC-2010-06210, 2010, MINECO). Vi takker Dr. Torrealba for ekspertråd i protein produksjon, N. Barba fra “Servei de Microscopia” og Dr. M. Costa fra “Servei de Citometria” av Universitat Autònoma de Barcelona for nyttig teknisk assistanse.
Materials
| Silicon tube | Dow Corning | 508-001 | 0.30 mm inner diameter and 0.64 mm outer diameter |
| Luer lock needle | Hamilton | 7750-22 | 31 G, Kel-F Hub |
| Luer lock syringe | Hamilton | 81020/01 | 100 μL, Kel-F Hub |
| Filtered pipette tip | Nerbe Plus | 07-613-8300 | 10 μL |
| MS-222 | Sigma Aldrich | E10521 | powder |
| 10x PBS | Sigma Aldrich | P5493 | |
| Filter paper | Filter-Lab | RM14034252 | |
| Collagenase | Gibco | 17104019 | |
| DMEM | Gibco | 31966 | Dulbecco's modified eagle medium |
| Penicillin and streptomycin | Gibco | 15240 | |
| Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| CellTrics filters | Sysmex Partec | 04-004-2326 (Wolflabs) | 30 µm mesh size filters with 2 mL reservoir |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | SAKURA | 4583 | |
| Plastic molds for cryosections | SAKURA | 4557 | Disposable Vinyl molds. 25 mm x 20 mm x 5 mm |
| Slide | Thermo Scientific | 10149870 | SuperFrost Plus slide |
| Cover glasses | Labbox | COVN-024-200 | 24´24 mm |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Atto-488 NHS ester | Sigma-Aldrich | 41698 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit | Promega | AS1340 | |
| 1-Thioglycerol/Homogenization solution | Promega | Inside of Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit | adding 20 μl 1-Thioglycerol to 1 ml homogenization solution (2%) |
| vertical laboratory rotator | Suministros Grupo Esper | 10000-01062 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| Homogenizer | KINEMATICA | Polytron PT1600E | |
| Flow cytometer | Becton Dickinson | FACS Canto | |
| 5 mL round bottom tube | Falcon | 352058 | |
| Confocal microscope | Leica | SP5 | |
| Fume Hood | Kottermann | 2-447 BST | |
| Nanodrop 1000 | Thermo Fisher Scientific | ND-1000 | Spectrophotometer |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent | G2939A | RNA bioanalyzer |
| Maxwell Instrument | Promega | AS4500 | |
| iScript cDNA synthesis kit | Bio-rad | 1708891 | |
| CFX384 Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855485 | |
| iTaq universal SYBR Green Supermix kit | Bio-rad | 172-5120 | |
| Water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Cryogenic vial | Thermo Fisher Scientific | 375418 | CryoTube vial |
| Mounting medium | Sigma-Aldrich | F6057 | Fluoroshield with DAPI |
References
- Harriff, M. J., Bermudez, L. E., Kent, M. L. Experimental exposure of zebrafish, Danio rerio (Hamilton), to Mycobacterium marinum and Mycobacterium peregrinum reveals the gastrointestinal tract as the primary route of infection: A potential model for environmental mycobacterial infection. Journal of Fish Diseases. 30 (10), 587-600 (2007).
- Lovmo, S. D., et al. Translocation of nanoparticles and Mycobacterium marinum across the intestinal epithelium in zebrafish and the role of the mucosal immune system. Developmental and Comparative Immunology. 67, 508-518 (2017).
- Chen, T., et al. Small-Sized mPEG-PLGA Nanoparticles of Schisantherin A with Sustained Release for Enhanced Brain Uptake and Anti-Parkinsonian Activity. ACS Applied Materials and Interfaces. 9 (11), 9516-9527 (2017).
- Collymore, C., Rasmussen, S., Tolwani, R. J. Gavaging Adult Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (78), e50691-e50691 (2013).
- Kim, S. H., Jang, Y. S. Antigen targeting to M cells for enhancing the efficacy of mucosal vaccines. Experimental and Molecular Medicine. 46 (3), 85 (2014).
- Iwasaki, A., Medzhitov, R. Regulation of adaptive immunity by the innate immune system. Science. 327 (5963), 291-295 (2010).
- Kunisawa, J., Kiyono, H. A marvel of mucosal T cells and secretory antibodies for the creation of first lines of defense. Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (12), 1308-1321 (2005).
- Rombout, J. H., Yang, G., Kiron, V. Adaptive immune responses at mucosal surfaces of teleost fish. Fish Shellfish Immunology. 40 (2), 634-643 (2014).
- Salinas, I. The Mucosal Immune System of Teleost Fish. Biology. 4, 525-539 (2015).
- Munang’andu, H. M., Mutoloki, S., Evensen, O. &. #. 2. 4. 8. ;. An overview of challenges limiting the design of protective mucosal vaccines for finfish. Frontiers in Immunology. 6, 542 (2015).
- Lickwar, C. R., et al. Genomic dissection of conserved transcriptional regulation in intestinal epithelial cells. PLoS Biology. 15 (8), 2002054 (2017).
- Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish. 261, 7-37 (2002).
- Rességuier, J., et al. Specific and efficient uptake of surfactant-free poly(lactic acid) nanovaccine vehicles by mucosal dendritic cells in adult zebrafish after bath immersion. Frontiers in Immunology. 8, 190 (2017).
- Kephart, D., Terry, G., Krueger, S., Hoffmann, K., Shenoi, H. High-Performance RNA Isolation Using the Maxwell 16 Total RNA Purification Kit. Promega Notes. , (2006).
- . Thermo Fisher Scientific NanoDrop 1000 spectrophotometer V3.8 user’s manual. Thermo Fisher Scientific Incorporation. , (2010).
- Lightfoot, S. Quantitation comparison of total RNA using the Agilent 2100 bioanalyzer, ribogreen analysis, and UV spectrometry. Agilent Application Note. , (2002).
- Huggett, J. F., et al. The digital MIQE guidelines: Minimum information for publication of quantitative digital PCR experiments. Clinical Chemistry. 59 (6), 892-902 (2013).
- Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR Journal. 53 (2), 192-204 (2012).
- Renshaw, S., Loynes, C. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), (2011).
