Summary

Muntliga Intubation av vuxen zebrafiskar: en modell för utvärdering av tarmens upptag av bioaktiva föreningar

Published: September 27, 2018
doi:

Summary

Protokollet beskrivs intubating vuxen zebrafiskar med en biologisk; sedan dissekera och förbereder tarmen för flödescytometri, konfokalmikroskopi och qPCR. Denna metod tillåter administration av bioaktiva föreningar att övervaka tarmens upptag och den lokala immunförsvaret stimulans framkallat. Det är relevant för att testa intestinal dynamiken i oral profylax.

Abstract

De flesta patogener invadera organismer genom deras slemhinna. Detta är särskilt sant i fisk eftersom de utsätts kontinuerligt för mikrobiell-rika vatten. Det är önskvärt att utveckla effektiva metoder för muntliga leverans av immunstimulatorer eller vacciner, som aktiverar immunförsvaret mot infektionssjukdomar. Utforma förebyggande verktyg, behövs bra experimentella modeller för att testa deras prestanda. Här visar vi en metod för oral intubation av vuxen zebrafiskar och en uppsättning förfaranden att dissekera och förbereda tarmen för flödescytometri, konfokalmikroskopi och kvantitativa polymerasen kedjar reaktion (qPCR) analys. Med detta protokoll, kan vi just administrera volymer upp till 50 µL till fisk väger cirka 1 g snabbt och enkelt, utan att skada djuren. Denna metod tillåter oss att utforska direkt i vivo upptaget av fluorescently märkta föreningar genom tarmslemhinnan och immunmodulerande kapacitet sådan biologics på den lokala platsen efter intubation. Genom att kombinera nedströms metoder såsom flödescytometri, histologi, qPCR och konfokalmikroskopi av intestinal vävnad, kan vi förstå hur immunstimulatorer eller vacciner ska kunna passera intestinal mucosal hindren, passera genom lamina propria, och nå muskeln, att utöva en effekt på tarmens slemhinnor immunsystemet. Modellen kan användas för att testa kandidaten oral profylax och leveranssystem eller lokala effekten av oralt administrerat bioaktiva föreningar.

Introduction

Målet med denna artikel är att beskriva på djupet en enkel metod för oral intubation av zebrafiskar, tillsammans med användbar associerade nedströms förfaranden. Muntliga intubation med zebrafisk har blivit en praktisk modell i studien av infektionssjukdom dynamics, oral vaccin/immunostimulant, drog/nanopartiklar upptag och effekt och tarmens slemhinnor immunitet. Zebrafiskar muntliga intubation har exempelvis använts i studien av Mycobacterium marinum och Mycobacterium peregrinum infektion1. Lovmo et al. även använt framgångsrikt denna modell för att leverera nanopartiklar och M. marinum till mag-tarmkanalen av vuxen zebrafiskar2. Dessutom används Chen et al. zebrafiskar muntliga intubation för att visa att droger inkapslat av nanopartiklar, när administrerade via mag-tarmkanalen, transporterades över blod hjärna barriären3. Dessa författare utförs intubation baserat på den gauvage metod som beskrivs av Collymore o.a. 4 med vissa ändringar. De dock inte ge ett mycket detaljerade protokoll som beskriver förfarandet för oral intubation. Här presenterar vi en metod för oral intubation av vuxen zebrafiskar byggnad på Collymore o.a. 4 vi ytterligare omfattar utarbetandet av tarmen för relevanta efterföljande analys av flödescytometri, konfokalmikroskopi och qPCR.

Tarmen och särskilt dess slemhinna är den första linjen försvar mot infektion och den primära platsen näringsupptag5. När de epitelceller och antigen-presenterande celler inom slemhinnor hinder uppfatta varningssignaler, utlöses en omedelbar medfödda immunsvar. Nästa, mycket specifika adaptiva immunsvaret är etablerad av T- och B-lymfocyter6,7. Utvecklingen av orala vacciner är ett nuvarande fokusområde i vaccinologi. Sådana vacciner skulle vara ett effektivt verktyg att skydda organismen på utsatta platser på grund av den specifika Svaren av immunceller i mukosa-associerad lymfoid vävnad (MALT)8,9. I vattenbruk har mucosal vacciner uppenbara fördelar jämfört med injicerbara vacciner. De är praktiska för massvaccinering, mindre arbetsintensiva, är mindre stressande för fisken, och kan ges till unga fiskar. Dock måste slemhinnor vaccinkandidater nå det andra gut-segmentet utan att denatureras i den orala miljön. De måste också passera slemhinnor hinder för att få tillgång till antigenpresenterande celler (APC) att förmå lokala eller systemiska Svaren10. Provning av slemhinnor upptaget genom kandidat muntliga antigener och deras leverans system, är samt immunsvar framkallat, därför viktiga i utvecklingen av orala vacciner.

I biomedicinsk sammanhang, utveckla en modell för att testa biologiska effekter av föreningar efter oral intubation är av växande intresse. Många av de anatomiska och fysiologiska funktionerna i tarmen bevaras mellan tidigkambriska härstamningar, med däggdjur och bony fiskar11. Denna muntliga intubation modell ansluten till nedströms analys kan vara ett verktyg för att ge insikter i människans biologi, liksom en testbana för biologiska läkemedel eller andra ämnen i vivo.

Protokollet muntliga intubation kan utföras av en operatör, t.ex., framgångsrikt administrera upp till 50 µL av den protein nanopartiklar suspensionen att fiska väger 1 g, med en hög överlevnad. Proceduren är enkel att konfigurera och snabb; 30 fisk kan vara intuberade i 1 h. Protokollet för tarmen förberedelse är nyckeln till att ge kvalitet cell- och prover för efterföljande analys. Det ges exempel på nedströms resultat som visar protokollets nyttan i att erhålla data relaterade till tarmens upptag och isolera kvalitet RNA för qPCR. Protokollet skulle vara till stor nytta för dem som behöver en passande modell att testa dynamiken i oral profylax eller andra föreningar i tarmen.

Protocol

Alla experimentella rutiner som innefattar zebrafiskar (Danio rerio) bemyndigades av etikkommitté av Universitat Autònoma de Barcelona (CEEH nummer 1582) i samförstånd med de internationella vägledande principer för forskning som involverar djur ( EU 2010/63). Alla experiment med levande zebrafiskar framfördes på 26 – 28 ° C. 1. förbereda utrustningen för Oral Intubation Placera ca 1 cm på en fin silikon tub på 31 G Luer lås nål att täcka nålspetsen. …

Representative Results

Sebrafisken (Genomsnittlig vikt: 1,03 ± 0,16 g) av blandade kön var framgångsrikt intuberade med olika rekombinant protein nanopartiklar (bakteriell inkludering organ) med vår hemgjorda muntliga intubation enhet (figur 1). Vi har framgångsrikt utfört den muntliga intubation och uppnått en låg genomsnittlig andel dödlighet (6,8%) (Tabell 1). Zebrafiskar var antingen intuberade med 30 µL eller 50 µL av nanopartiklar suspensioner och …

Discussion

Detta protokoll är en förbättring av den tidigare beskrivna tekniken för oral intubation av Collymore o.a. 4 våra protokoll i detalj beskriver metoden muntliga intubation och omfattar utarbetande av tarmen för nedströms analyser. Vår metod förbättrar fisk manipulation hastigheten att tillåta en person att utföra hela protokollet snabbt, utan mycket variation mellan operatörer. En största skillnaden i våra protokoll med tidigare är att vi utvärdera framgången för ett mun…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöds av bidrag från det spanska ministeriet för vetenskap, Europeiska kommissionen och AGAUR medel till NR (AGL2015-65129-R MINECO/FEDER och 2014SGR-345 AGAUR). RT innehar en pre doktorand stipendium från AGAUR (Spanien), JJ stöddes av en PhD stipendium från Kina stipendium rådet (Kina) och NR stöds av programmet Ramón y Cajal (RYC-2010-06210, 2010, MINECO). Vi tackar Dr. Torrealba för expertråd i proteinproduktion, N. Barba från den ”Servei de Microscopia” och Dr. M. Costa från den ”Servei de Citometria” av den Universitat Autònoma de Barcelona för bra tekniskt stöd.

Materials

Silicon tube Dow Corning 508-001 0.30 mm inner diameter and 0.64 mm outer diameter
Luer lock needle Hamilton 7750-22 31 G, Kel-F Hub
Luer lock syringe Hamilton 81020/01 100 μL, Kel-F Hub
Filtered pipette tip Nerbe Plus 07-613-8300 10 μL
MS-222 Sigma Aldrich E10521 powder
10x PBS Sigma Aldrich P5493
Filter paper  Filter-Lab RM14034252
Collagenase Gibco 17104019
DMEM  Gibco 31966 Dulbecco's modified eagle medium
Penicillin and streptomycin Gibco 15240
Cell strainer Falcon 352360
CellTrics filters  Sysmex Partec 04-004-2326 (Wolflabs) 30 µm mesh size filters with 2 mL reservoir
Tissue-Tek O.C.T. compound SAKURA 4583
Plastic molds for cryosections SAKURA 4557 Disposable Vinyl molds. 25 mm x 20 mm x 5 mm
Slide Thermo Scientific 10149870 SuperFrost Plus slide
Cover glasses Labbox  COVN-024-200 24´24 mm
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich 158127
Atto-488 NHS ester Sigma-Aldrich 41698
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761
DMSO Sigma-Aldrich D8418
Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit Promega AS1340
1-Thioglycerol/Homogenization solution Promega Inside of Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit adding 20 μl 1-Thioglycerol to 1 ml homogenization solution (2%)
vertical laboratory rotator  Suministros Grupo Esper 10000-01062
Cryostat Leica  CM3050S
Homogenizer KINEMATICA Polytron PT1600E
Flow cytometer  Becton Dickinson FACS Canto
5 mL round bottom tube Falcon 352058
Confocal microscope Leica SP5
Fume Hood Kottermann 2-447 BST
Nanodrop 1000 Thermo Fisher Scientific ND-1000 Spectrophotometer
Agilent 2100 Bioanalyzer System Agilent G2939A RNA bioanalyzer
Maxwell Instrument Promega AS4500 
iScript cDNA synthesis kit  Bio-rad 1708891
CFX384 Real-Time PCR Detection System Bio-Rad 1855485
iTaq universal SYBR Green Supermix kit Bio-rad 172-5120
Water  Sigma-Aldrich W4502
Cryogenic vial  Thermo Fisher Scientific 375418 CryoTube vial
Mounting medium Sigma-Aldrich F6057 Fluoroshield with DAPI

References

  1. Harriff, M. J., Bermudez, L. E., Kent, M. L. Experimental exposure of zebrafish, Danio rerio (Hamilton), to Mycobacterium marinum and Mycobacterium peregrinum reveals the gastrointestinal tract as the primary route of infection: A potential model for environmental mycobacterial infection. Journal of Fish Diseases. 30 (10), 587-600 (2007).
  2. Lovmo, S. D., et al. Translocation of nanoparticles and Mycobacterium marinum across the intestinal epithelium in zebrafish and the role of the mucosal immune system. Developmental and Comparative Immunology. 67, 508-518 (2017).
  3. Chen, T., et al. Small-Sized mPEG-PLGA Nanoparticles of Schisantherin A with Sustained Release for Enhanced Brain Uptake and Anti-Parkinsonian Activity. ACS Applied Materials and Interfaces. 9 (11), 9516-9527 (2017).
  4. Collymore, C., Rasmussen, S., Tolwani, R. J. Gavaging Adult Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (78), e50691-e50691 (2013).
  5. Kim, S. H., Jang, Y. S. Antigen targeting to M cells for enhancing the efficacy of mucosal vaccines. Experimental and Molecular Medicine. 46 (3), 85 (2014).
  6. Iwasaki, A., Medzhitov, R. Regulation of adaptive immunity by the innate immune system. Science. 327 (5963), 291-295 (2010).
  7. Kunisawa, J., Kiyono, H. A marvel of mucosal T cells and secretory antibodies for the creation of first lines of defense. Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (12), 1308-1321 (2005).
  8. Rombout, J. H., Yang, G., Kiron, V. Adaptive immune responses at mucosal surfaces of teleost fish. Fish Shellfish Immunology. 40 (2), 634-643 (2014).
  9. Salinas, I. The Mucosal Immune System of Teleost Fish. Biology. 4, 525-539 (2015).
  10. Munang’andu, H. M., Mutoloki, S., Evensen, O. &. #. 2. 4. 8. ;. An overview of challenges limiting the design of protective mucosal vaccines for finfish. Frontiers in Immunology. 6, 542 (2015).
  11. Lickwar, C. R., et al. Genomic dissection of conserved transcriptional regulation in intestinal epithelial cells. PLoS Biology. 15 (8), 2002054 (2017).
  12. Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish. 261, 7-37 (2002).
  13. Rességuier, J., et al. Specific and efficient uptake of surfactant-free poly(lactic acid) nanovaccine vehicles by mucosal dendritic cells in adult zebrafish after bath immersion. Frontiers in Immunology. 8, 190 (2017).
  14. Kephart, D., Terry, G., Krueger, S., Hoffmann, K., Shenoi, H. High-Performance RNA Isolation Using the Maxwell 16 Total RNA Purification Kit. Promega Notes. , (2006).
  15. . Thermo Fisher Scientific NanoDrop 1000 spectrophotometer V3.8 user’s manual. Thermo Fisher Scientific Incorporation. , (2010).
  16. Lightfoot, S. Quantitation comparison of total RNA using the Agilent 2100 bioanalyzer, ribogreen analysis, and UV spectrometry. Agilent Application Note. , (2002).
  17. Huggett, J. F., et al. The digital MIQE guidelines: Minimum information for publication of quantitative digital PCR experiments. Clinical Chemistry. 59 (6), 892-902 (2013).
  18. Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR Journal. 53 (2), 192-204 (2012).
  19. Renshaw, S., Loynes, C. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  20. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), (2011).

Play Video

Cite This Article
Ji, J., Thwaite, R., Roher, N. Oral Intubation of Adult Zebrafish: A Model for Evaluating Intestinal Uptake of Bioactive Compounds. J. Vis. Exp. (139), e58366, doi:10.3791/58366 (2018).

View Video