Muntliga Intubation av vuxen zebrafiskar: en modell för utvärdering av tarmens upptag av bioaktiva föreningar
Summary
Protokollet beskrivs intubating vuxen zebrafiskar med en biologisk; sedan dissekera och förbereder tarmen för flödescytometri, konfokalmikroskopi och qPCR. Denna metod tillåter administration av bioaktiva föreningar att övervaka tarmens upptag och den lokala immunförsvaret stimulans framkallat. Det är relevant för att testa intestinal dynamiken i oral profylax.
Abstract
De flesta patogener invadera organismer genom deras slemhinna. Detta är särskilt sant i fisk eftersom de utsätts kontinuerligt för mikrobiell-rika vatten. Det är önskvärt att utveckla effektiva metoder för muntliga leverans av immunstimulatorer eller vacciner, som aktiverar immunförsvaret mot infektionssjukdomar. Utforma förebyggande verktyg, behövs bra experimentella modeller för att testa deras prestanda. Här visar vi en metod för oral intubation av vuxen zebrafiskar och en uppsättning förfaranden att dissekera och förbereda tarmen för flödescytometri, konfokalmikroskopi och kvantitativa polymerasen kedjar reaktion (qPCR) analys. Med detta protokoll, kan vi just administrera volymer upp till 50 µL till fisk väger cirka 1 g snabbt och enkelt, utan att skada djuren. Denna metod tillåter oss att utforska direkt i vivo upptaget av fluorescently märkta föreningar genom tarmslemhinnan och immunmodulerande kapacitet sådan biologics på den lokala platsen efter intubation. Genom att kombinera nedströms metoder såsom flödescytometri, histologi, qPCR och konfokalmikroskopi av intestinal vävnad, kan vi förstå hur immunstimulatorer eller vacciner ska kunna passera intestinal mucosal hindren, passera genom lamina propria, och nå muskeln, att utöva en effekt på tarmens slemhinnor immunsystemet. Modellen kan användas för att testa kandidaten oral profylax och leveranssystem eller lokala effekten av oralt administrerat bioaktiva föreningar.
Introduction
Målet med denna artikel är att beskriva på djupet en enkel metod för oral intubation av zebrafiskar, tillsammans med användbar associerade nedströms förfaranden. Muntliga intubation med zebrafisk har blivit en praktisk modell i studien av infektionssjukdom dynamics, oral vaccin/immunostimulant, drog/nanopartiklar upptag och effekt och tarmens slemhinnor immunitet. Zebrafiskar muntliga intubation har exempelvis använts i studien av Mycobacterium marinum och Mycobacterium peregrinum infektion1. Lovmo et al. även använt framgångsrikt denna modell för att leverera nanopartiklar och M. marinum till mag-tarmkanalen av vuxen zebrafiskar2. Dessutom används Chen et al. zebrafiskar muntliga intubation för att visa att droger inkapslat av nanopartiklar, när administrerade via mag-tarmkanalen, transporterades över blod hjärna barriären3. Dessa författare utförs intubation baserat på den gauvage metod som beskrivs av Collymore o.a. 4 med vissa ändringar. De dock inte ge ett mycket detaljerade protokoll som beskriver förfarandet för oral intubation. Här presenterar vi en metod för oral intubation av vuxen zebrafiskar byggnad på Collymore o.a. 4 vi ytterligare omfattar utarbetandet av tarmen för relevanta efterföljande analys av flödescytometri, konfokalmikroskopi och qPCR.
Tarmen och särskilt dess slemhinna är den första linjen försvar mot infektion och den primära platsen näringsupptag5. När de epitelceller och antigen-presenterande celler inom slemhinnor hinder uppfatta varningssignaler, utlöses en omedelbar medfödda immunsvar. Nästa, mycket specifika adaptiva immunsvaret är etablerad av T- och B-lymfocyter6,7. Utvecklingen av orala vacciner är ett nuvarande fokusområde i vaccinologi. Sådana vacciner skulle vara ett effektivt verktyg att skydda organismen på utsatta platser på grund av den specifika Svaren av immunceller i mukosa-associerad lymfoid vävnad (MALT)8,9. I vattenbruk har mucosal vacciner uppenbara fördelar jämfört med injicerbara vacciner. De är praktiska för massvaccinering, mindre arbetsintensiva, är mindre stressande för fisken, och kan ges till unga fiskar. Dock måste slemhinnor vaccinkandidater nå det andra gut-segmentet utan att denatureras i den orala miljön. De måste också passera slemhinnor hinder för att få tillgång till antigenpresenterande celler (APC) att förmå lokala eller systemiska Svaren10. Provning av slemhinnor upptaget genom kandidat muntliga antigener och deras leverans system, är samt immunsvar framkallat, därför viktiga i utvecklingen av orala vacciner.
I biomedicinsk sammanhang, utveckla en modell för att testa biologiska effekter av föreningar efter oral intubation är av växande intresse. Många av de anatomiska och fysiologiska funktionerna i tarmen bevaras mellan tidigkambriska härstamningar, med däggdjur och bony fiskar11. Denna muntliga intubation modell ansluten till nedströms analys kan vara ett verktyg för att ge insikter i människans biologi, liksom en testbana för biologiska läkemedel eller andra ämnen i vivo.
Protokollet muntliga intubation kan utföras av en operatör, t.ex., framgångsrikt administrera upp till 50 µL av den protein nanopartiklar suspensionen att fiska väger 1 g, med en hög överlevnad. Proceduren är enkel att konfigurera och snabb; 30 fisk kan vara intuberade i 1 h. Protokollet för tarmen förberedelse är nyckeln till att ge kvalitet cell- och prover för efterföljande analys. Det ges exempel på nedströms resultat som visar protokollets nyttan i att erhålla data relaterade till tarmens upptag och isolera kvalitet RNA för qPCR. Protokollet skulle vara till stor nytta för dem som behöver en passande modell att testa dynamiken i oral profylax eller andra föreningar i tarmen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll är en förbättring av den tidigare beskrivna tekniken för oral intubation av Collymore o.a. 4 våra protokoll i detalj beskriver metoden muntliga intubation och omfattar utarbetande av tarmen för nedströms analyser. Vår metod förbättrar fisk manipulation hastigheten att tillåta en person att utföra hela protokollet snabbt, utan mycket variation mellan operatörer. En största skillnaden i våra protokoll med tidigare är att vi utvärdera framgången för ett mun…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av bidrag från det spanska ministeriet för vetenskap, Europeiska kommissionen och AGAUR medel till NR (AGL2015-65129-R MINECO/FEDER och 2014SGR-345 AGAUR). RT innehar en pre doktorand stipendium från AGAUR (Spanien), JJ stöddes av en PhD stipendium från Kina stipendium rådet (Kina) och NR stöds av programmet Ramón y Cajal (RYC-2010-06210, 2010, MINECO). Vi tackar Dr. Torrealba för expertråd i proteinproduktion, N. Barba från den ”Servei de Microscopia” och Dr. M. Costa från den ”Servei de Citometria” av den Universitat Autònoma de Barcelona för bra tekniskt stöd.
Materials
| Silicon tube | Dow Corning | 508-001 | 0.30 mm inner diameter and 0.64 mm outer diameter |
| Luer lock needle | Hamilton | 7750-22 | 31 G, Kel-F Hub |
| Luer lock syringe | Hamilton | 81020/01 | 100 μL, Kel-F Hub |
| Filtered pipette tip | Nerbe Plus | 07-613-8300 | 10 μL |
| MS-222 | Sigma Aldrich | E10521 | powder |
| 10x PBS | Sigma Aldrich | P5493 | |
| Filter paper | Filter-Lab | RM14034252 | |
| Collagenase | Gibco | 17104019 | |
| DMEM | Gibco | 31966 | Dulbecco's modified eagle medium |
| Penicillin and streptomycin | Gibco | 15240 | |
| Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| CellTrics filters | Sysmex Partec | 04-004-2326 (Wolflabs) | 30 µm mesh size filters with 2 mL reservoir |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | SAKURA | 4583 | |
| Plastic molds for cryosections | SAKURA | 4557 | Disposable Vinyl molds. 25 mm x 20 mm x 5 mm |
| Slide | Thermo Scientific | 10149870 | SuperFrost Plus slide |
| Cover glasses | Labbox | COVN-024-200 | 24´24 mm |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Atto-488 NHS ester | Sigma-Aldrich | 41698 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit | Promega | AS1340 | |
| 1-Thioglycerol/Homogenization solution | Promega | Inside of Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit | adding 20 μl 1-Thioglycerol to 1 ml homogenization solution (2%) |
| vertical laboratory rotator | Suministros Grupo Esper | 10000-01062 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| Homogenizer | KINEMATICA | Polytron PT1600E | |
| Flow cytometer | Becton Dickinson | FACS Canto | |
| 5 mL round bottom tube | Falcon | 352058 | |
| Confocal microscope | Leica | SP5 | |
| Fume Hood | Kottermann | 2-447 BST | |
| Nanodrop 1000 | Thermo Fisher Scientific | ND-1000 | Spectrophotometer |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent | G2939A | RNA bioanalyzer |
| Maxwell Instrument | Promega | AS4500 | |
| iScript cDNA synthesis kit | Bio-rad | 1708891 | |
| CFX384 Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855485 | |
| iTaq universal SYBR Green Supermix kit | Bio-rad | 172-5120 | |
| Water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Cryogenic vial | Thermo Fisher Scientific | 375418 | CryoTube vial |
| Mounting medium | Sigma-Aldrich | F6057 | Fluoroshield with DAPI |
References
- Harriff, M. J., Bermudez, L. E., Kent, M. L. Experimental exposure of zebrafish, Danio rerio (Hamilton), to Mycobacterium marinum and Mycobacterium peregrinum reveals the gastrointestinal tract as the primary route of infection: A potential model for environmental mycobacterial infection. Journal of Fish Diseases. 30 (10), 587-600 (2007).
- Lovmo, S. D., et al. Translocation of nanoparticles and Mycobacterium marinum across the intestinal epithelium in zebrafish and the role of the mucosal immune system. Developmental and Comparative Immunology. 67, 508-518 (2017).
- Chen, T., et al. Small-Sized mPEG-PLGA Nanoparticles of Schisantherin A with Sustained Release for Enhanced Brain Uptake and Anti-Parkinsonian Activity. ACS Applied Materials and Interfaces. 9 (11), 9516-9527 (2017).
- Collymore, C., Rasmussen, S., Tolwani, R. J. Gavaging Adult Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (78), e50691-e50691 (2013).
- Kim, S. H., Jang, Y. S. Antigen targeting to M cells for enhancing the efficacy of mucosal vaccines. Experimental and Molecular Medicine. 46 (3), 85 (2014).
- Iwasaki, A., Medzhitov, R. Regulation of adaptive immunity by the innate immune system. Science. 327 (5963), 291-295 (2010).
- Kunisawa, J., Kiyono, H. A marvel of mucosal T cells and secretory antibodies for the creation of first lines of defense. Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (12), 1308-1321 (2005).
- Rombout, J. H., Yang, G., Kiron, V. Adaptive immune responses at mucosal surfaces of teleost fish. Fish Shellfish Immunology. 40 (2), 634-643 (2014).
- Salinas, I. The Mucosal Immune System of Teleost Fish. Biology. 4, 525-539 (2015).
- Munang’andu, H. M., Mutoloki, S., Evensen, O. &. #. 2. 4. 8. ;. An overview of challenges limiting the design of protective mucosal vaccines for finfish. Frontiers in Immunology. 6, 542 (2015).
- Lickwar, C. R., et al. Genomic dissection of conserved transcriptional regulation in intestinal epithelial cells. PLoS Biology. 15 (8), 2002054 (2017).
- Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish. 261, 7-37 (2002).
- Rességuier, J., et al. Specific and efficient uptake of surfactant-free poly(lactic acid) nanovaccine vehicles by mucosal dendritic cells in adult zebrafish after bath immersion. Frontiers in Immunology. 8, 190 (2017).
- Kephart, D., Terry, G., Krueger, S., Hoffmann, K., Shenoi, H. High-Performance RNA Isolation Using the Maxwell 16 Total RNA Purification Kit. Promega Notes. , (2006).
- . Thermo Fisher Scientific NanoDrop 1000 spectrophotometer V3.8 user’s manual. Thermo Fisher Scientific Incorporation. , (2010).
- Lightfoot, S. Quantitation comparison of total RNA using the Agilent 2100 bioanalyzer, ribogreen analysis, and UV spectrometry. Agilent Application Note. , (2002).
- Huggett, J. F., et al. The digital MIQE guidelines: Minimum information for publication of quantitative digital PCR experiments. Clinical Chemistry. 59 (6), 892-902 (2013).
- Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR Journal. 53 (2), 192-204 (2012).
- Renshaw, S., Loynes, C. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), (2011).
