Summary

Intubation orale du poisson-zèbre adulte : un modèle pour l’évaluation de l’absorption intestinale des composés bioactifs

Published: September 27, 2018
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Summary

Le protocole décrit intubating poisson-zèbre adulte avec un produit biologique ; puis dissection et la préparation de l’intestin pour la cytométrie en flux, microscopie confocale et qPCR. Cette méthode permet à l’administration de composés bioactifs pour surveiller l’absorption intestinale et la stimulation immunitaire locale évoquée. Il est utile pour tester la dynamique intestinale de la prophylaxie par voie orale.

Abstract

Plupart des agents pathogènes envahissent les organismes par l’intermédiaire de leur muqueuse. Cela est particulièrement vrai chez les poissons, car ils sont exposés en permanence à un environnement microbien riches en eau. Développer des méthodes efficaces pour l’administration orale d’immunostimulants ou de vaccins, qui activent le système immunitaire contre les maladies infectieuses, est hautement souhaitable. Dans l’élaboration des outils prophylactiques, bons modèles expérimentaux sont nécessaires pour tester leurs performances. Ici, nous montrons une méthode pour l’intubation orale du poisson-zèbre adulte et un ensemble de procédures de disséquer et de préparer l’intestin pour la cytométrie en flux, microscopie confocale et analyse la réaction en chaîne (qPCR) polymérase quantitative. Avec ce protocole, nous pouvons administrer précisément les volumes jusqu’à 50 µL de pêcher pesant environ 1 g simplement et rapidement, sans nuire aux animaux. Cette méthode permet d’explorer l’absorption directe in vivo des composés fluorescents marqués par la muqueuse intestinale et la capacité immunomodulatrice de tels produits biologiques sur le site local après intubation. En combinant des méthodes en aval comme la cytométrie en flux, histologie, qPCR et microscopie confocale du tissu intestinal, nous pouvons comprendre comment immunostimulants ou vaccins sont capables de traverser les barrières muqueuses intestinales, passent par la lamina propria, et atteindre le muscle, exerçant un effet sur le système immunitaire des muqueuses intestinal. Le modèle pourrait servir à tester la prophylaxie orale de candidat et de vecteurs ou de l’effet local de tous les composés bioactifs administré par voie orale.

Introduction

L’objectif de cet article est de décrire en détail une méthode simple pour l’intubation orale du poisson-zèbre, ainsi que des procédures en aval connexes utiles. Intubation orale à l’aide de poisson-zèbre est devenu un modèle de pratique dans l’étude de la dynamique des maladies infectieuses, vaccin oral/immunostimulant, absorption de drogues/NANOPARTICULE et efficacité et immunité muqueuse intestinale. Par exemple, le poisson zèbre intubation orale a été utilisée dans l’étude de l’infection à Mycobacterium marinum et Mycobacterium peregrinum 1. Lovmo et al. également utilisé avec succès ce modèle pour livrer des nanoparticules et M. marinum vers le tractus gastro-intestinal du poisson-zèbre adulte2. En outre, Chen et coll. utilisé zebrafish intubation orale pour montrer que les médicaments encapsulés par nanoparticules, quand administré via le tractus gastro-intestinal, ont été transportés à travers le sang cerveau barrière3. Ces auteurs ont effectué l’intubation selon la méthode de gauvage décrite par Collymore et al. 4 sous réserve de modifications. Toutefois, ils ne prévoyaient pas un protocole très détaillé décrivant la procédure d’intubation orale. Ici, nous présentons une méthode pour l’intubation orale du poisson-zèbre adulte s’appuyant sur l’arrêt Collymore et al. 4 nous incluons également la préparation de l’intestin pour analyse en aval pertinent par cytométrie en flux, microscopie confocale et qPCR.

L’intestin et particulièrement sa muqueuse est la première ligne de défense contre l’infection et le principal site d’absorption des éléments nutritifs5. Lorsque les cellules épithéliales et les cellules présentatrices d’antigène dans les barrières muqueuses perçoivent les signaux de danger, une réponse immédiate d’immunitaire innée est déclenchée. Ensuite, l’immuno-réaction adaptative très spécifique est établie par de6,les lymphocytes T et B7. Mise au point de vaccins oraux est une zone de mise au point actuelle en vaccinologie. Ces vaccins serait un outil efficace pour protéger l’organisme à des sites exposés en raison de la réponse spécifique des cellules immunitaires dans les tissus lymphoïdes associé aux muqueuses (MALT)8,9. En aquaculture, les vaccins ont des avantages évidents par rapport à l’aide de vaccins injectables. Ils sont pratiques pour la vaccination de masse, beaucoup moins de travail, sont moins stressants pour les poissons et peuvent être administrés aux jeunes poissons. Néanmoins, muqueuse vaccins candidats doivent atteindre le deuxième segment de l’intestin sans être dénaturé dans le milieu buccal. Ils doivent aussi franchir les obstacles muqueux pour accéder à l’antigène présentant des cellules (CPA) pour provoquer des réactions locales ou systémiques,10. Test de l’absorption muqueuse atteindre par les antigènes orale de candidats et de leurs vecteurs, ainsi que de la réponse immunitaire évoquée, est donc essentiel dans le développement de vaccins oraux.

Dans un contexte biomédical, élaboration d’un modèle pour tester les effets biologiques des composés après que intubation orale est d’un intérêt croissant. Bon nombre des caractéristiques anatomiques et physiologiques de l’intestin sont conservées entre deux lignées forment, avec les mammifères et poissons osseux11. Ce modèle d’intubation orale relié à l’analyse en aval peut être un outil pour donner un aperçu de la biologie humaine, mais aussi un terrain d’essai pour les produits biologiques ou autres composés en vivo.

Le protocole d’intubation orale peut être effectué par un seul opérateur, par exemple, administrer avec succès jusqu’à 50 µL de la suspension de nanoparticules de protéines de poissons pesant 1 g, avec un taux de survie élevé. La procédure est simple à mettre en place et rapide ; 30 poissons peuvent être intubés en 1 h. Le protocole pour la préparation intestinale est essentielle pour fournir des échantillons de cellules et de tissus de qualité pour une analyse ultérieure. On trouvera des exemples de résultats en aval qui montrent utilité du protocole dans l’obtention de données relies à l’absorption intestinale et à isoler l’ARN de qualité pour qPCR. Le protocole serait d’une grande utilité pour ceux qui ont besoin d’un modèle approprié pour tester la dynamique de la prophylaxie par voie orale ou d’autres composés dans l’intestin.

Protocol

Toutes les procédures expérimentales impliquant le poisson zèbre (Danio rerio) ont été autorisés par le Comité d’éthique de l’Universitat Autònoma de Barcelona (nombre CEEH 1582) en accord avec les principes directeurs de l’International pour la recherche avec des animaux) EU 2010/63). Toutes les expériences avec webcam live poisson zèbre ont été effectuées à 26 et 28 ° C. 1. préparer le matériel pour l’Intubation orale Placer environ 1 cm d’un tu…

Representative Results

Poisson-zèbre (poids moyen : 1,03 ± 0,16 g) de sexe mixte ont été intubés avec succès avec des nanoparticules de différentes protéines recombinantes (inclusions bactériennes) à l’aide de notre dispositif d’intubation orale fait maison (Figure 1). Nous avons avec succès effectué l’intubation orale et atteint un taux de mortalité faible pourcentage moyen (6,8 %) (Tableau 1). Poisson zèbre ont été soit intubé avec 30 µL …

Discussion

Ce protocole est une amélioration de la technique décrite précédemment pour l’intubation orale par Collymore et al. 4 notre protocole décrit en détail la méthode intubation orale et comprend la préparation de l’intestin pour les analyses en aval. Notre méthode améliore la vitesse de manipulation de poissons permettant à une personne d’effectuer le protocole entier rapidement, sans beaucoup de variation entre les opérateurs. Une différence principale de notre protocole a…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par des subventions du ministère espagnol de la Science, la commission européenne et des fonds AGAUR NR (AGL2015-65129-R MINECO/FEDER et AGAUR 2014SGR-345). RT est titulaire d’une bourse d’études pré-doctorales de AGAUR (Espagne), JJ a été soutenue par une bourse de doctorat de la China Scholarship Council (Chine) et NR est pris en charge par le programme Ramón y Cajal (RYC-2010-06210, 2010, MINECO). Nous remercions m. Torrealba conseils spécialisés dans la production de protéines, N. Barba de la « Servei de Microscopia » et Dr M. Costa de la « Servei de Citometria » de l’Universitat Autònoma de Barcelona pour assistance technique utile.

Materials

Silicon tube Dow Corning 508-001 0.30 mm inner diameter and 0.64 mm outer diameter
Luer lock needle Hamilton 7750-22 31 G, Kel-F Hub
Luer lock syringe Hamilton 81020/01 100 μL, Kel-F Hub
Filtered pipette tip Nerbe Plus 07-613-8300 10 μL
MS-222 Sigma Aldrich E10521 powder
10x PBS Sigma Aldrich P5493
Filter paper  Filter-Lab RM14034252
Collagenase Gibco 17104019
DMEM  Gibco 31966 Dulbecco's modified eagle medium
Penicillin and streptomycin Gibco 15240
Cell strainer Falcon 352360
CellTrics filters  Sysmex Partec 04-004-2326 (Wolflabs) 30 µm mesh size filters with 2 mL reservoir
Tissue-Tek O.C.T. compound SAKURA 4583
Plastic molds for cryosections SAKURA 4557 Disposable Vinyl molds. 25 mm x 20 mm x 5 mm
Slide Thermo Scientific 10149870 SuperFrost Plus slide
Cover glasses Labbox  COVN-024-200 24´24 mm
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich 158127
Atto-488 NHS ester Sigma-Aldrich 41698
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761
DMSO Sigma-Aldrich D8418
Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit Promega AS1340
1-Thioglycerol/Homogenization solution Promega Inside of Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit adding 20 μl 1-Thioglycerol to 1 ml homogenization solution (2%)
vertical laboratory rotator  Suministros Grupo Esper 10000-01062
Cryostat Leica  CM3050S
Homogenizer KINEMATICA Polytron PT1600E
Flow cytometer  Becton Dickinson FACS Canto
5 mL round bottom tube Falcon 352058
Confocal microscope Leica SP5
Fume Hood Kottermann 2-447 BST
Nanodrop 1000 Thermo Fisher Scientific ND-1000 Spectrophotometer
Agilent 2100 Bioanalyzer System Agilent G2939A RNA bioanalyzer
Maxwell Instrument Promega AS4500 
iScript cDNA synthesis kit  Bio-rad 1708891
CFX384 Real-Time PCR Detection System Bio-Rad 1855485
iTaq universal SYBR Green Supermix kit Bio-rad 172-5120
Water  Sigma-Aldrich W4502
Cryogenic vial  Thermo Fisher Scientific 375418 CryoTube vial
Mounting medium Sigma-Aldrich F6057 Fluoroshield with DAPI

References

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Cite This Article
Ji, J., Thwaite, R., Roher, N. Oral Intubation of Adult Zebrafish: A Model for Evaluating Intestinal Uptake of Bioactive Compounds. J. Vis. Exp. (139), e58366, doi:10.3791/58366 (2018).

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