Orale Intubation Erwachsenen Zebrafisch: ein Modell für die Bewertung der intestinalen Aufnahme von bioaktiven Substanzen
Summary
Das Protokoll beschreibt sondenschaft Erwachsenen Zebrafisch mit einem biologischen; dann zerlegen und zytometrie, konfokale Mikroskopie und qPCR Darm vorbereiten. Diese Methode ermöglicht die Verwaltung von bioaktiven Substanzen, intestinale Aufnahme und der lokalen immun Reiz hervorgerufen zu überwachen. Es ist relevant für die Prüfung der intestinalen Dynamik von oralen Prophylaxe.
Abstract
Die meisten Krankheitserreger dringen in Organismen durch ihre Schleimhaut. Dies gilt insbesondere bei Fischen wie sie kontinuierlich zu einer mikrobiellen angereicherte Wasser Umwelt ausgesetzt sind. Entwicklung effektiver Methoden zur mündlichen Lieferung von immunstimulantien oder Impfstoffe, die das Immunsystem gegen Infektionskrankheiten zu aktivieren, ist höchst wünschenswert. Bei der Ausarbeitung prophylaktische Werkzeuge, werden gute experimentelle Modelle benötigt, um ihre Leistung zu testen. Hier zeigen wir eine Methode für die orale Intubation Erwachsenen Zebrafisch und eine Reihe von Verfahren zu sezieren und zytometrie, konfokale Mikroskopie und quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) Analyse des Darms vorbereiten. Mit diesem Protokoll können wir präzise Volumen bis zu 50 µL für Fische mit einem Gewicht von ca. 1 g einfach und schnell, ohne Schädigung der Tiere verwalten. Diese Methode ermöglicht es uns, die Aufnahme direkt in Vivo eindringmittel gekennzeichneten Verbindungen durch die Darmschleimhaut und die immunmodulatorische Fähigkeit von solchen Biologics am lokalen Standort nach Intubation zu erkunden. Durch die Kombination von nachgelagerten Verfahren wie Durchflusszytometrie, Histologie, qPCR und konfokalen Mikroskopie des intestinalen Gewebes, können wir verstehen, wie immunstimulantien oder Impfstoffe in der Lage sind, die intestinale Schleimhaut-Hindernisse überqueren, durchlaufen die Lamina Propria und den Muskel, übt eine Wirkung auf die intestinalen mukosalen Immunsystems zu erreichen. Das Modell könnte verwendet werden, um Kandidaten orale Prophylaxe und Delivery-Systeme oder die lokale Wirkung von eine oral verabreichte bioaktive Verbindung testen.
Introduction
Das Ziel dieses Artikels soll in der Tiefe eine einfache Methode für die orale Intubation Zebrafisch, zusammen mit nützlichen verbunden nachgelagerten Verfahren beschreiben. Orale Intubation mit Zebrafisch ist ein praktisches Modell bei der Untersuchung von Infektionskrankheiten Dynamik, oralen Impfstoff/immunstimulierende Medikament/Nanoparticle Aufnahme und Wirksamkeit und Darm-Schleimhaut Immunität geworden. Zebrafisch orale Intubation wird zum Beispiel in der Studie von Mycobacterium Marinum und Mycobacterium Peregrinum Infektion1eingesetzt wurden. Lovmo Et al. auch zur erfolgreich dieses Modell Nanopartikel und M. Marinum mit dem Magen-Darm-Trakt von Erwachsenen Zebrafisch2liefern. Darüber hinaus verwendet Chen Et Al. Zebrafisch orale Intubation um zu zeigen, dass Drogen durch Nanopartikel verkapselt wann verabreicht über den Magen-Darm-Trakt, über die Blut-Gehirn-Schranke3transportiert wurden. Diese Autoren durchgeführt Intubation basierend auf der Gauvage-Methode von Collymore Et Al. beschrieben 4 mit einigen Änderungen. Allerdings hat sie kein sehr detailliertes Protokoll beschreibt die orale Intubation Verfahren bereitgestellt. Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode für die orale Intubation Erwachsenen Zebrafisch aufbauend auf Collymore Et al. 4 wir sind weiter die Vorbereitung des Darms für nachgelagerte Analyse zytometrie, konfokale Mikroskopie und qPCR.
Der Darm und vor allem seine Schleimhaut ist die erste Linie der Verteidigung gegen Infektion und die primären Ort der Nährstoffaufnahme5. Wenn die Epithelzellen und Antigen-präsentierenden Zellen in der Schleimhaut Barrieren Gefahrensignale wahrnehmen, ist eine sofortige angeborene Immunantwort ausgelöst. Als nächstes ist die hochspezifische adaptiven Immunantwort von T- und B-Lymphozyten6,7gegründet. Entwicklung von oralen Impfstoffen ist ein aktueller Schwerpunkt im Vaccinology. Solchen Impfstoffen wäre ein effektives Werkzeug, um den Organismus an exponierten Standorten aufgrund der spezifischen Reaktion der Immunzellen in der Mukosa-assoziierten lymphatischen Gewebe (MALT)8,9zu schützen. In der Aquakultur haben Schleimhaut-Impfstoffe offensichtliche Vorteile im Vergleich zu injizierbaren Impfstoffen. Sie sind praktisch für Massenimpfungen, weniger arbeitsintensiv, sind für die Fische weniger belastend und Jungfische verabreicht werden können. Dennoch müssen Schleimhaut Impfstoffkandidaten das zweite Segment der Darm erreichen, ohne in die Mundhöhle denaturiert wird. Sie müssen auch Schleimhaut Hindernisse überqueren, um Zugriff auf antigenpräsentierende Zellen (APCs), lokale und/oder systemische Reaktionen10zu induzieren. Daher unbedingt testen der Schleimhaut-Aufnahme durch die Kandidaten mündliche Antigene und ihrer Trägersysteme erreicht, sowie die Immunantwort hervorgerufen, bei der Entwicklung von oralen Impfstoffen.
In einem biomedizinischen Kontext entwickelt ein Modell, um die biologische Wirkungen von Verbindungen zu testen, nachdem orale Intubation von Interesse ist. Viele von den anatomischen und physiologischen Merkmale des Darms sind zwischen Bilaterian Linien mit Säugetieren und Knochenfische11konserviert. Diese orale Intubation Modell an nachgelagerte Analyse angeschlossen kann ein Werkzeug, um Einblicke in die menschliche Biologie sowie ein Testfeld für Biologics zur Verfügung zu stellen oder andere Substanzen in Vivo.
Die orale Intubation Protokoll kann von einem Bediener, z.B.erfolgreich administrieren bis zu 50 µL der Protein Nanopartikel Suspension mit einem Gewicht von 1 g, mit eine hohe Überlebensrate Fischen durchgeführt werden. Das Verfahren ist einfach einzurichten und schnell; 30 Fische können in 1 h intubiert werden. Das Protokoll für Darm Vorbereitung ist Schlüssel zur Bereitstellung von QUALITÄTSPROBEN Zell- und für die spätere Analyse. Der nachgeschaltete Ergebnisse Beispiele die zeigen das Protokoll nutzen bei der Beschaffung von Daten in Bezug auf intestinale Aufnahme und Qualität RNA für qPCR zu isolieren. Das Protokoll wäre von großem Nutzen für diejenigen, die ein geeignetes Modell, um die Dynamik von oralen Prophylaxe oder andere Verbindungen im Darm zu testen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll ist eine Verbesserung der zuvor beschriebenen Technik für orale Intubation von Collymore Et al. 4 unser Protokoll beschreibt im Detail die orale Intubation Methode und umfasst die Vorbereitung des Darms für nachgelagerte Analysen. Unsere Methode verbessert Fisch Manipulation Geschwindigkeit, so dass eine Person das gesamte Protokoll schnell und ohne viel Variation zwischen den Betreibern durchführen. Ein Hauptunterschied von unserem Protokoll mit dem vorherigen ist, da…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse vom spanischen Ministerium für Wissenschaft, Europäische Kommission und AGAUR Mittel zur NR (AGL2015-65129-R MINECO/FEDER und 2014SGR-345 AGAUR) unterstützt. RT hält ein Pre-Promotionsstipendium aus AGAUR (Spanien), JJ wurde unterstützt durch ein Promotionsstipendium von der China Scholarship Council (China) und NR stützt sich auf das Ramón y Cajal-Programm (RYC-2010-06210, 2010, MINECO). Wir danken Dr. Torrealba für kompetente Beratung in Protein-Produktion, N. Barba aus “Servei de Microscopia” und Dr. M. Costa von der “Servei de Citometria” von der Universitat Autònoma de Barcelona für hilfreiche technische Unterstützung.
Materials
| Silicon tube | Dow Corning | 508-001 | 0.30 mm inner diameter and 0.64 mm outer diameter |
| Luer lock needle | Hamilton | 7750-22 | 31 G, Kel-F Hub |
| Luer lock syringe | Hamilton | 81020/01 | 100 μL, Kel-F Hub |
| Filtered pipette tip | Nerbe Plus | 07-613-8300 | 10 μL |
| MS-222 | Sigma Aldrich | E10521 | powder |
| 10x PBS | Sigma Aldrich | P5493 | |
| Filter paper | Filter-Lab | RM14034252 | |
| Collagenase | Gibco | 17104019 | |
| DMEM | Gibco | 31966 | Dulbecco's modified eagle medium |
| Penicillin and streptomycin | Gibco | 15240 | |
| Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| CellTrics filters | Sysmex Partec | 04-004-2326 (Wolflabs) | 30 µm mesh size filters with 2 mL reservoir |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | SAKURA | 4583 | |
| Plastic molds for cryosections | SAKURA | 4557 | Disposable Vinyl molds. 25 mm x 20 mm x 5 mm |
| Slide | Thermo Scientific | 10149870 | SuperFrost Plus slide |
| Cover glasses | Labbox | COVN-024-200 | 24´24 mm |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Atto-488 NHS ester | Sigma-Aldrich | 41698 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit | Promega | AS1340 | |
| 1-Thioglycerol/Homogenization solution | Promega | Inside of Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit | adding 20 μl 1-Thioglycerol to 1 ml homogenization solution (2%) |
| vertical laboratory rotator | Suministros Grupo Esper | 10000-01062 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| Homogenizer | KINEMATICA | Polytron PT1600E | |
| Flow cytometer | Becton Dickinson | FACS Canto | |
| 5 mL round bottom tube | Falcon | 352058 | |
| Confocal microscope | Leica | SP5 | |
| Fume Hood | Kottermann | 2-447 BST | |
| Nanodrop 1000 | Thermo Fisher Scientific | ND-1000 | Spectrophotometer |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent | G2939A | RNA bioanalyzer |
| Maxwell Instrument | Promega | AS4500 | |
| iScript cDNA synthesis kit | Bio-rad | 1708891 | |
| CFX384 Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855485 | |
| iTaq universal SYBR Green Supermix kit | Bio-rad | 172-5120 | |
| Water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Cryogenic vial | Thermo Fisher Scientific | 375418 | CryoTube vial |
| Mounting medium | Sigma-Aldrich | F6057 | Fluoroshield with DAPI |
References
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