プロトコルは、生物学的製剤; とラリンジアルマスクエアウェイ アダルト ゼブラフィッシュを記述します。解剖し、フローサイトメトリー、共焦点顕微鏡と qPCR の腸を準備します。このメソッドは、腸内の吸収と局所の免疫刺激誘発を監視する生理活性物質を管理できます。口腔予防薬の腸内ダイナミクスのテストに適用されます。
ほとんどの病原体は侵入、粘膜を通して生物です。これは、微生物が豊富な水環境にさらされ続ける魚で特に。ワクチンは、感染症に対する免疫システムをアクティブ化、または生理の口頭配達の効果的な手法の開発は非常に望ましいです。予防ツールを工夫すること、彼らのパフォーマンスをテストする良い実験モデルが必要です。ここでは、大人のゼブラフィッシュの経口挿管法とを細かく分析し、フローサイトメトリー、共焦点顕微鏡と量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) 分析のための腸の準備の手順のセットを示します。このプロトコルでは、我々 は正確に魚の動物を傷つけることがなく簡単かつ迅速に、約 1 g の重さを 50 μ L までボリュームを管理できます。このメソッドでは、挿管後腸の粘膜とローカル ・ サイトでこのような生物学的製剤の免疫調節能力によって蛍光標識化合物の生体内で直接取り込みを探索することが出来ます。Cytometry 流れ、組織学、qPCR 腸組織の共焦点顕微鏡など下流の方法を組み合わせることによって我々 は生理やワクチンが腸の粘膜の障壁を交差、粘膜を通過することができる方法を理解できると腸管の粘膜免疫系に効果を発揮、筋肉に到達します。モデルは、候補者口腔予防薬と配信システムまたは任意の経口投与の生物活性化合物の局所効果をテストする使用できます。
この記事の目標は、深さで関連付けられている下流の有用な手順と共に、ゼブラフィッシュの経口挿管に簡単なメソッドを記述することです。ゼブラフィッシュを用いた経口気管挿管における感染症の動態、経口ワクチン/免疫賦活剤、薬/ナノ粒子の吸収・効果、腸管粘膜免疫の実用的なモデルとなっています。たとえば、ゼブラフィッシュ経口挿管は、 marinum 結核菌や結核菌 peregrinum感染1の研究で使用されています。Lovmoら正常に大人ゼブラフィッシュ2の消化管をナノ粒子やM. marinum提供するのにこのモデルを使用します。さらに、陳らは、ナノ粒子、薬がカプセル化をゼブラフィッシュ経口挿管を使用とき投与による消化管血頭脳障壁3間で運ばれました。これらの著者実行コリモアらによって記述されている gauvage メソッドに基づいて、挿管4いくつかの変更。しかし、彼らは、経口挿管の手順を記述する非常に詳細なプロトコルを提供しませんでした。ここでは、建物コリモアら大人のゼブラフィッシュの経口挿管法を提案します。4フローサイトメトリー、共焦点顕微鏡、qPCR による関連する下流解析のため腸の準備を更に含んで。
腸、特にその粘膜は感染に対する防御の最初の行と養分吸収5主のサイトです。上皮細胞と抗原提示細胞粘膜障壁内では、危険信号を感知、即時の自然免疫応答がトリガーされます。次に、非常に特定の適応免疫応答は、T および B リンパ球6,7で確立されます。経口ワクチンの開発は、ワクチン学に現在フォーカス エリアです。このようなワクチンは粘膜関連リンパ組織 (モルト)8,9の免疫細胞の特定の応答のための露出サイトで有機体を保護するために効果的なツールになります。養殖業、粘膜ワクチン注射ワクチンと比較して明らかな利点があります。集団予防接種は、比較的手間のかからないための実用的、魚、ストレスの少ない、若い魚に投与することができます。それにもかかわらず、粘膜ワクチン候補口腔内環境に変性されることがなく腸の 2 番目のセグメントに到達する必要があります。彼らはまた抗原提示細胞 (APCs) ローカルおよび全身の応答10を誘発するへのアクセスを得るために粘膜の障壁を越える必要があります。したがって、候補の経口抗原およびその配信システムにより粘膜吸収のテスト、誘発、免疫反応だけでなく、不可欠である経口ワクチンの開発に
生体においては、経口挿管の関心の高まりの後、化合物の生物学的効果をテストするモデルを開発します。腸の解剖学的および生理学的機能の多くは哺乳類、硬骨魚類11、左右相称性系統間保存されます。下流の分析に接続されているこの経口挿管モデルは、生物学的製剤の試験場と同様、人間の生物学への洞察力を提供するためのツールをすることができます。 または他の化合物の生体内で。
経口気管挿管プロトコルは、1 つの演算子、例えば、魚の重さの 1 g は、生存率の高いタンパク質ナノ粒子懸濁液の最大 50 μ L を正常に管理実行できます。手順はセットアップするシンプルで簡単です。30 魚は 1 h で挿管することができます。腸の準備のためのプロトコルは、その後の分析のため品質の細胞・組織のサンプルを提供する鍵です。下流の結果の例の腸管吸収に関連するデータを取得、qPCR の質 RNA を隔離するプロトコルの有用性を示すとおりです。これら腸内口腔予防薬のダイナミクスや他の化合物をテストするための適切なモデルを必要とする偉大な使用のプロトコルになります。
このプロトコルは前述コリモアらによる経口気管挿管法の改善4私達のプロトコルは経口挿管法の詳細に説明し、下流解析のため腸の準備が含まれています。本手法は、演算子間の変動があまりなく、急速に全体のプロトコルを実行する人を許可する魚操作速度を向上します。以前のものと弊社のプロトコルの主な違いは、幸福のための動物の観察によってだけでなく…
The authors have nothing to disclose.
この作品は、欧州委員会と AGAUR 資金 NR (AGL2015-65129-R MINECO/フェダー、2014SGR-345 AGAUR) スペイン語科学省からの補助金によって支えられました。RT は、AGAUR (スペイン)、JJ から博士奨学金に支えられ中国公費 (中国) から博士課程フェローシップと NR は Ramón y カハール プログラム (RYC-2010-06210、2010 年、MINECO) によってサポートされているを保持します。タンパク質の生産、「Servei ・ デ ・ ミクロスコピア」から (名) バルバで専門家の助言ありがとう博士トレアルバと博士 m ・ コスタ、Autònoma · デ · バルセロナの役に立つのテクニカル サポートの「Servei ・ デ ・ Citometria」から。
Silicon tube | Dow Corning | 508-001 | 0.30 mm inner diameter and 0.64 mm outer diameter |
Luer lock needle | Hamilton | 7750-22 | 31 G, Kel-F Hub |
Luer lock syringe | Hamilton | 81020/01 | 100 μL, Kel-F Hub |
Filtered pipette tip | Nerbe Plus | 07-613-8300 | 10 μL |
MS-222 | Sigma Aldrich | E10521 | powder |
10x PBS | Sigma Aldrich | P5493 | |
Filter paper | Filter-Lab | RM14034252 | |
Collagenase | Gibco | 17104019 | |
DMEM | Gibco | 31966 | Dulbecco's modified eagle medium |
Penicillin and streptomycin | Gibco | 15240 | |
Cell strainer | Falcon | 352360 | |
CellTrics filters | Sysmex Partec | 04-004-2326 (Wolflabs) | 30 µm mesh size filters with 2 mL reservoir |
Tissue-Tek O.C.T. compound | SAKURA | 4583 | |
Plastic molds for cryosections | SAKURA | 4557 | Disposable Vinyl molds. 25 mm x 20 mm x 5 mm |
Slide | Thermo Scientific | 10149870 | SuperFrost Plus slide |
Cover glasses | Labbox | COVN-024-200 | 24´24 mm |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
Atto-488 NHS ester | Sigma-Aldrich | 41698 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit | Promega | AS1340 | |
1-Thioglycerol/Homogenization solution | Promega | Inside of Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit | adding 20 μl 1-Thioglycerol to 1 ml homogenization solution (2%) |
vertical laboratory rotator | Suministros Grupo Esper | 10000-01062 | |
Cryostat | Leica | CM3050S | |
Homogenizer | KINEMATICA | Polytron PT1600E | |
Flow cytometer | Becton Dickinson | FACS Canto | |
5 mL round bottom tube | Falcon | 352058 | |
Confocal microscope | Leica | SP5 | |
Fume Hood | Kottermann | 2-447 BST | |
Nanodrop 1000 | Thermo Fisher Scientific | ND-1000 | Spectrophotometer |
Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent | G2939A | RNA bioanalyzer |
Maxwell Instrument | Promega | AS4500 | |
iScript cDNA synthesis kit | Bio-rad | 1708891 | |
CFX384 Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855485 | |
iTaq universal SYBR Green Supermix kit | Bio-rad | 172-5120 | |
Water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
Cryogenic vial | Thermo Fisher Scientific | 375418 | CryoTube vial |
Mounting medium | Sigma-Aldrich | F6057 | Fluoroshield with DAPI |