MUB40 peptid til brug i forbindelse med afsløring neutrofile-medieret betændelse begivenheder
Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at påvise tilstedeværelsen af neutrofiler i fast/permeabilized histologi sektioner og vurdere aktiveringstilstand for levende renset neutrofiler. Især binder MUB40 peptid lactoferrin stede i neutrofile-specifikke og tertiære granulat. Eksponering af granulet indholdet gennem enten permeabilization eller neutrofile aktivering giver mulighed for mærkning af neutrofiler.
Abstract
Her, leverer vi en protokol, der involverer brugen af MUB40, en syntetiseret peptid med evnen til at binde glykosyleret lactoferrin gemt i høje koncentrationer i specifikke og tertiære granulat af neutrofiler. Denne protokol detaljer hvordan MUB40 konjugeret direkte til en fluorophore kan bruges til at plette neutrofiler i fast/permeabilized væv samt, hvordan dette kan bruges i live-celle imaging til assay for neutrofile aktivering og deaktivering sker en granulering tørrer. Neutrofile påvisningsmetoderne er begrænset til artsspecifikke monoklonale antistoffer, som ikke altid er egnet til visse anvendelser. MUB40 trænge ind ikke i cellemembranen og er dermed udelukket fra lactoferrin gemt i ikke-aktiveret/ikke-permeabilized neutrofiler. MUB40 har den ekstra fordel af anerkende lactoferrin fra en bred værtsspektrum, gør det især nyttig for at sammenligne resultater i undersøgelser, hvor flere forskning modeller, at reducere antallet af dublerede reagenser, og forenkle protokoller gennem trinvis farvning.
Introduction
Neutrofile er en af de primære våben af den medfødte immunsystem og rekrutteres rutinemæssigt at lokaliteter af betændelse omkring kroppen. Studiet af neutrofiler har været i høj grad svækket af deres korte levetid i vitro (mindre end 8 h) og af begrænset registreringsværktøjer basal betingelser eller efter aktivering. Vi præsenterer her, en velafprøvet protokol for den brede og specifik påvisning af pattedyr neutrofiler i fast/permeabilized prøver. Vi tilbyder også en detaljeret protokol for farvning live neutrofiler med MUB40. Ved hjælp af live neutrofile farvnings-protokollen, kan timing og placering af neutrofile aktivering være identificeret. Denne protokol er ideel til forskere, der ønsker at studere neutrofile aktivering eller granula frigivelse. Ud over deres antimikrobielle funktioner, er neutrofile nu værdsat som immunmodulerende celler involveret i en bred vifte af sygdomme og immunrespons (medfødte og adaptive)1,2. Neutrofiler er til stede i de fleste inflammatorisk væv, på høje tal i inficeret væv, i inflammatoriske tumorer3, under IBS og Crohns flare-ups4, og i områder af ikke-infektiøs inflammation som Gunnbjørn af leddegigt ( RA) patienter5. Neutrofiler indeholder fire klasser af præformerede granulat opkaldt azurophil (α), specifikke (B1), tertiær (β2) granulat og sekretoriske vesikler (γ)6. Ved overflytning til en inflammatorisk websted, rekrutterede neutrofiler blive aktiveret og udskiller sekventielt granulet indholdet (sammensat af adhæsion, antimikrobielle forbindelser og immunmodulerende molekyler), der fremmer yderligere rekruttering og bidrager til infektion opløsning (men også til værten vævsskader)7. Mens neutrofiler betragtes et kritisk aspekt af medfødt immunitet, indtil der er par påvisning reagenser tilgængelige at studere dem, og endnu færre der kan bruges til at vurdere aktiveringstilstand for levende neutrofiler.
Nuværende metoder til påvisning af neutrofiler stole på monoklonale antistoffer dannet mod celle-overflade udsat antigener, såsom Ly – 6 G2 eller proteiner specifikt gemt i neutrofile granulat under basale forhold (f.eks. myeloperoxidase lactoferrin). Fordele af monoklonale antistoffer omfatter deres stærke binding, følsomhed og alsidighed under forskellige assay. Der er dog flere ulemper ved at bruge monoklonale antistoffer og anti-Ly – 6G i særdeleshed. Disse ulemper omfatter specificitet, som Ly – 6G er til stede på et flertal af myeloide celler i knoglemarven og på alle granulocytter herunder eosinofile; således er kræver decifrere neutrofiler fra eosinofile med denne markør mere komplekser tilgange8. En anden hyppig afvejning med monoklonale antistoffer er deres ofte begrænsede vært værtsspecificitet, vanskeliggør sammenligning undersøgelser med mere end én dyreart. En tredje ulempe af antistof påvisningsmetoder, især når du bruger levende celler eller in vivo, er deres potentiale til at forstyrre cellefunktion eller føre til celle aktivering. For eksempel, er administration af anti-Ly – 6G til mus almindeligvis anvendes til neutrofile udtynding og forbigående neutropeni9. Det er desuden påvist, at antistof injektion kan stimulere neutrofile antitumor funktion10. Påvisning af antistof af neutrofiler afslører endelig ikke aktiveringstilstand for cellen.
Vi har identificeret en 40-amino syre peptid kaldet MUB40, som kan bruges i en række af assays til label neutrofiler i in vitro eller vivo betingelser samt assay aktivisering statussen af levende neutrofiler11. MUB40 er afledt fra MUB7012, et domæne af Lactobacillus reuteri overflade Slim-bindende protein oprindeligt beskrevet for sin evne til at binde Slim13,14. MUB40 interagerer med glykosyleret Laktoferrin, der er til stede i høje koncentrationer i neutrofile-specifikke og tertiære granulat. MUB40 kan blive udsat for disse granulatet gennem standard permeabilization trin i histopatologi eller fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) protokoller for robust farvning af faste neutrofiler. Når levende neutrofiler holdes i en inaktiveret stat, MUB40 peptid er udelukket fra granulet indholdet, og celler pletter ikke positivt med markøren. Ved aktivering, kan MUB40 binde til udsatte lactoferrin og føre til robust farvning med peptid. MUB40 kan således bruges til at bestemme aktiveringstilstand for renset neutrofiler, hvilket gør det til et attraktivt markør til at følge den infektiøse proces. Evnen til at binde til live aktiveret neutrofiler tillader også MUB40 skal bruges som et redskab til at opdage områder af neutrofile betændelse i live dyremodeller (f.eks. en mus gigt model15). Protokoller i dette manuskript detaljer hvordan fluorescently mærket MUB40 kan bruges til at afsløre neutrofiler i histologi væv og sådan assay aktivering af levende renset neutrofiler i vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskrives to assays hvor MUB40 peptid er brugt til at studere neutrofile betændelse og aktivering. Vi viser, hvordan MUB40 kan afsløre neutrofiler i histopatologi sektioner eller vise deres aktivering staten bruger live renset neutrofiler. De kritiske trin til brug af MUB40 som en farvning reagens er den samme som med enhver anden fluorescerende påvisningsmetode. Skal sørges for at sikre kompatibilitet af fluorescerende signaler og at have taget tilstrækkelig vask skridt til at f…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Fondation Laurette Fugain (LF-2015-15) (B.S.M.) og ANR JCJC tilskud (ANR-17-CE15-0012) (B.S.M.).
Materials
| MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Fluorescent MUB40 peptide (available with other conjugated fluorophores) |
| RI-MUB40-Cy5 | Benoit Marteyn | benoit.marteyn@pasteur.fr | Retro-inverso fluorescent MUB40 peptide. Synthesized with D-amino acids and resistant to proteases (available with other conjugated fluorophores) |
| Parformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005 | Fixative for histology |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | Solution used to remove excess PFA |
| Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) | Sakura Finetek USA | 4583 | Used to freeze tissue before cryostat sectioning |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631 | Used to freeze tissue before cryostat sectioning |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 1.00974 | Used for dry ice bath to freeze tissue |
| Leica Cryostat | Leica Biosystems | CM1520 | Used to section tissues |
| Glass microscopy slides | Fisher Scientific | 12-518-101 | |
| Cover slips | Thor Labs | CG15CH | Hi precision coverslip |
| Dako pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | Used to prevent liquid loss during tissue staining |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | Used to permeabilize cells for IF staining |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 10236276001 | Stains DNA |
| Alexa fluor 488 Phalloidin | Fisher Scientific | A12379 | Binds actin |
| Prolong Gold antifade Mountant | Fisher Scientific | P36930 | Prolongs IF signal and resistance to photobleaching |
| Fluorescent microscope | Various | Various | Used to image IF slides |
| Anoxic Cabinet | Various | Various | Used for the purification of live inactivated neutrophils |
| Sodium Chloride NaCL | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Washing buffer component |
| MACS BSA buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | Washing buffer component |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P4937 | Gradient for neutrophil purification |
| CD235a glycophorin magnetic microbeads | Miltenyi Biotec | 130-050-501 | Used to remove contaminating RBCs |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used in the removal of RBCs from neutrophils |
| RPMI-1640 without Phenol Red | Sigma-Aldrich | R8755 | Used for neutrophil assays |
References
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
- Nicolás-Ávila, J. &. #. 1. 9. 3. ;., Adrover, J. M., Hidalgo, A. Neutrophils in Homeostasis, Immunity, and Cancer. Immunity. 46 (1), 15-28 (2017).
- Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. Neutrophils in cancer: neutral no more. Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).
- Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).
- Glennon-Alty, L., Hackett, A. P., Chapman, E. A., Wright, H. L. Neutrophils and redox stress in the pathogenesis of autoimmune disease. Free Radical Biology & Medicine. , (2018).
- Borregaard, N., Cowland, J. B. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte. Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Rose, S., Misharin, A., Perlman, H. A novel Ly6C/Ly6G-based strategy to analyze the mouse splenic myeloid compartment. Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (4), 343-350 (2012).
- Shi, C., Hohl, T. M., Leiner, I., Equinda, M. J., Fan, X., Pamer, E. G. Ly6G+ neutrophils are dispensable for defense against systemic Listeria monocytogenes infection. Journal of Immunology. 187 (10), 5293-5298 (2011).
- Albanesi, M., Mancardi, D. A., et al. Neutrophils mediate antibody-induced antitumor effects in mice. Blood. 122 (18), 3160-3164 (2013).
- Anderson, M. C., Chaze, T., et al. MUB40 Binds to Lactoferrin and Stands as a Specific Neutrophil Marker. Cell Chemical biology. 25 (4), 483-493 (2018).
- Coïc, Y. -. M., Baleux, F., et al. Design of a specific colonic mucus marker using a human commensal bacterium cell surface domain. Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 15916-15922 (2012).
- Roos, S., Jonsson, H. A high-molecular-mass cell-surface protein from Lactobacillus reuteri 1063 adheres to mucus components. Microbiology. 148, 433-442 (2002).
- Boekhorst, J., Helmer, Q., Kleerebezem, M., Siezen, R. J. Comparative analysis of proteins with a mucus-binding domain found exclusively in lactic acid bacteria. Microbiology. 152, 273-280 (2006).
- Mancardi, D. A., Jönsson, F., et al. Cutting Edge: The murine high-affinity IgG receptor FcγRIV is sufficient for autoantibody-induced arthritis. Journal of Immunology. 186 (4), 1899-1903 (2011).
- Walmsley, S. R., Print, C., et al. Hypoxia-induced neutrophil survival is mediated by HIF-1alpha-dependent NF-kappaB activity. Journal of Experimental Medicine. 201 (1), 105-115 (2005).
- Monceaux, V., Chiche-Lapierre, C., et al. Anoxia and glucose supplementation preserve neutrophil viability and function. Blood. 128 (7), 993-1002 (2016).
