Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול לפתח מערכת inducible דומיננטה-שלילי, שבו כל חלבון יכול להיות מותנה מומת על ידי הפיכה overexpressing גרסה מוטציה דומיננטית-שלילי של זה.
Abstract
דומיננטה-שלילי (DN) חלבון עיכוב היא שיטה חזקה לתמרן החלבון פונקציה, ומציע מספר יתרונות על גישות אחרות מבוסס גנום. לדוגמה, למרות chimeric ו- Cre-LoxP אסטרטגיות מיקוד היה בשימוש נרחב, המגבלות מהותי של אסטרטגיות אלו (קרי, פעילות קדם דולפים, ביטוי Cre פסיפס, וכו ') שיש באופן משמעותי מוגבלת שלהם יישום. יתר על כן, מחיקה מלאה של גנים רבים אנדוגני הוא embryonically קטלני, ואי אפשר ללמוד פונקציה ג'ין בחיים לאחר הלידה. לטפל באתגרים אלה, יש שינויים משמעותיים כדי פרוטוקול הנדסה גנטית מוקדמת ואנו בשילוב גרסה מקוצרת (הטרנסגניים) של הגן Rb1 פרוטאז lysosomal procathepsin B (CB), כדי ליצור מודל העכבר DN של Rb1 (CBRb). בשל נוכחותם של פרוטאז lysosomal, החלבון פיוז'ן CB-RB1 שלם ומורכב שמעצבת שלה מנותבות עבור בתיווך פרוטאוזום השפלה. יתר על כן, הנוכחות של יסוד משרן (rtTA) טטרציקלין הבונה הטרנסגניים מאפשר ויסות inducible והפיך החלבון RB1. הנוכחות של מקדם רוזה-חטיבתי בכל מקום במודל עכבר CBRb הופכת כלי שימושי כדי לבצע אבלציה ג'ין Rb1 ארעי והפיך ולספק חוקרים משאב להבנת פעילות שלה כמעט בכל סוג תא איפה בא לידי ביטוי RB1.
Introduction
רוב הגישות מכוון ablations גנים וחלבונים להסתמך על תהליכים קבועים, אשר בדרך כלל להוביל חיסול מוחלט או חיתוך של ג'ין, רצפי RNA או החלבון עניין (פוי). המטרה הכוללת של שיטה זו הוא מהנדס חלבון רקומביננטי לבטל את הפונקציה של אנדוגני, פראי-סוג חלבון. יש וביקרה ואנו בנגיעות של אסטרטגיה אלטרנטיבית1,2, מה שמאפשר עבור אבלציה זמני של נקודת משחק לחץ באמצעות עיכוב DN. שיטה זו פועלת multimeric וגם פפטידים monomeric אך היא המתאימה ביותר עבור חלבונים שפועלים בהרכבה multimeric.
השיטה מורכבת פיוזינג lysosomal פרוטאז CB יחידת משנה של multimeric פוי (CB פיוז'ן מורכבים). פיוז'ן CB תוצאות מורכבות יכול לקיים אינטראקציה עם proteolytically לעכל החלבון אנדוגני או להסיט את המתחם כולו CB-פוי ליזוזום להיות מפורק3. יתר על כן, שילוב של פיוז'ן CB מורכבים עם הטבע inducible של מערכת ההפעלה תעתיק שבשליטת טטרציקלין (TetO) מאפשר ביטוי inducible ומבוקר transgene ב אופנה הפיך2. למרות שימושי בנסיבות רבות, מחיקה מלאה של גנים או חלבונים ויוו יכול לגרום קטלני4,5,6. באופן דומה, מחיקה רקמות ספציפיות, מותנה של כמה גנים או חלבונים באמצעות מערכת Cre/סלומון לא יכול להיות ישירה, כמו, בסופו של דבר, תוביל לאובדן תמידי של אלמנטים קריטיים גנומית7. לפיכך, בהתאם ג'ין או פוי, וגם יהיה יעיל במתן מודל שימושי עבור מחקרים מאוחרים יותר, במיוחד של הגנים או של חלבונים פונקציונליים מחקרים בעכברים כמחנכת ומבוגרים מאוחר.
כדי לעקוף בעיות הקשורות גישות כאלה לספק הוכחה של עקרון על היעילות של השיטה המוצעת, בחרנו לבחון את השיטה המובאת כאן על ידי יצירת גירסה DN מותנה של החלבון 1 רטינובלסטומה (RB1). מספר אפשרויות להיות המוצע8,9,10 לבטל את הפונקציה של אנדוגני RB1; עם זאת, כולן בפני חלק מהמגבלות באותו שנדונו לעיל: germline קבוע מחיקה של RB1 embryonically קטלני, והוא, בקנה אחד עם תפקידו משתיק קול הגידול, קבע RB1 מחיקה מותנה שמוביל מגוון רחב של גידולים11. אף-על-פי גירסת DN RB1 לא נראה להתרחש באופן טבעי, חלופה טובה יותר האסטרטגיות הזמינות כעת צריך לאפשר איון חנותם מבוקרת של RB1 אנדוגני ולספק מנגנון חלופי לשחזור בסופו של דבר שלה פונקציה. בסיס כזה מבנה תוארה לפני למעלה משני עשורים1. עם זאת, בשל מגבלות טכנולוגיות, זה חסרה מנגנון הבקרה transgene ההפעלה, התגובה של רקמות ירידה לפרטים. מחקר זה הוא הראשון כדי לשלב את האלגנטיות דוקסילין (Dox)-תלוי תעתיק המערכת עם הבונה מהונדס מהונדס של חלבונים CB, Rb1 פרוטאז lysosomal. המודל העכבר CBRb המתקבל מאפשר RB1 בתיווך Dox מוסדר באופן זמני תקנה2. היתרון של שימוש כזה מבוסס פרוטאום בגישה ללמוד ג'ין פונקציה היא כי זה יכול להיות מאומץ עבור ג'ין בכל עניין, עם מידע מינימלי על פעילותה.
האסטרטגיה המוצעת DN transgene מציע יתרונות רבים על פני הגישות המסורתיות. ראשית, עיכוב חלבונים DN מוביל רק אבלציה חלקית בפעילות חלבון, וכך לשמר ביטוי אנדוגני שיורית. כזו כ"בלתי רצוי מאוד במצבים איפה חיסול מוחלט של פעילות החלבון מוביל lethality עובריים, במידה רבה להגביל חקירה כלשהי ללמוד ג'ין פונקציית עכבר חי. שנית, הנוכחות של מערכת TetO מאפשרת הפעלת transgene רק בנוכחות אנטיביוטיקה, מה שמאפשר עבור פקד יעיל של הפיכה של הפעילות transgene. לפיכך, על ידי חדל המינהל לאנטיביוטיקה, ניתן לבטל את הפעלתם את המערכת הטרנסגניים, ביטוי RB1 נורמלי הוא למקום. שלישית, יחודיות של הביטוי transgene יכול להשתנות בהתאם האמרגן של הבחירה. בעוד שבחרנו את המקדם רוזה-חטיבתי בכל מקום על הוכחה של עקרון, הצבת את transgene תחת מקדם רקמות ספציפיות סביר להגביל את הביטוי transgene לא רצויים וכדי להקל על מחקרים על היישום טיפולית של transgene הזה מתודולוגיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
דור של העכבר CBRb הטרנסגניים כל טיפול בבעלי חיים ואת ניסויים הקשורים המחקר היו אושרה על ידי קרייטון אוניברסיטת מוסדיים חיה טיפול שימוש הוועדה (IACUC), המבוצעת על ידי הנחיות שלהם.
1. הטרנסגניים CB-Myc6-Rb1 לבנות
הערה: השיבוט של CBRb לתוך וקטור pTet_Splice נעשה תהליך רב שלבי (איור 1A ו 1B).
-
לבצע השיבוט בשלב הראשון לתוך pCS2 + וקטור CB-Myc6.
- כדי ליצור CBRb transgene הבונה, להגביר את קטע cDNA Rb1 1583-bp-ארוך (528 החומצות המתאים לאזור חומצת אמינו 369-896) של החלבון RB1 באמצעות פריימר הבאים את הגדר: לשימוש EcoRI +RB 1243F, GGGGAATTCA TTAAATTCAGCAAGTGATCAACCTTC, XbaI + EcoRV +RB 2826R, להשתמש CCCTCTAGATATCTATTTGGACTCTCCTGGGAGATGTTTACTTCC.
- שיבוט השבר שנוצר (1546 bp) בין האתרים הגבלה EcoR1 , XbaI pCS2 + וקטור CB-Myc6 כמו שתואר לעיל1,12.
הערה: הבונה CB-Myc6 1012-bp-ארוך (חומצות אמינו 337) התמזגו למקטע Rb1 גרם חלבון של חומצות אמינו כ 865 (kDa כ 108), אשר הוא מעט קטן יותר החלבון RB1 אנדוגני (~ 110 kDa) (איור 1 ), עם תג6 CB-Myc אמיני, Rb1 ב קצה קרבוקסילי.
-
לבצע את subcloning בשלב השני לתוך הווקטור אחוי pTet.
- כדי להגביר את השבר פיוז'ן CB-RB-Myc6 וכדי לקבל ט-יזם, להגביר את הקלטת, המורכב CB-myc6-Rb1 באמצעות תחל המכיל את EcoRV (XbaI + EcoRV + 2826R רובידיום) ואתרים סאלי : עבור סאלי + FCB, השתמש CCAGTCGACAGGATGTGGTGGTCCTTGATCCTTC.
- Subclone השבר שנוצר (2567 bp) לתוך וקטור pTet-Splice, בין האתרים הגבלת סאלי , EcoRV , כזה שיאפשר את transgene TetO-DN-CB-myc6-Rb1 כולו, כולל את אינטרון SV40 תיקים עשויים לסמן, יכול להיות מבודד דרך מערכת העיכול יחיד עם NotI (איור 1B).
הערה: השבר NotI שימש ליצירת התורמים שחיים מהונדס.
2. בבדיקת חוץ גופית של Transgene TetO-DN-CB-myc6-Rb1
-
Dox-רגולציה: NIH3T3 תא קו
הערה: אלא אם נכתב אחרת, כל אמצעי האחסון הותאמו לצלחת 6-. טוב.- לגדול בעקבות המפרטים של הספק, באמצעות התקשורת תרבות מומלצים התא המכיל 10% סרום שור העובר ב 37 ° C עם 10% CO2תאים NIH3T3.
- Cotransfect התאים עם pTet-Splice, וקטורים pCMV-Tet3G (משלב 1) עבור 24h. בצע את השלבים המוזכרים להלן עבור cotransfection.
- מערבבים 2 – 4 µL של ריאגנט/הבאר השומנים מבוסס תקנים של 1 מ"ל של Dulbecco שלם (ללא סרום) ששינה נשר בינוני (DMEM) עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. לצלחת 12 או 24-ובכן, להשתמש µL 250 או 500 של תרבות התקשורת, בהתאמה, לכוונן את עוצמת ריאגנט תקנים בהתאם.
- להוסיף 2-3 µg של פלסמיד DNA/טוב ריאגנט-DMEM תרביות תאים, תקופת דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר.
- להוסיף את תערובת המכילה DNA ו הכימית תרביות תאים ב- DMEM כדי מכל קידוח. לאחר 3 – 4 h של דגירה, להוסיף 1 מ"ל של התקשורת מלאה (כך שאמצעי האחסון סופי 2 מ ל/טוב). לשמור על aliquots של מניות Dox (1 מ"ג/מ"ל) ולהוסיף 2 µL בכל אחד וולס (+ Dox). דגירה התאים ב 37 ° C עם 5% CO2.
הערה: דגימות הבקרה צריכה להכיל תאים cotransfected אינו מטופל באמצעות Dox (-Dox), כמו גם תאים NIH3T3 transfected רק עם וקטור pCMV-Tet3G transactivator ו שטופלו Dox למשך 24 שעות. עבור pCMV-Tet3G, ריכוזים של 0.1 – 1 µg/mL Dox צריך להיות מספיק כדי לגרום את הביטוי transgene.
-
מבחן של הפיכות של הבונה באמצעות שורת תאים HEK293.
- לבדוק את הפיכות של transgene TetO-DN-CB-myc6-Rb1 , תרבות HEK293 תאים במינימום חיוני בינוני (EMEM הנשר) בעקבות המפרטים של הספק, cotransfect עם וקטורים אחוי pTet והן pCMV-Tet3G במשך 24 שעות ביממה, כפי שמתואר מעל (שלב 2.1.2).
- איון transgene, להסיר את התקשורת המכילות Dox לאחר 24 שעות, לשטוף את התאים 2 x x-3 בתמיסת פוספט buffered (PBS), דגירה אותם בתקשורת ללא Dox עבור h 24 נוספים.
הערה: על Dox-הסרת, איון transgene וביטוי חלבונים רגיל צריך להתחדש במהלך התקופה הזו 24 שעות ביממה.
-
כדי להעריך את הפונקציונליות של הבונה TetO-DN-CB-myc6-Rb1 בקידום התפשטות תאים לא מתוכננת, לבצע את ניתוח פונקציונלי באמצעות קו תא היי-OC1, כמתואר להלן.
- התרבות התאים היי-OC1 ב- 10% DMEM תחת מתירניות תנאים (33 ° C עם 10% CO2). ללימודים התפשטות תאים, לספור את התאים באמצעות מונה תא ותאים היי-OC1 צלחת 10,000 על צלחת 96-ובכן באמצעי אחסון 200 µL. דגירה התאים בן לילה.
- למחרת, לבצע cotransfection ארעי של וקטורים אחוי pTet ו- pCMV-Tet3G באמצעות ריאגנט השומנים מבוססי תקנים (ראה שלבים 2.1.2). בבאר נפרדים, לבצע at2 תרביות תאים pmR-ZsGreen1-µg באמצעות תקנים מבוססי השומנים הכימית (שלבים 2.1.2) כדי לחשב את שיעור תרביות תאים. השתמש תאים שאינם transfected כפקדים.
- לזהות הנוכחות של זריחה ירוק תחת מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (עירור = 485 ננומטר, פליטה = 530 ננומטר) עבור transfected תאים 24 שעות לאחר תרביות תאים. להקליט את נוכחות או היעדרות של זריחה ירוק, לחשב את הקצב של תרביות תאים המספר הכולל של תאים GFP-חיוביות (transfected תאים) על פני התאים המסומנת דאפי (כולל תאי).
הערה: אנחנו מעריכים שיעור תרביות תאים של ~ 70%. - כדי לעודד ביטוי transgene, להוסיף 1 µg/mL Dox transfected בתאים תוך שימוש המשנה השני כפקד (-Dox). להשתמש ללא טיפול תאי היי-OC1 פקדים נוספים.
- כדי להעריך את התפשטות תאים, השתמש ערכת התפשטות תאים על פי הפרוטוקול של היצרן.
- בקצרה, 48 שעות לאחר תרביות תאים, להסיר את המדיום תרבות תא ולהוסיף µL 100 1 x צבע מחייב פתרון כל טוב של microplate. תקופת דגירה של h 1-37 מעלות צלזיוס.
- לאחר מכן, למדוד את עוצמת קרינה פלואורסצנטית כל דגימה באמצעות קורא microplate קרינה פלואורסצנטית (עירור = 485 ננומטר, פליטה = 530 ננומטר).
- עוד יותר להעריך את התפשטות תאים באמצעות immunocytochemistry, צלחת התאים היי-OC1 על זכוכית מכסה בצלחת 12-ובכן, דגירה בין לילה ב 37 º C.
- למחרת, cotransfect עם pTet-Splice, pCMV-Tet3G ולבצע את הטיפול Dox (+ Dox). להשתמש בתאים untransfected כפקדים. תהליך היי-OC1 תאים עבור תיוג Ki-67.
- לתקן את התאים עם 4% paraformaldehyde (PFA) ב- PBS, pH 7.4, 10 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את התאים 3 x עם PBS קר כקרח דגירה התאים דטרגנט ללא יונית 0.25% ב- PBS למשך 10 דקות.
- לשטוף את התאים שוב, 3 x ב- PBS 5 דקות, לחסום שימוש בסרום 10% בתוך תא humidified לשעה בטמפרטורת החדר.
- דגירה התאים µL 500 של נוגדן ראשוני Ki-67 (דילול 1:200) עבור 3 שעות בטמפרטורת החדר או למשך הלילה ב 4 º C.
- לשטוף את התאים 3 x עבור חמש דקות עם PBS. לאחר מכן, דגירה התאים עם הנוגדן משני לשעה בטמפרטורת החדר בחושך.
- להסיר את הפתרון נוגדנים משניים. ולשטוף את התאים 3 x עם PBS למשך 5 דקות כל בחושך.
- Phalloidin סימון, דגירה היי-OC1 בתאים 1:200 phalloidin למשך 30 דקות. להוספת תווית את הגרעינים של תאים, דגירה התאים עם 5 µg/mL דאפי 10 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: ודא המספר המשלים לצבוע phalloidin שונה מאשר המספר המשלים נוגדנים משניים.
3. הדור של CBRb+/ROSA-CAG-rtTA+ (CBRb) העכברים הטרנסגניים ו Vivo בדיקות של הגישה DN-CBRb
- על אישור של ויסות Dox יעיל transgene TetO-DN-CB-myc6-Rb1 , לטהר את מקטע NotI, microinject אותם לתוך עכבר מופרות, אשר מועברים מאוחר יותר לתוך נקבות בהריון מדומים.
הערה: הליכים אלה בוצעו במתקן של אוניברסיטת נברסקה רפואי במרכז (UNMC) העכבר הגנום הנדסה הליבה. - לאחר הלידה, גנוטיפ הגורים באמצעות פריימר להגדיר ספציפית לאזור פיוז'ן CB-Rb1 : עבור CBRb F, השתמש CTGTGGCATTGAATCAGAAATTGTGGCTGG 3′ 5', והשתמש עבור CBRB R, 3′ GTACTTCTGCTATATGTGGCCATTACAACC יונקות.
הערה: גודל מוצר ה-PCR מובחנים agarose ג'ל הוא 401 bp (אזור CB 60-bp + 341-bp Rb1 באזור (טבלה 1). עשר שורות מייסד עצמאית אותרו, המבוסס על הנוכחות של transgene TetO-DN-CB-myc6-Rb1 . בחמש שורות אלה, רומא ירש את transgene, אשר אישר העברת germline transgene. אחת השורות הטרנסגניים שימש בסופו של דבר כדי ליצור, לשמור על הקו ולהפיק חיות ניסוי TetO-DN-CB-myc6-Rb1 ללימודי. - גזע בוגרים עכברים TetO-DN-CB-myc6-Rb1 אל קו משרן טטרציקלין רוזה-חטיבתי-rtTA (מניות #006965) (לחלופין, גזע לקו משרן tTA) ליצירת עכברים DN-CBRb ניסיוני. גנוטיפ הצאצאים של זה צלב שימוש בערכת תחל הבאה: לשימוש rtTA-WT R, GGAGCGGGAGAAATGGATATG; לשימוש rtTA מוטציה R, GCGAGGAGTTTGTCCTCAACC; עבור rtTA משותף, להשתמש AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT. גודל מוצר ה-PCR הם 340 bp (מוטציה), 340 bp ו- 650 bp (heterozygote), 650 bp (פראי-סוג).
- יוצרות עקומת מנה-תגובה של החלבון RB1 בעקבות הטיפול Dox כדי לקבוע את הזמן ואת משך הטיפול Dox צורך להפיק ביטוי transgene.
הערה: בניסוי זה, תספיג לרביעיית-PCR שימשו כדי להעריך רקמות ספציפיות transgene ההפעלה וביטוי RB1. - לבצע פלורסצנטיות בחיי עיר הכלאה (דגים) כדי לאשר את הכניסה גנומית של transgene.
הערה: זה בוצע במרכז על החלת גנומיקה של בית החולים לילדים חולים (טורונטו, קנדה). אליסה או המערבי סופג (באמצעות נוגדן ספציפי חלבון) יכול לשמש כדי להעריך transgene ההפעלה, רקמות-ירידה לפרטים ושינויים ברמות של הנקו אנדוגני. עבור הבונה DN-CB-myc6-Rb1 , השתמשנו נוגדן anti-RB1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באופן כללי, עיצוב מוטציה DN דורש כמות ניכרת של מידע על המבנה והתפקוד של הנקו. לעומת זאת, האסטרטגיה DN המוצג כאן הוא שימושי במיוחד בעת המידע המבני ופונקציונלי עבור הנקו מוגבל. אם הנקו חלבון multimeric, פיוז'ן של יחידת משנה אחת כדי פרוטאז lysosomal דומיננטית יכול לעכב את multimer שהורכבו ו, באופן פוטנציאלי, אחר ליגנדים באמצעות שילוב של proteolysis של subunits אנדוגני הטיית subcellular multimer ל ליזוזום. כדי לאשר שיבוט מוצלח ולבדוק את האפקטיביות של transgene מוסדר Dox ההפעלה, מטוהרים pTet-Splice פלסמיד המכיל את TetO-DN-CB-myc6-Rb1 לבנות היה transfected לתאים NIH3T3 העכבר stably הביע את rtTA חלבון, אך לא Rb113. בהיעדר Dox, התאים לבטא rtTA מוצגים אין ביטוי RB1, ואילו ביטוי RB1 חזקים נצפתה בנוכחות Dox (איור 2א). בשלב הבא, כדי לבדוק את הפיכות של המערכת, אנחנו cotransfected תאים HEK293 (אשר endogenously אקספרס Rb114) עם pTet מטוהרים-Splice /TetO-DN-CB-myc6-Rb1 , את הווקטורים pCMV-Tet3G. כצפוי, הביטוי של החלבון RB1 אנדוגני היה באופן משמעותי עכבות על ההפעלה transgene על ידי הוספת Dox בתקשורת התרבות התא (איור 2B). כדי לבדוק את הפיכות של המערכת, לאחר תקופה של 24 שעות, בקבוצת משנה של תאים HEK293, אנו מוחלף התקשורת התרבות תאים המכילים Dox מדיה ללא Dox טריים, מודגרות את התאים עבור מתכוון 24 נוספים התומכים מוסדר Dox הפיכות, RB1 לביטוי שוחזר על הסרת Dox מהתקשורת תרבות (איור 2B). Transfected תאים HEK293, כי לא טופלו עם Dox או תאים HEK293 שטופלו Dox transfected עם pCMV-Tet3G וקטור בלבד (איור 2B) הראו רמות הבסיס ביטוי RB1 אנדוגני. מכיוון NIH3T3 תאים שאינם מבטאים חלבון RB1 באופן טבעי, תגובתיות RB1 חיובית היא עקב ההצטברות של החלבון RB1 מהונדס. לאור האינטרס שלנו בהשפעת proliferative פוטנציאל הבונה TetO-DN-CB-myc6-Rb1 במערכת השמיעה, מדדנו בתוכן DNA הכולל אחוי pTet /TetO-DN-CB-myc6-Rb1- ו pCMV-Tet3G-transfected היי-OC1 תאים ( איברים באוזן הפנימית של קו תא נגזר קורטי) נוכחות, היעדר Dox. בקנה אחד עם ההשערה העבודה המוצגת כאן, גידול משמעותי בתוכן ה-DNA (תואם לגידול במספר התאים) נצפתה ב שטופלו Dox אבל לא מטופל (בקרה) transfected היי-OC1 תאים (איור 3 א - 3 C ).
בעקבות האישור במבחנה פעילות transgene והתפקוד, נוצר מודל הטרנסגניים העכבר. דגים, באמצעות digoxigenin TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (מחדירים)-סוס צנון peroxidase (HRP) / בדיקה tyramine ביוטין/אבידין-Cy5-עם התווית, G-פסים של עכברים זכרים splenocytes ועל אוזנו fibroblasts בוצעו כדי לאשר את הכניסה transgene ב העכברים הטרנסגניים הגנום. בין המייסדים להעברת germline חמש, קו 14 הראה transgene עקבית של ההכנסה בתוך קטע 10C 3 ~ D2 (איור 4A - 4 C). עכברים מהקו הזה שימשו כדי להקים מושבות רבייה ולהפיק חיות ניסוי ללימודי. כדי לברר מהו הזמן האופטימלי עבור אינדוקציה Dox והפעלה transgene TetO-DN-CB-myc6-Rb1 , חילקנו את העכברים הטרנסגניים לשלוש קבוצות שונות, שבה Dox היה מנוהל במי השתייה לפרקי זמן משתנים: קבוצה 1 (3 ימים של טיפול), קבוצה 2 (7 ימים של טיפול) ו- קבוצה 3 (10 ימים של טיפול). עם סיום הטיפול, שינויים בביטוי חלבונים RB1 היו לאומדן המערבי סופג (איור 5A - 5 D). משום DN וחלבונים RB1 מקורי יש משקל מולקולרי דומה, הם לא יכול להיפתר אחד מהשני על אבן חשופה המערבי. עם זאת, בקנה אחד עם גידול ראשוני של חלבון RB1 (עקב ההצטברות של DN-RB1 וחלבונים אנדוגני), חל גידול ראשוני בביטוי הכולל RB1 חלבון cochleae העכבר הטרנסגניים לעומת קבוצת הביקורת (איור 5 A). יתר על כן, בקנה אחד עם הפעילות מעכבות, הפרוטאוליטי של המוצר transgene TetO-DN-CB-myc6-Rb1 , ירידה לכימות בביטוי RB1 נצפתה בקבוצות 2 ו- 3 לעומת קבוצה 1 קבוצות שליטה ( איור 5A - 5 D). ראוי לציין, טיפול ארוך יותר מ- 10 ימים לא לגרום שינוי נוסף בביטוי חלבונים RB1. לפיכך, 10 ימים של טיפול Dox נחשב מיטבי, משמשת עבור מחקרים נוספים.
כי rtTA, וכתוצאה מכך TetO-DN-CB-myc6-Rb1 transgene ההפעלה נמצאים תחת האמרגן רוזה-חטיבתי בכל מקום, RB1 יכול להיות פוטנציאל עכבות בכל רקמות או התא שבו הביע endogenously RB1is (למשל, הריאות, הלב, רשתית העין). מבחן הנחת ולהעריך ירידה לפרטים רקמות של transgene, cochleae, הריאות, הלב, ביופסיות העין היו גזור מן TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA, היו עכברים שליטה (לא נושאת את transgene רוזה-חטיבתי-rtTA ) העריכו לביטוי RB1 (איור 6A - 6 C). ללא קשר הרקמה לבדיקה, נצפתה ירידה משמעותית RB1 חלבון ב- TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA אך לא בקבוצת הביקורת (איור 6א). בניגוד חד, לרביעיית-PCR מנתח עין, הלב, וכן cochleae של Dox שטופלו TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA , שליטה מתאימים לגיל עכברים הראה של קולטנים upregulation משמעותית של תמליל DN-CBRb ברקמות של לשעבר אבל לא עכברים האחרון (איור 6C). בסך הכל, תוצאות אלו מאשרים את היעילות של הבונה. עלייה בביטוי התמליל משקף את אינדוקציה transgene מוסדר Dox יעיל. באופן דומה, ירידה בביטוי חלבונים הוא עקבי עם ניתוב ו הפרוטאוליטי מהשפלת RB1 אנדוגני.
איור 1: רב שלבי שכפול של CBRb ושל דור של inducible TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA. (א) לוח זה מראה את שכפול של השבר Rb1 לתוך וקטור pCS2-CB-Myc6 . תוצר הגן Rb1 1583-bp היה PCR מוגבר באמצעות EcoRI + RB1243 קדימה תחל הפוכה Xba + EcoRV + RB2826 . השבר Rb1 וכתוצאה מכך היה לשכפל בין האתרים ההגבלה EcoRI , Xbal של וקטור pCS2 המכיל הבונה CB-Myc6 כדי ליצור את הווקטור CB-myc6 + pCS2 + Rb1 . (B) CB-myc6 + Rb1 הרסיס היה משובטים לתוך וקטור pTetSplice בין האתרים הגבלת סאלי , EcoRV . אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : האפקטיביות של הפעלת מוסדר Dox transgene. (א) NIH3T3 תאים שאינם מבטאים בדרך כלל RB113. המאשר את ההפעלה יעיל של הבונה TetO-DN-CB-myc6-Rb1 , ניתוח תספיג עם נוגדן anti-RB1 גילה ביטוי RB1 חזקים בנוכחות Dox (מסלולים 1 ו- 3), אך לא העדר שלה (נתיבים 2 ו- 4). (B) תאים HEK293, אשר endogenously אקספרס Rb114, היו cotransfected עם TetO-DN-CB-myc6-Rb1 , הווקטור transactivator pCMV-Tet3G. בהיעדר Dox (ליין 1), ביטוי RB1 חיובית נצפתה. התוספת של Dox למערכת גרמה TetO-DN-CB-myc6-Rb1 הפעלה של downregulation RB1 (ליין 2). הביטוי RB1 חודשה 24 שעות לאחר Dox הוסר מהתקשורת (ליין 3). C = שליטה, תאים HEK293 untransfected אינו מטופל באמצעות Dox. זהו עיבוד של דמות שפורסם במקור בכתב העת גבולות במדעי המוח הסלולר2. רבייה שלו מסכים עם גבולות'מדיניות על סופרים' שמירת זכויות יוצרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : הפעלת transgene בתיווך Dox DN-CBRb מגביר את התפשטות תא. (א) היי-OC1 תאים cotransfected עם מטוהרים TetO-DN-CB-myc6-Rb1, ותרבותית הווקטורים pCMV-Tet3G היו היעדרות (−) או (+) הימצאות Dox. התפשטות תאים נקבע 48 שעות לאחר תרביות תאים באמצעות וזמינותו של התפשטות. אחוז השינוי התפשטות מחושב באמצעות שינוי בערכים זריחה עם תאים untransfected כמו פקד. עלייה צנועה אך משמעותית במספר התאים נצפתה בתאים transfected, לאחר הטיפול Dox. לעומת זאת, ללא שינויים משמעותיים נצפו בין תאים היי-OC1 transfected Dox לא מטופלים עם (−) ואת הפקד untransfected. (B) היי-OC1 תאים untransfected או (ג) cotransfected עם מטוהרים TetO-DN-CB-myc6-Rb1 ומוענקת לו הווקטורים pCMV-Tet3G בתרבית תוך הנוכחות (+) Dox היו Ki-67 (אדום), Phalloidin (ירוק) ודאפי (כחול). P < 0.05. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. זהו עיבוד של דמות שפורסם במקור בכתב העת גבולות במדעי המוח הסלולר2. רבייה שלו מסכים עם גבולות'מדיניות על סופרים' שמירת זכויות יוצרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : פלורסנט בחיי עיר הכלאה (דגים) אישור של החדרת transgene TetO-DN-CB-myc6-Rb1 גנומית. PCS2-CBRb (digoxigenin בדיקה/אנטי-DIG-HRP/tyramide-ביוטין/אבידין-Cy5, באדום) מבחן בדיקה היה hybridized splenocytes ועל אוזנו פיברובלסט כל תא כדי לראות אם האות בדיקה יכולה להתגלות או לא עם עותק אחד היעד הוספה בגודל של 2.5 kb. PCS2-CBRb לבדוק בדיקה hybridized על כרומוזום אחד 10 עם בהיר, אותות לווין כפיל הראה החדרת transgene TetO-DN-CB-myc6-Rb1 בתוך קטע 10 C 3-D2. החללית שליטה RP23 - 267G 24 (ספקטרום ירוק) hybridized על כרומוזום 10-להקת 10A1 הצפוי, אישר כי ה-DNA CBRb עניין מוכנס לתוך כרומוזום 10. מפה של הופעות הלהקה G (A) בלוח זה. (B) לוח זה מראה את התמונה דגים tyramide הגברה (TSA) אות מ מפה של אותו, כפי שמוצג פאנל A. (ג) לוח זה מציג תמונות ללא הפרדות צבע של כרומוזום 10 מציג (1) G-פסים, דגים (2) TSA, והפכתי (3) TSA דג עם דאפי פסים. אדום = בדיקה pCS2-CBRb; כחול = דאפי פסים; ירוק = בדיקה שליטה RP23 - 267G 24. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : DN-CBRb הפעלה transgene באוזן הפנימית של כמחנכת (P) 36 TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA+ (CBRb+), רוזה-חטיבתי-rtTA+ (CBRb−) עכברים לאחר 3 (קבוצה 1), 7 (קבוצה 2), ו- 10 (קבוצה 3) ימי Dox הטיפול. (א-ג) אנטי-RB1, אשר מגיב עם צורות הן hyperphosphorylated והן hypophosphorylated של RB1, טוב כמו אנטי-c-myc נוגדנים שימשו למטרות איתור. ניתוח densitometric נעשה באמצעות תוכנת ImageJ. הערכים המתאימים שהתקבלו היו מנורמל לפקד שלילי CBRb− (-) ולאחר מכן לרשת β-אקטין. רמות ביטוי RB1 היחסי מוצגים מתחת כל כתם. (ד) ייצוג גרפי של רמות הביטוי RB1 מנורמל להתוות נגד זיהוי מדגיש RB1 נמוך באופן עקבי טיפולים שונים ב- CBRb+ (+) דגימות. כל ליין על הג'ל תספיג ואת כל עמודה על פריט הגרפיקה תואמות אדם שונה. P < 0.05.This איור פורסם לראשונה בכתב העת גבולות במדעי המוח הסלולר2. רבייה שלו מסכים עם גבולות'מדיניות על סופרים' שמירת זכויות יוצרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6 : ניתוח מרחבי של הפעלת transgene TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA P18 TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA+ (+) ו- DN-CBRb+/רוזה-חטיבתי-rtTA− שלילי עכברים שליטה (-) לב, עיניים, הריאות וכלי שבלול. (א) המאשרת את היעילות של transgene בתיווך Dox הפעלה, הביטוי של RB1 אנדוגני היה downregulated, CBRb+/רוזה-חטיבתי-rtTA+ רקמות אבל לא ברקמות עכברים שליטה שלילי. ניתוח densitometric בוצע כמתואר באיור5. רמות ביטוי RB1 היחסי מוצגים מתחת כל כתם. (B) לוח זה מציג ייצוג גרפי של רמות הביטוי RB1 מנורמל, לעומת ברקמות שונות. וריאציה interindividual ברמות RB1 אנדוגני עשוי להסביר הבדלים תגובות הפרט transgene הפעלה ו- RB1 downregulation. (ג) RT-PCR מנתח בעין, הלב, וגילה cochleae של קולטנים upregulation משמעותית של התעתיק TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA ברקמות Dox שטופלו TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA+ , אבל לא ב- DN-CBRb+/רוזה-חטיבתי-rtTA− שלילי קבוצת הביקורת. /RtTA CBRb++ = TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA+; CBRb−/rtTA+ = רוזה-חטיבתי-rtTA+; P < 0.05. איור זה פורסם לראשונה בכתב העת גבולות במדעי המוח הסלולר2. רבייה שלו מסכים עם גבולות'מדיניות על סופרים' שמירת זכויות יוצרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
טבלה 1: מצב ה-PCR כדי לבדוק CB-Rb1 פיוז'ן אזור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כדי לעקוף את המגבלות המשויך אסטרטגיות הטרנסגניים מסורתיים, חיפשנו לייצר דגם העכבר שבו פוי אנדוגני יכולה להיות מותנית מומת על ידי overexpressing צורה מוטציה DN של זה בצורה ייתכן. כדי לבטל את הפונקציה של POIs אנדוגני, היו מספר אפשרויות המוצע15,16,17. יש לשנות אסטרטגיה גנטי קודמת של1 על-ידי שילוב Dox תלוית תעתיק למערכת אסטרטגיה פשוטה העסקת פיוז'ן של מגלן פרוטאז lysosomal כדי ליצור פפטיד מוטציה ביטוי אשר משפיע על הביטוי של אנדוגני פוי2. והכי חשוב, טכניקה זו דורשת ידע מוקדם של הנתיב המשויך הנקו. האסטרטגיה הנוכחית כדי עיכוב חלבונים DN מדגים האות לוקליזציה lysosomal על הגן פיוז'ן CBRb מסיט את המתחם כולו RB-אינטראקציה לכיוון ליזוזום2,3. פעם אחת בתוך ליזוזום, עיבוד הפרוטאוליטי של חלבונים אלה הוא יזם, המוביל שלהם השפלה3. המאפיין מהותי של החלבון התמזגו CB, המשויך את inducibility הפיך של המערכת TetO, גורם זה אלטרנטיבה יעילה אסטרטגיות הטרנסגניים מסורתי (למשל, נוקאאוט גנטי מלא, מחיקה מותנה), במיוחד כאשר מחיקה מלאה של הגן עניין אינו רצוי.
בתחילה התמקדנו במחקר החלבון RB1. מוטציות DN מתוארים בקלות הרבה ביותר בחלבונים לתפקד דיימר או multimers. עד כה, אין שום ראיה מגע פיזי ישיר בין מולקולות RB1. למרות זאת, הטבע הטבועה של פעילותה מאפשר נוכחות של מולקולות RB1 מרובים באותו מתחם בזמן נתון. לדוגמה, הכריכה של hypophosphorylated RB1 heterodimer E2F1-DP מספקת אתר איגוד נוספים, אשר נמצא בשימוש בדרך כלל היסטון deacetylase (HDAC)18,19,20. מצד שני, HDAC1 פיזית אינטראקציה עם RB1 ומאגד את מתחם זה, בתורו, heterotrimer E2F1-DP-RB1, ובכך לספק שעתוק נוספים דיכוי18. לפי גישה זו, אם לפחות אחד של מולקולות RB1 בקבוצה הוא מוטנט DN, זה ימנע המתחם מדחיק שעתוק, תוך שהיא מפחיתה את רמות RB1 אנדוגני, וכך הצליחו יותר במשיכת של פנוטיפ RB1 null. . הנה, עיכוב RB1 אנדוגני נצפתה 10 ימים לאחר הממשל של Dox במי השתייה. המינון האופטימלי עבור אינדוקציה Dox מאי, עם זאת, צריך להיקבע מדעית לכל מערכת. יתר על כן, מאז ביותר של רצף גנטי Rb1 שימש על איפור לבנות, זה אפשרי כי אפילו בהיעדר RB1 אנדוגני, החשבונאי RB1 יכול לקיים אינטראקציה עם וירתקו את עיכוב DN של כל אחד האיגוד שותפים של RB1. הנחת יכול להיבדק על-ידי הערכת רמת הביטוי של מולקולות RB1 מחייב ידוע.
חלבון זמני והפיך נחוצים, דק מוסדר איון תספק את הבסיס לפיתוח מגוון רחב של מחקרים במספר רחב אף יותר של תחומי מחקר חיפוש לשפוך אור על המנגנונים המורכבים הביוכימי ההיבטים השונים של הגנים ושל proteinactivity. בהתאם הנקו, להבין את המורכבות המולקולרי שלה הוא עשוי לשפר את היכולת החוקרים לתכנן אסטרטגיות טיפוליות מוצלחות. ירידה לפרטים transgene מוגברת יכולה להיות מושגת על ידי גידול DN בעכבר כדי היזמים רקמות ספציפיות נהיגה קווים tTA או rtTA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
PCS2 + CB-Myc6 וקטור הייתה מתנת הורביץ מרשל (אוניברסיטת וושינגטון, סיאטל, וושינגטון, ארה ב). התאים היי-OC1 נמסרו באדיבות בידי Fedrico Kalinec (גפן דוד בית ספר לרפואה, אוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס, קליפורניה, ארה). תמיכה טכנית סופק על ידי UNMC העכבר הגנום הנדסה הליבה (Gurumurthy רדיו אזרחי, דון פוגע, רולן הקואדרוס) והמתקן קרייטון אוניברסיטת משולב ביו הדמיה (ריצ'רד Hallworth, ג'ון Billheimer). הנדסה הגנום העכבר UNMC נתמכה על ידי פרס פיתוח מוסדיים (מושג) מ- NIH/NIGMS, להעניק מספר P20 GM103471. מתקן משולב הדמיה ביו נתמכה על ידי בית הספר אוניברסיטת קרייטון של רפואה ומענקים GM103427 ו- GM110768 מ NIH/NIGMS. המתקן נבנה עם תמיכה של מענקים של המרכז הארצי עבור משאבים למחקר (RR016469), את NIGMS (GM103427). הקווים עכבר הנוצר במחקר זה היו נשמרים במתקן משאבים בעלי חיים של אוניברסיטת קרייטון, תשתית אשר היה משופר באמצעות מענק על ידי NIH/NCRR G20RR024001. עבודה זו קיבלה בעבר תמיכה באמצעות של NIH/NCRR 5P20RR018788-/ NIH/NIGMS 8P20GM103471 COBRE להעניק (סמית ' ד שלי) NIH/orip ב R21OD019745-01A1 (S.M.R.-ס), של המתעוררים המחקר מענק של הקרן לבריאות שמיעה (ס' טרנג). התוכן של המחקר הזה הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את הנופים הרשמי של מכוני הבריאות הלאומיים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM | GIBCO-BRL | 11965-084 | |
| Minimum Essential Medium Eagle, MEME | Sigma | M8042 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442 | |
| Lipofectamine | DharmaFECT | T-2010-03 | |
| Sal I | Roche | 11745622 | |
| EcoRV-HF | New England BioLabs | R3195S | |
| NotI | Roche | 13090730 | |
| CaspaTag | Millipore | APT523 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Staurosporine | Sigma | S4400 | |
| CyQuant NF cell proliferation kit | Invitrogen | C35007 | |
| Retinoblastoma 1 antibody | Abcam | Ab6075 | |
| c-Myc antibody | Sigma | M5546 | |
| b-actin | Sigma | A5316 | |
| Ki-67 | Thermofisher scientific | MA5-14520 | |
| Phallodin | Thermofisher scientific | A12379 | |
| Fluorescence microplate reader | FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech | ||
| Epifluorescence microscope | NikonEclipse80i | ||
| The TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) mouse line is available from the Jackson Laboratory as JAX#032011. |
References
- Li, F. Q., et al. Preferential MyoD homodimer formation demonstrated by a general method of dominant negative mutation employing fusion with a lysosomal protease. Journal of Cell Biology. 135 (4), 1043-1057 (1996).
- Tarang, S., et al. Generation of a retinoblastoma (rb)1-inducible dominant-negative (DN) mouse model. Frontiers Cellular Neuroscience. 9 (52), (2015).
- Kominami, E., et al. The selective role of cathepsins B and D in the lysosomal degradation of endogenous and exogenous proteins. FEBS Letters. 287 (1-2), 189-192 (1991).
- Cortellino, S., et al. Defective ciliogenesis, embryonic lethality and severe impairment of the sonic hedgehog pathway caused by inactivation of the mouse complex A intraflagellar transport gene Ift122/Wdr10, partially overlapping with the DNA repair gene Med1/Mbd4. Developmental Biology. 325 (1), 225-237 (2009).
- Ferreira, C., et al. Early embryonic lethality of H ferritin gene deletion in mice. Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3021-3024 (2000).
- Lee, E. Y., et al. Mice deficient for rb are nonviable and show defects in neurogenesis and haematopoiesis. Nature. 359 (6393), 288-294 (1992).
- Turlo, K. A., et al. When cre-mediated recombination in mice does not result in protein loss. Genetics. 186 (3), 959-967 (2010).
- Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).
- Zhang, J., et al. The first knockout mouse model of retinoblastoma. Cell Cycle. 3 (7), 952-959 (2004).
- Zhao, H., et al. Deletions of retinoblastoma 1 (Rb1) and its repressing target S phase kinase-associated protein 2 (Skp2) are synthetic lethal in mouse embryogenesis. Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10201-10209 (2016).
- Yamasaki, L., et al. Loss of E2F-1 reduces tumorigenesis and extends the lifespan of Rb1(+/-) mice. Nature Genetics. 18 (4), 360-364 (1998).
- Li, F. Q., et al. Selection of a dominant negative retinoblastoma protein (RB) inhibiting satellite myoblast differentiation implies an indirect interaction between MyoD and RB. Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5129-5139 (2000).
- Pitkanen, K., et al. Expression of the human retinoblastoma gene product in mouse fibroblasts: Effects on cell proliferation and susceptibility to transformation. Experimental Cell Research. 207 (1), 99-106 (1993).
- Chano, T., et al. Neuromuscular abundance of RB1CC1 contributes to the non-proliferating enlarged cell phenotype through both RB1 maintenance and TSC1 degradation. International Journal of Molecular Medicine. 18 (3), 425-432 (2006).
- Kole, R., et al. RNA therapeutics: Beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (2), 125-140 (2012).
- Yamamoto, A., et al. The ons and offs of inducible transgenic technology: A review. Neurobiology of Disease. 8 (6), 923-932 (2001).
- Houdebine, L. M., et al. Transgenic animal models in biomedical research. Methods in Molecular Biology. 360, 163-202 (2007).
- Brehm, A., et al. Retinoblastoma protein recruits histone deacetylase to repress transcription. Nature. 391 (6667), 597-601 (1998).
- Lu, Z., et al. E2F-HDAC complexes negatively regulate the tumor suppressor gene ARHI in breast cancer. Oncogene. 25 (2), 230-239 (2006).
- Magnaghi-Jaulin, L., et al. Retinoblastoma protein represses transcription by recruiting a histone deacetylase. Nature. 391 (6667), 601-605 (1998).
