Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att utveckla en dominant-negativ inducerbara system, där något protein villkorligt kan inaktiveras genom att reversibelt överuttryck av en dominant-negativ mutant version av den.
Abstract
Dominant-negativ (DN) protein hämning är en kraftfull metod att manipulera proteinfunktion och erbjuder flera fördelar jämfört med andra tillvägagångssätt genomet. Till exempel även om chimär och Cre-LoxP inriktning strategier har använts i stor utsträckning, de inneboende begränsningarna av dessa strategier (dvs, läckande arrangören aktivitet, mosaik Cre uttryck, etc.) har avsevärt begränsat deras ansökan. Ett fullständigt borttagande av många endogena gener är dessutom embryonically dödliga, vilket gör det omöjligt att studera geners funktion i postnatal liv. För att möta dessa utmaningar, vi har gjort betydande ändringar i en tidig genteknik-protokoll och en kort (transgena) version av genen Rb1 i kombination med ett lysosomalt proteas procathepsin B (CB), att generera en DN musmodell av Rb1 (CBRb). På grund av närvaron av ett lysosomalt proteas dirigeras hela CB-RB1 fusion proteinet och dess samverkande komplex för proteasom-medierad nedbrytning. Dessutom kan förekomsten av en tetracyklin inducerare (rtTA) element i den transgena bygga en inducerbara och reversibel förordning av proteinet RB1. Förekomsten av en allestädes närvarande ROSA-CAG-arrangören i CBRb musmodell gör det ett användbart verktyg att utföra övergående och reversibla Rb1 gen ablation och ge forskarna en resurs för att förstå dess aktivitet i praktiskt taget alla celltyp där RB1 uttrycks.
Introduction
De flesta metoder syftar de genen och protein ablationerna förlita sig på permanenta processer, som i allmänhet leder till fullständig eliminering eller trunkering av genen, RNA sekvenser eller protein av intresse (POI). Det övergripande målet med denna metod är att konstruera ett rekombinant protein för att avskaffa funktionen av endogena, vildtyps-protein. Vi har revisited och fräschas en alternativ strategi1,2, som tillåter tillfälliga ablation av en INTRESSEPUNKT genom DN hämning. Denna metod fungerar för både multimeric och monomer peptider men passar bäst för proteiner som fungerar i en multimeric församling.
Metoden består av fusing de lysosomala proteasen CB till en del av en multimeric POI (CB fusion komplexa). Den resulterande CB fusionen komplexa kan interagera med och proteolytically smälta det kroppsegna proteinet eller avleda CB-POI hela komplexet till Lysosomen vara försämrade3. Dessutom möjliggör en kombination av CB fusion komplex med tetracyklin-kontrollerade transkriptionell (TetO) aktiveringssystemet inducerbara natur inducerbara och kontrollerad uttryck för transgenens i en reversibel mode2. Även om det är användbart i många fall, kan komplett borttagning av gener eller proteiner i vivo resultera i dödlighet4,5,6. Jämväl, vävnadsspecifika, villkorligt borttagande av vissa gener eller proteiner som använder Cre/Lox systemet kanske inte okomplicerad, eftersom det kommer i slutändan leda till permanent förlust av kritiska genomisk elements7. Därför beroende på genen eller POI, ingen av dessa metoder kommer att vara effektiva i att tillhandahålla en användbar modell för senare studier, särskilt gener eller proteiner funktionella studier i sen födsel och vuxna möss.
För att kringgå problemen i samband med sådana metoder och ge proof-of-principle på effektiviteten av den föreslagna metoden, har vi valt att testa metoden presenteras här genom att generera en villkorlig DN version av retinoblastom 1 (RB1) protein. Flera alternativ har varit föreslagna8,9,10 att avskaffa funktionen av endogena RB1; men alla av dem inför några av de samma begränsningar som diskuteras ovan: permanent könsceller radering av RB1 är embryonically dödliga, och konsekvent med sin tumör suppressor roll, permanent RB1 villkorlig borttagning leder till en mängd olika tumörer11. Även om en DN version av RB1 inte verkar förekomma naturligt, ett bättre alternativ till de för närvarande tillgängliga strategierna bör möjliggöra en temporally kontrollerade inaktivering av den endogena RB1 och ge en alternativ mekanism så småningom återställa dess funktion. Grunden för en sådan konstruktion beskrevs över två decennier sedan1. Men på grund av tekniska begränsningar saknade det en mekanism för att kontroll transgenens aktivering, svar och vävnadsspecificitet. Denna studie är först som kombinerar elegansen i doxycyklin (Dox)-beroende transkriptionell system med en konstruerade transgena konstruktion av lysosomala proteas CB och Rb1 proteiner. Den resulterande CBRb musmodellen möjliggör en tillfälligt reglerade Dox-medierad RB1 förordning2. Fördelen med att använda en sådan proteom-baserade strategi för att studera geners funktion är att det kan antas för någon gen av intresse, med minimal information om sin verksamhet.
Den föreslagna DN transgenens strategin erbjuder många fördelar jämfört med traditionella metoder. Först leder DN protein hämning till endast en partiell ablation i proteinaktiviteten, därmed bevara ett kvarvarande endogen uttryck. Ett sådant resultat är önskvärt i situationer där en fullständig eliminering av proteinaktiviteten leder till embryonal dödlighet, kraftigt begränsa någon undersökning för att studera geners funktion i en levande mus. Andra, förekomsten av TetO systemet möjliggör transgenens aktiveringen endast i närvaro av ett antibiotikum, som möjliggör en effektiv och reversibel kontroll av transgenens aktiviteten. Således, av uppehåll antibiotikumet administrering, transgena systemet kan inaktiveras, och en normal RB1-uttryck är tillbaka på plats. För det tredje, specificiteten av transgenens uttryck kan variera beroende på arrangören av val. Medan vi har valt den allestädes närvarande ROSA-CAG promotorn för proof-of-principle, kommer placera transgenens under en vävnad-specifika promotorn sannolikt att begränsa oönskade transgenens uttryck och underlätta studier om terapeutiska tillämpningen av denna transgenens metodik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Generation av transgena CBRb musen och alla djurvård och experiment som är associerad med studien godkändes av Creighton University institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) och utförs av deras riktlinjer.
1. transgena CB-Myc6-Rb1 konstruera
Obs: Kloning av CBRb i en pTet_Splice vektor skedde i en process i flera steg (figur 1A och 1B).
-
Utföra första skede kloning till pCS2 + CB-Myc6 vektor.
- Att skapa CBRb transgenens bygga, förstärka ett 1583-bp lång Rb1 cDNA fragment (528 aminosyror motsvarar regionen aminosyra 369 – 896) av proteinet RB1 använder följande primer: för mina +RB 1243F, använda GGGGAATTCA TTAAATTCAGCAAGTGATCAACCTTC, och för XbaI + EcoRV +RB 2826R, använda CCCTCTAGATATCTATTTGGACTCTCCTGGGAGATGTTTACTTCC.
- Klon fragmentet genereras (1546 bp) mellan EcoR1 och XbaI begränsning platser av pCS2 + CB-Myc6 vektor som tidigare beskrivits1,12.
Obs: Den 1012-bp lång CB-Myc6 Konstrukt (337 aminosyror) smält till Rb1 fragmentet resulterade i ett protein av cirka 865 aminosyror (ca 108 kDa), vilket är något mindre än endogena RB1 proteinet (~ 110 kDa) (figur 1 En), med ett CB-Myc6 tag vid N-terminalen och Rb1 på C-terminus.
-
Utföra den andra etappen subkloning in pTet-skarv vektorn.
- Att förstärka CB-RB-Myc6 fusion fragmentet och få Tet-promotorn, förstärka kassett, bestående av den CB-myc6-Rb1 med primers som innehåller EcoRV (XbaI + EcoRV + RB 2826R) och SalI platser: för SalI +CBF, Använd CCAGTCGACAGGATGTGGTGGTCCTTGATCCTTC.
- Subclone fragmentet genereras (2567 bp) i pTet-skarv vektorn, mellan SalI EcoRV begränsning platser och, på ett sådant sätt att den hela TetO-DN-CB-myc6-Rb1 transgenens, inklusive den SV40 intron och PolyA signal, kan isoleras genom en enda matsmältning med NotI (figur 1B).
Obs: NotI fragmentet användes för att generera de transgena finansiärerna.
2. i Vitro tester av den TetO-DN-CB-myc6-Rb1 transgenens
-
DOX-reglering: NIH3T3 cellinje
Obs: Om inte annat anges, har alla volymer justerats för en 6-bra platta.- Odla NIH3T3 cellerna efter leverantörens specifikationer, med rekommenderade cell kultur media som innehåller 10% fetalt bovint serum vid 37 ° C med 10% CO2.
- Cotransfect cellerna med pTet-skarv och pCMV-Tet3G vektorer (från steg 1) för 24 h. följa anvisningarna som nämns nedan för cotransfection.
- Blanda 2 – 4 µL av lipid-baserade transfection reagens/brunnen och 1 mL av ofullständig (utan serum) Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM) under 5 minuter i rumstemperatur. För en 12 - eller 24-väl plåt, Använd 250 eller 500 µL av kultur media, respektive, och justera volymen transfection reagens.
- Lägg 2 – 3 µg av plasmid DNA per brunn till transfection reagens-DMEM och inkubera i 20 min i rumstemperatur.
- Lägga till mixen som innehåller DNA och transfection reagenset i DMEM till varje brunn. Efter 3 – 4 h inkubation, tillsätt 1 mL komplett media (så att den slutliga volymen är 2 mL per brunn). Hålla alikvoter av Dox lager (1 mg/mL) och tillsätt 2 µL i var och en av brunnarna (+ Dox). Inkubera cellerna vid 37 ° C med 5% CO2.
Obs: Kontrollproverna bör bestå av cotransfected celler inte behandlas med Dox (-Dox) as well as NIH3T3 celler transfekterade endast med transactivator pCMV-Tet3G vektorn och behandlade med Dox för en 24 h period. För pCMV-Tet3G, koncentrationer av 0,1 – 1 µg/mL Dox vara tillräcklig för att framkalla transgenens uttryck.
-
Testa den konstruktionen med HEK293 cell: reversibilitet.
- Att testa de reversibiliteten av de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 transgenens, kultur HEK293 celler i örnens minst viktigt Medium (EMEM) efter leverantörens specifikationer och cotransfect med både pTet-skarv och pCMV-Tet3G vektorer för 24 h, som beskrivs ovan (steg 2.1.2).
- För transgenens inaktivering, ta bort Dox-innehållande media efter 24 h, tvätta cellerna 2 x-3 x med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och inkubera dem i Dox-fria medier för en ytterligare 24 h.
Obs: Vid Dox-borttagning, bör de transgenens inaktivering och regelbundna proteinuttryck återupptas inom denna 24 h period.
-
För att utvärdera funktionaliteten i den TetO-DN-CB-myc6-Rb1 konstruktionen att främja oplanerat cellproliferation, utföra funktionella analyser med en HEI-OC1 cellinje, enligt beskrivningen nedan.
- Kultur HEI-OC1 celler i 10% DMEM under tillåtande villkorar (33 ° C med 10% CO2). För cell spridning studier, räkna cellerna med en cell räknare, och plattan 10.000 HEI-OC1 celler på en plattan med 96 brunnar i en 200 µL volym. Inkubera cellerna över natten.
- Följande dag, utföra en övergående cotransfection av pTet-skarv och pCMV-Tet3G vektorer med hjälp av ett lipid-baserade transfection reagens (se 2.1.2). I en separat brunn, utföra pmR-ZsGreen1 transfection at2-µg med lipid-baserade transfection reagens (steg 2.1.2) för att beräkna transfection. Använda icke-transfekterade celler som kontroller.
- Detektering av grön fluorescens i fluorescens Mikroskop (excitation = 485 nm, emission = 530 nm) för de transfekterade cellerna 24 h efter transfection. Registrera närvaro eller frånvaro av grön fluorescens och beräkna andelen transfection som det totala antalet GFP-positiva celler (transfekterade celler) över de celler som märkt med DAPI (totala celler).
Obs: Vi uppskattade en transfection andelen ~ 70%. - För att inducera transgenens uttryck, lägga 1 µg/mL Dox till en delmängd av transfekterade celler när du använder den andra delmängden som kontroll (-Dox). Använda obehandlad HEI-OC1 celler som ytterligare kontroller.
- För att bedöma cellproliferation, använda en cell spridning kit enligt tillverkarens protokollet.
- I korthet, 48 h efter transfection, ta bort cellodlingsmedium och tillsätt 100 µL av 1 x dye-bindande lösning till varje brunn för mikroplattan. Inkubera i 1 timme vid 37 ° C.
- Därefter, Mät fluorescensintensiteten av varje prov med en fluorescens microplate reader (excitation = 485 nm, emission = 530 nm).
- Att ytterligare bedöma cellproliferation använder immuncytokemi, tallrik HEI-OC1 cellerna på ett omslag glas i en 12-well platta och inkubera över natten vid 37 ° C.
- Följande dag, cotransfect med pTet-skarv och pCMV-Tet3G och utföra den Dox behandling (+ Dox). Använd untransfected celler som kontroller. Bearbeta HEI-OC1 celler för Ki-67 märkning.
- Fixa cellerna med 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i PBS, pH 7,4, under 10 minuter vid rumstemperatur. Tvätta cellerna 3 x med iskall PBS och inkubera cellerna i 0,25% icke-joniskt rengöringsmedel i PBS i 10 min.
- Tvätta cellerna igen, 3 x i PBS för 5 min och block med 10% serum i en fuktig kammare för 1 h i rumstemperatur.
- Inkubera cellerna i 500 µL av Ki-67 primär antikropp (spädning 1: 200) för 3 h i rumstemperatur eller över natten vid 4 ° C.
- Tvätta cellerna 3 x 5 min med PBS. Efter det, inkubera cellerna med den sekundära antikroppen för 1 h i rumstemperatur i mörkret.
- Ta bort sekundär antikropp lösningen och tvätta cellerna 3 x med PBS för 5 min varje i mörkret.
- För phalloidin märkning, inkubera HEI-OC1 cellerna i 1: 200 phalloidin i 30 min. Etikettera atomkärnor av celler, inkubera cellerna med 5 µg/mL DAPI under 10 minuter vid rumstemperatur.
Obs: Säkerställa att phalloidin dye konjugatet är annorlunda än sekundär antikropp konjugatet.
3. generation av CBRb+/ROSA-CAG-rtTA+ (CBRb) transgena möss och Vivo test av DN-CBRb strategi
- Vid bekräftelse av effektiva Dox regleringen av den TetO-DN-CB-myc6-Rb1 transgenens, rena NotI fragmentet och microinject dem till mus zygoter, som senare överförs till pseudo dräktiga honor.
Obs: Dessa förfaranden har genomförts vid University of Nebraska Medical Center (UNMC) mus genomet Engineering Core anläggningen. - Efter leverans, genotyp valparna använder primer ange för regionen CB-Rb1 fusion: CBRb F, använda 5' CTGTGGCATTGAATCAGAAATTGTGGCTGG 3′, och för CBRB R, använda 5′ GTACTTCTGCTATATGTGGCCATTACAACC 3′.
Obs: PCR-Produktstorlek observerats på agarosgel är 401 bp (60-bp CB regionen + 341-bp Rb1 regionen (tabell 1). Tio oberoende grundare rader identifierades, baserat på förekomsten av de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 transgenens. I fem av dessa linjer ärvde avkomman den transgenens, som bekräftade könsceller överföringen av transgenens. En av de transgena linjerna användes i slutändan att etablera och upprätthålla linjen och generera TetO-DN-CB-myc6-Rb1 försöksdjur för fortsatta studier. - Rasen vuxna TetO-DN-CB-myc6-Rb1 möss till raden ROSA-CAG-rtTA tetracyklin inducerare (lager nr 006965) (alternativt rasen till en tTA inducerare linje) för att generera experimentella DN-CBRb möss. Genotyp avkomman av detta kors med följande primer uppsättning: för rtTA-WT R, använda GGAGCGGGAGAAATGGATATG; för rtTA Mutant R, använda GCGAGGAGTTTGTCCTCAACC; och för rtTA Common, AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT. PCR-produktstorlekar är 340 bp (mutant), 340 bp och 650 bp (heterozygot) och 650 bp (vildtyp).
- Generera en dos-respons kurva av proteinet RB1 efter Dox behandlingen att bestämma tid och längd av Dox behandlingen krävs för att framkalla ett transgenens uttryck.
Obs: I detta experiment användes western blot och qRT-PCR att bedöma vävnadsspecifika transgenens aktivering och RB1 uttryck. - Utföra fluorescens i situ hybridisering (FISH) att bekräfta genomisk införandet av transgenens.
Obs: Detta genomfördes vid centrum för tillämpas genomik av sjukhuset för sjuka barn (Toronto, Kanada). ELISA eller western blotting (med protein-specifika antikroppar) kan användas för att bedöma transgenens aktivering, vävnadsspecificitet och förändringar i nivåerna av endogena POI. I den DN-CB-myc6-Rb1 bygga används en anti-RB1 antikropp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Allmänhet, utforma en DN mutation kräver en ansenlig mängd information om struktur och funktion av POI. Däremot är DN strategin presenteras här särskilt användbart när den strukturella och funktionella informationen för POI är begränsad. Om POI är ett multimeric protein, en fusion av en delenhet till ett lysosomalt proteas dominant kan hämma den monterade multimer, och eventuellt andra ligander genom en kombination av proteolys av endogena subunitsna och subcellulär avledning av den multimer till Lysosomen. För att bekräfta lyckad kloning och testa effektiviteten av Dox-reglerade transgenens aktivering, renat pTet-skarv plasmiden som innehåller den TetO-DN-CB-myc6-Rb1 var konstruktion transfekterade in mus NIH3T3 celler som stabilt uttryckt rtTA protein, men inte Rb113. I avsaknad av Dox visas celler som uttrycker rtTA ingen RB1 uttryck, medan ett robust RB1 uttryck observerades i närvaro av Dox (figur 2A). Nästa, för att testa reversibiliteten av systemet, vi cotransfected HEK293 celler (som endogent express Rb114) med renat pTet-skarv /TetO-DN-CB-myc6-Rb1 och pCMV-Tet3G vektorer. Som förväntat, hämmades avsevärt uttrycket av endogena RB1 protein på transgenens aktivering genom tillsats av Dox i cell kultur media (bild 2B). För att testa reversibiliteten av systemet, efter en 24 h period, i en delmängd av HEK293 celler, vi ersatte Dox-innehållande cell kulturmassmedia med färska Dox-fria medier och inkuberas cellerna för en ytterligare 24 h. stödja Dox-reglerade reversibilitet, RB1 uttryck återställdes efter Dox borttagning från kultur media (bild 2B). Transfekterade HEK293 celler som inte behandlades med Dox eller Dox-behandlade HEK293 celler transfekterade med pCMV-Tet3G vector endast (figur 2B) visade basala nivåer av endogena RB1 uttryck. Eftersom NIH3T3 celler inte uttrycker RB1 protein naturligt, är den positiva RB1-reaktiviteten på grund av ansamling av transgena RB1 proteinet. Med tanke på vårt intresse för potentiella proliferativ effekten av den TetO-DN-CB-myc6-Rb1 bygga i hörselsystemet, Vi mätte det totala DNA-innehållet i pTet-skarv /TetO-DN-CB-myc6-Rb1- och pCMV-Tet3G-transfekterade HEI-OC1 celler () innerörat organ av en Corti-derived cellinje) i närvaro och frånvaro av Dox. Konsekvent med arbetshypotesen presenteras här, en betydande ökning av de DNA-innehållet (motsvarande en ökning av antalet celler) observerades i Dox-behandlade men inte (kontrollgrupp) transfekterade HEI-OC1 celler (figur 3A -, 3 C ).
Efter en in vitro-bekräftelse av transgenens aktivitet och funktion, en transgen musmodell genererades. FISKA, med en TetO-DN-CB-myc6-Rb1 digoxigenin (DIG)-häst Rädisa peroxidas (HRP) / tyramin-biotin/avidinen-Cy5-märkt sond, och G-bandning av manliga möss splenocytes och örat fibroblaster utfördes för att bekräfta transgenens insättningspunkten i den transgena möss genomet. Bland fem könsceller sändande grundarna, linje 14 visade en konsekvent transgenens införande inom segmentet 10C 3 ~ D2 (figur 4A - 4 C). Möss från denna linje användes för att fastställa häckningskolonier och generera försöksdjur för fortsatta studier. För att avgöra den optimala tiden för Dox induktion och TetO-DN-CB-myc6-Rb1 transgenens aktivering, har vi delat in de transgena möss i tre olika grupper, vari Dox administrerades i dricksvatten för variabla längder tid: grupp 1 (3 dagars behandling), grupp 2 (7 dagars behandling) och grupp 3 (10 dagars behandling). Efter avslutad behandling bedömdes förändringar i RB1 proteinuttryck av western blotting (figur 5A - 5 D). Eftersom DN och infödda RB1 proteiner har liknande molekylvikter, kan inte de lösas från varandra på en western blot. Dock konsekvent med en inledande ökning i RB1 protein (på grund av ansamling av DN-RB1 och endogena proteiner), fanns det en inledande ökning av totala RB1 proteinuttryck i transgena möss cochleae jämfört med kontrollgruppen (figur 5 A). Dessutom konsekvent med hämmande och proteolytiska aktiviteten av TetO-DN-CB-myc6-Rb1 transgenens produkt, en kvantifierbar RB1 uttryck observerades i grupperna 2 och 3 jämfört med grupp 1 och kontroll grupper ( Figur 5A - 5 D). Notera resulterade behandling längre än 10 dagar inte i någon vidare förändring i RB1 proteinuttryck. 10 dagar av Dox behandling ansågs således optimalt och används för fortsatta studier.
Eftersom den rtTA och, följaktligen, TetO-DN-CB-myc6-Rb1 transgenens aktivering under den allestädes närvarande ROSA-CAG -promotorn, RB1 potentiellt kunde hämmas i någon vävnads- eller där RB1is endogenously uttryckt (t.ex. lungor, hjärta, näthinnan). För att testa denna premiss och utvärdera den transgenens vävnadsspecificitet, cochleae, lungorna, hjärtat och ögat biopsier var dissekeras från TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA, och kontroll möss (inte bära den ROSA-CAG-rtTA transgenens) var bedömas för RB1 uttryck (figur 6A - 6 C). Oavsett den vävnad som analyseras, observerades en signifikant minskning RB1 protein i TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA men inte i kontrollgruppen(figur 6). I skarp kontrast, qRT-PCR-analyser i ögat, hjärtat och cochleae av Dox-behandlade TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA och åldersmatchade kontroll möss visade en signifikant uppreglering av DN-CBRb avskriften i vävnader i den tidigare men inte de sistnämnda möss (figur 6C). Sammantaget bekräftar dessa resultat effektiviteten i konstruktionen. En ökning av avskrift uttryck återspeglar effektiva Dox-reglerade transgenens induktion. Jämväl, en minskning av proteinuttryck är förenligt med routing och proteolytisk nedbrytning av den endogena RB1.
Figur 1: flerstegs kloning av CBRb och generering av den inducerbara TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA. (A) i denna panel visas kloning av Rb1 fragmentet till pCS2-CB-Myc6 vektorn. En 1583-bp Rb1 genprodukten var PCR amplifieras med hjälp av Mina + RB1243 fram och Xba + EcoRV + RB2826 omvänd primers. Det resulterande Rb1 -fragmentet har klonats mellan platser Mina och Xbal begränsning av pCS2 vektor som innehåller den CB-Myc6 konstruktionen för att generera pCS2 + CB-myc6 + Rb1 vektorn. (B) på CB-myc6 + Rb1 fragment var klonade in pTetSplice vector mellan platser SalI och EcoRV begränsning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Effektiviteten av Dox-reglerade transgenens aktiveringen. (A) NIH3T3 celler uttrycker oftast inte RB113. En western blot-analys med anti-RB1 antikroppen bekräftar effektiv aktivering av den TetO-DN-CB-myc6-Rb1 konstruktionen, och avslöjade ett robust RB1 uttryck i närvaro av Dox (körfält 1 och 3), men inte i dess frånvaro (körfält 2 och 4). (B) HEK293 celler, som endogent express Rb114, var cotransfected med TetO-DN-CB-myc6-Rb1 och pCMV-Tet3G transactivator vektorn. I avsaknad av Dox (lane 1) sågs en positiv RB1-uttryck. Tillägg av Dox till systemet orsakat TetO-DN-CB-myc6-Rb1 aktivering och RB1 nedreglering (lane 2). RB1 uttrycket återupptogs 24 h efter Dox togs bort från media (lane 3). C = kontroll, untransfected HEK293 celler inte behandlas med Dox. Detta är en anpassning från en figur som ursprungligen publicerades i tidskriften Frontiers in cellulär neurovetenskap2. Dess reproduktion instämmer gränser'politik på författarna' copyright retention. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Dox-medierad DN-CBRb transgenens aktivering ökar cellproliferation. (A) HEI-OC1 celler cotransfected med renat TetO-DN-CB-myc6-Rb1och pCMV-Tet3G vektorer odlades i frånvaro (−) eller närvaro (+) av Dox. Cellproliferation bestämdes 48 h efter den transfection använder en proliferation assay. Den procentuella förändringen av spridning beräknades med hjälp av en förändring i fluorescens värden med untransfected celler som en kontroll. En blygsam men betydande ökning av antalet celler observerades i de transfekterade cellerna efter Dox behandling. Däremot inga signifikanta förändringar observerades mellan transfekterade HEI-OC1 celler inte behandlade med (−) Dox och untransfected kontroll. (B) HEI-OC1 celler untransfected eller (C) cotransfected med renat TetO-DN-CB-myc6-Rb1 och pCMV-Tet3G vektorer odlade i närvaro (+) av Dox var märkt med Ki-67 (röd), Phalloidin (grön) och DAPI (blå). P < 0,05. Skalstapeln = 10 µm. Detta är en anpassning från en figur som ursprungligen publicerades i tidskriften Frontiers in cellulär neurovetenskap2. Dess reproduktion instämmer gränser'politik på författarna' copyright retention. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Fluorescerande i situ hybridisering (FISH) bekräftelse av genomisk införandet av den TetO-DN-CB-myc6-Rb1 transgenens. En pCS2-CBRb (digoxigenin sond/anti-DIG-HRP/tyramide-biotin/avidinen-Cy5, i rött) testproben var hybridiseras till splenocytes och örat fibroblast cell metafas att se om sonden signalen kunde identifieras eller inte med en kopiering med en Målstorlek för infoga 2,5 KB. Den pCS2-CBRb testa sonden hybridiseras till en kromosom 10 med ljusa, doublet sonden signaler som visade införandet av den TetO-DN-CB-myc6-Rb1 transgenens inom segmentet 10 C 3-D2. RP23 - 267G 24 (Spectrum grön) kontroll sonden hybridiseras till kromosom 10 på bandet 10A1 som väntat och bekräftade att CBRb DNA sevärdheter isatt i kromosom 10. (A) denna panel visar G-bandet metafas. (B) denna panel visar den tyramide signal amplifiering (TSA) fisk bilden från samma metaphasen som visas i panel A. (C), denna panel visar sammansatta bilder av kromosom 10 visar (1) G-bandning, (2) TSA fisk, och (3) TSA fisk med inverterad DAPI banding. Röd = pCS2-CBRb sond; blå = DAPI ränder; grön = RP23 - 267G 24 kontroll sonden. Skalstapeln = 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5 : DN-CBRb transgenens aktivering i innerörat av postnatal (P) 36 TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA+ (CBRb+) och ROSA-CAG-rtTA+ (CBRb−) möss efter 3 (grupp 1), 7 (grupp 2) och 10 (grupp 3) dagarna av Dox behandling. (A-C) Anti-RB1, som reagerar med både hyperphosphorylated och hypophosphorylated former av RB1, som väl som anti-c-myc antikroppar användes för detektion. Densitometrisk analys utfördes med ImageJ programvara. Motsvarande värden erhålls var normaliserade till den negativa kontrollen CBRb− (-) och sedan till β-aktin. De relativa RB1-uttrycksnivåerna visas under varje blot. (D) Den grafiska framställningen av normaliserade RB1 uttryck nivåer plottas mot olika behandlingar höjdpunkter en genomgående lägre RB1 upptäckt i CBRb+ (+) prover. Varje körfält på western blot gel och varje kolumn på bilden motsvarar en annan person. P < 0.05.This figur publicerades ursprungligen i tidskriften Frontiers in cellulär neurovetenskap2. Dess reproduktion instämmer gränser'politik på författarna' copyright retention. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : Rumsliga analyser av TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA transgenens aktivering i P18 TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA+ (+) och DN-CBRb+/ROSA-CAG-rtTA− negativ kontroll (-) möss hjärtat, ögonen, lungorna och snäckan. (A) ett uttryck för den endogena RB1 bekräftar effektiviteten i Dox-medierad transgenens aktivering, och var nedreglerade i CBRb+/ROSA-CAG-rtTA+ vävnader men inte i negativ kontroll möss vävnader. Densitometrisk analysen utfördes som beskrivs i figur 5. De relativa RB1-uttrycksnivåerna visas under varje blot. (B) i denna panel visas en grafisk framställning av normaliserade RB1 uttryck nivåer plottas mot olika vävnader. En interindividuell variation på endogena RB1 nivåer kan förklara skillnader i individuella Svaren till transgenens aktivering och RB1 nedreglering. (C) RT-PCR-analyser i ögat, hjärtat, och cochleae visade en signifikant uppreglering av TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA avskriften i Dox-behandlade TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA+ vävnader, men inte i den DN-CBRb+/ROSA-CAG-rtTA− negativ kontrollgrupp. CBRb+/rtTA+ = TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA+; CBRb−/rtTA+ = ROSA-CAG-rtTA+; P < 0,05. Denna siffra publicerades ursprungligen i tidskriften Frontiers in cellulär neurovetenskap2. Dess reproduktion instämmer gränser'politik på författarna' copyright retention. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: PCR skick används för att kontrollera den CB-Rb1 fusion regionen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För att kringgå de begränsningar som är associerade med traditionella transgena strategier, försökte vi generera en musmodell där en endogen POI villkorligt kan inaktiveras genom överuttryck en DN muterade formen av det på en spatiotemporal sätt. För att avskaffa funktionen av endogena intressepunkter, har flera alternativ varit föreslagna15,16,17. Vi har ändrat en tidigare genetiska strategi1 genom att kombinera Dox-beroende transkriptionell systemet till en enkel strategi som sysselsätter en fusion av lysosomala proteas CB att generera en mutant peptid vars uttryck påverkar uttrycket av den endogena POI-2. Viktigast av allt, kräver denna teknik inga förkunskaper av associerade med POI-vägen. Den nuvarande strategin att DN protein hämning visar att lysosomala lokalisering signalen på genen CBRb fusion avleder hela RB-interagera komplexet mot Lysosomen2,3. En gång inuti lysosomen, proteolytiska bearbetning av dessa proteiner initieras, vilket leder till deras nedbrytning3. Den inneboende egenskapen hos proteinet CB-smält, förknippas med den vändbara inducibility av TetO systemet, gör detta ett användbart alternativ till traditionella transgena strategier (t.ex. komplett gen knockout, villkorlig radering), särskilt när det fullständigt borttagande av genen av intresse är inte önskvärt.
Vi fokuserade initialt forskningen på proteinet RB1. DN mutationer är lättast beskrivs i proteiner som fungerar som en dimer eller multimers. Hittills finns det inga bevis på en direkt fysisk interaktion mellan RB1 molekyler. Dock tillåter inneboende arten av sin verksamhet för förekomst av flera RB1 molekyler i samma komplex vid en given tidpunkt. Till exempel bindningen av hypophosphorylated RB1 till den E2F1-DP heterodimer ger en ytterligare bindningsställe, som normalt är ockuperat av Histon histondeacetylas (HDAC)18,19,20. Å andra HDAC1 interagerar fysiskt med RB1 och detta komplex i sin tur binder till den E2F1-DP-RB1 heterotrimer, vilket ger ytterligare transkription förtryck18. Enligt detta synsätt, om minst en av RB1 molekylerna i gruppen är en DN mutant, hindrar det komplex från förtränga transkription, medan det minskar nivåerna av endogena RB1, därmed framkalla en RB1-null fenotyp. Här, observerades hämning av endogena RB1 10 dagar efter administrering av Dox i dricksvatten. Den optimala dosen för Dox induktion, dock behöva bestämmas empiriskt för varje system. Dessutom, eftersom de flesta av Rb1 gensekvensen användes på den konstruera makeupen, det är möjligt att även i avsaknad av endogena RB1, muterat RB1 kan interagera med och framkalla DN hämning av någon av de RB1 bindande partner. Denna premiss kan testas genom bedömningen uttryck av kända RB1-bindande molekyler.
Välbehövliga, fint reglerad tidsmässiga och reversibel protein inaktivering kommer att ligga till grund för utvecklingen av ett brett utbud av studier på ett ännu större antal forskningsområden som söker för att belysa komplexa biokemiska mekanismerna bakom de olika aspekterna av gen- och proteinactivity. Beroende på POI, förstå dess molekylära komplexitet är sannolikt att förbättra forskarnas förmåga att designa framgångsrika behandlingsstrategier. Ökad transgenens specificitet kan uppnås genom avel musen för DN att vävnadsspecifika initiativtagare köra antingen tTA eller rtTA linjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Den pCS2 + CB-Myc6 vector var en gåva från Marshall Horwitz (University of Washington, Seattle, WA, USA). HEI-OC1 cellerna var vänligen tillhandahållen av Fedrico Kalinec (David Geffen School of Medicine, UCLA, Los Angeles, CA, USA). Tekniskt stöd tillhandahölls av UNMC mus genomet Engineering kärnan (C.B. Carstens, Don Harms, Rolen Quadros) och Creighton University integrerad biomedicinsk Imaging anläggningen (Richard Hallworth, John Billheimer). I UNMC mus genomet Engineering stöddes av en institutionell utveckling Award (IDea) från NIH/NIGMS, bevilja nummer P20 GM103471. Integrerad biomedicinsk Imaging anläggningen stöddes av den Creighton University School of Medicine och bidrag GM103427 och GM110768 från den NIH/NIGMS. Anläggningen byggdes med stöd från bidrag från nationellt centrum för forskningsresurser (RR016469) och NIGMS (GM103427). Mus raderna genereras i denna studie kvarstod vid Creighton University's Animal resurs anläggning, vars infrastruktur förbättrades genom ett bidrag av NIH/NCRR G20RR024001. Detta arbete fick förbi stöd genom en NIH/NCRR 5P20RR018788 - NIH/NIGMS 8P20GM103471 COBRE bevilja (Shelley D. Smith), NIH/ORIP R21OD019745-01A1 (S.M.R.-S.) och en framväxande forskningsanslag från stiftelsen förhandlingen hälsa (till S. Tarang). Innehållet i denna forskning är enbart ansvar av författarna och representerar inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter av National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM | GIBCO-BRL | 11965-084 | |
| Minimum Essential Medium Eagle, MEME | Sigma | M8042 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442 | |
| Lipofectamine | DharmaFECT | T-2010-03 | |
| Sal I | Roche | 11745622 | |
| EcoRV-HF | New England BioLabs | R3195S | |
| NotI | Roche | 13090730 | |
| CaspaTag | Millipore | APT523 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Staurosporine | Sigma | S4400 | |
| CyQuant NF cell proliferation kit | Invitrogen | C35007 | |
| Retinoblastoma 1 antibody | Abcam | Ab6075 | |
| c-Myc antibody | Sigma | M5546 | |
| b-actin | Sigma | A5316 | |
| Ki-67 | Thermofisher scientific | MA5-14520 | |
| Phallodin | Thermofisher scientific | A12379 | |
| Fluorescence microplate reader | FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech | ||
| Epifluorescence microscope | NikonEclipse80i | ||
| The TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) mouse line is available from the Jackson Laboratory as JAX#032011. |
References
- Li, F. Q., et al. Preferential MyoD homodimer formation demonstrated by a general method of dominant negative mutation employing fusion with a lysosomal protease. Journal of Cell Biology. 135 (4), 1043-1057 (1996).
- Tarang, S., et al. Generation of a retinoblastoma (rb)1-inducible dominant-negative (DN) mouse model. Frontiers Cellular Neuroscience. 9 (52), (2015).
- Kominami, E., et al. The selective role of cathepsins B and D in the lysosomal degradation of endogenous and exogenous proteins. FEBS Letters. 287 (1-2), 189-192 (1991).
- Cortellino, S., et al. Defective ciliogenesis, embryonic lethality and severe impairment of the sonic hedgehog pathway caused by inactivation of the mouse complex A intraflagellar transport gene Ift122/Wdr10, partially overlapping with the DNA repair gene Med1/Mbd4. Developmental Biology. 325 (1), 225-237 (2009).
- Ferreira, C., et al. Early embryonic lethality of H ferritin gene deletion in mice. Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3021-3024 (2000).
- Lee, E. Y., et al. Mice deficient for rb are nonviable and show defects in neurogenesis and haematopoiesis. Nature. 359 (6393), 288-294 (1992).
- Turlo, K. A., et al. When cre-mediated recombination in mice does not result in protein loss. Genetics. 186 (3), 959-967 (2010).
- Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).
- Zhang, J., et al. The first knockout mouse model of retinoblastoma. Cell Cycle. 3 (7), 952-959 (2004).
- Zhao, H., et al. Deletions of retinoblastoma 1 (Rb1) and its repressing target S phase kinase-associated protein 2 (Skp2) are synthetic lethal in mouse embryogenesis. Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10201-10209 (2016).
- Yamasaki, L., et al. Loss of E2F-1 reduces tumorigenesis and extends the lifespan of Rb1(+/-) mice. Nature Genetics. 18 (4), 360-364 (1998).
- Li, F. Q., et al. Selection of a dominant negative retinoblastoma protein (RB) inhibiting satellite myoblast differentiation implies an indirect interaction between MyoD and RB. Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5129-5139 (2000).
- Pitkanen, K., et al. Expression of the human retinoblastoma gene product in mouse fibroblasts: Effects on cell proliferation and susceptibility to transformation. Experimental Cell Research. 207 (1), 99-106 (1993).
- Chano, T., et al. Neuromuscular abundance of RB1CC1 contributes to the non-proliferating enlarged cell phenotype through both RB1 maintenance and TSC1 degradation. International Journal of Molecular Medicine. 18 (3), 425-432 (2006).
- Kole, R., et al. RNA therapeutics: Beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (2), 125-140 (2012).
- Yamamoto, A., et al. The ons and offs of inducible transgenic technology: A review. Neurobiology of Disease. 8 (6), 923-932 (2001).
- Houdebine, L. M., et al. Transgenic animal models in biomedical research. Methods in Molecular Biology. 360, 163-202 (2007).
- Brehm, A., et al. Retinoblastoma protein recruits histone deacetylase to repress transcription. Nature. 391 (6667), 597-601 (1998).
- Lu, Z., et al. E2F-HDAC complexes negatively regulate the tumor suppressor gene ARHI in breast cancer. Oncogene. 25 (2), 230-239 (2006).
- Magnaghi-Jaulin, L., et al. Retinoblastoma protein represses transcription by recruiting a histone deacetylase. Nature. 391 (6667), 601-605 (1998).
