Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo para desenvolver um sistema inducible negativo dominante, em que qualquer proteína pode ser condicionalmente inativada pela superexpressão reversivelmente uma versão mutante dominante negativo dele.
Abstract
Inibição de proteína dominante negativo (DN) é um método poderoso para manipular a função da proteína e oferece diversas vantagens sobre outras abordagens de genoma. Por exemplo, embora quimérico e Cre-LoxP alvos estratégias têm sido amplamente utilizadas, as limitações intrínsecas destas estratégias (ou seja, atividade de promotor gotejante, expressão Cre de mosaico, etc) têm significativamente restringido sua aplicação. Além disso, uma eliminação completa de muitos genes endógenos é embryonically letal, tornando impossível para estudar a função dos genes na vida pós-natal. Para enfrentar estes desafios, temos fez mudanças significativas para um protocolo de engenharia genética precoce e uma versão curta (transgênica) do gene Rb1 aliada a uma protease lisossômica procathepsin B (CB), para gerar um modelo de mouse DN de Rb1 (CBRb). Devido à presença de uma protease lisossômica, a proteína de fusão CB-RB1 inteira e seu complexo de interação são roteadas para degradação mediada por Proteassoma. Além disso, a presença de um elemento de indutor (rtTA) tetraciclina na construção transgênica permite um regulamento inducible e reversível da proteína RB1. A presença de um promotor de ROSA-CAG onipresente no modelo do rato de CBRb torna uma ferramenta útil para realizar ablação de gene Rb1 transitória e reversível e fornecer um recurso de pesquisadores para a compreensão de sua atividade em praticamente qualquer tipo de célula onde RB1 é expresso.
Introduction
A maioria das abordagens visando os gene e proteína ablações dependem de processos de permanentes, que geralmente levam à eliminação completa ou truncamento do gene, sequências de RNA ou proteína de interesse (POI). O objetivo geral deste método é engenheiro uma proteína recombinante para suprimir a função da proteína endógena, selvagem-tipo. Nós temos revisitado e renovada uma estratégia alternativa1,2, que permite a ablação temporária de um POI através da inibição de DN. Esse método funciona para ambos multiméricas e peptídeos monoméricos, mas é o mais adequado para as proteínas que funcionam em um assembly multiméricas.
O método consiste em fundir a protease lisossômica CB para uma subunidade de uma multiméricas POI (fusão de CB complexo). A fusão de CB resultante complexa pode interagir com e proteoliticamente digerir a proteína endógena ou desviar todo o complexo para o lisossoma para ser degradada3CB-POI. Além disso, uma combinação da fusão CB complexa com a natureza inducible do sistema controlado por tetraciclina ativação transcricional (TetO) permite uma expressão inducible e controlada do transgene em uma moda reversível2. Embora útil em muitas circunstâncias, a completa eliminação de genes ou proteínas in vivo pode resultar em letalidade4,5,6. Da mesma forma, exclusão condicional, tecido-específica de alguns genes ou proteínas utilizando o sistema Cre/Lox pode não ser simples, como, em última análise, conduzirá à perda permanente de elementos críticos de genômica7. Portanto, dependendo do gene ou POI, nenhuma dessas abordagens será eficaz em fornecer um modelo útil para estudos posteriores, particularmente dos genes ou dos proteínas estudos funcionais em camundongos adultos e pós-natal atrasados.
Para contornar os problemas associados com tais abordagens e fornecer prova de princípio sobre a eficácia do método proposto, decidimos testar o método apresentado aqui, gerando uma versão DN condicional da proteína do Retinoblastoma 1 (RB1). Várias opções foram propostos8,9,10 para abolir a função de RB1 endógena; no entanto, todos eles enfrentaram algumas das mesmas limitações discutidas acima: exclusão permanente germline de RB1 é embryonically letal, e, coerente com seu papel de supressor de tumor, permanente exclusão condicional RB1 leva a uma variedade de tumores11. Apesar de uma versão do DN de RB1 não parece ocorrer naturalmente, uma alternativa melhor para as estratégias atualmente disponíveis deve permitir uma inativação temporalmente controlada do RB1 endógena e fornecem um mecanismo alternativo para eventualmente restaurar sua função. A base para tal uma construção foi descrita há mais de duas décadas atrás1. No entanto, devido às limitações tecnológicas, faltava-lhe um mecanismo de controle do transgene ativação de resposta e especificidade de tecido. Este estudo é o primeiro a combinar a elegância de doxiciclina (Dox)-sistema transcriptional dependente com uma engenharia construção transgênica de protease lisossômica CB e Rb1 proteínas. O modelo resultante do rato CBRb permite um temporariamente regulamentado RB1 mediada por Dox regra2. A vantagem de usar uma abordagem baseada em proteoma para estudar a função dos genes é que pode ser adotado para qualquer gene de interesse, com informações mínimas sobre a sua actividade.
A estratégia proposta do transgene DN oferece muitas vantagens sobre as abordagens tradicionais. Primeiro, inibição da proteína de DN leva a apenas uma ablação parcial na atividade da proteína, preservando assim uma expressão residual endógena. Esse resultado é altamente desejável em situações onde uma eliminação completa da atividade da proteína leva a letalidade embrionária, limitando grandemente qualquer investigação para estudar a função do gene em um rato vivo. Em segundo lugar, a presença do sistema de TetO permite ativação do transgene apenas na presença de um antibiótico, o que permite um controle eficiente e reversível da atividade do transgene. Assim, por cessar a administração de antibióticos, o sistema transgênico pode ser desativado, e uma expressão normal de RB1 está de volta em casa. Em terceiro lugar, a especificidade da expressão do transgene pode variar dependendo do promotor da escolha. Enquanto nós escolhemos o promotor ROSA-CAG onipresente para prova de princípio, colocar o transgene sob um promotor de tecido-específica é susceptível de restringir a expressão do transgene indesejados e facilitar estudos sobre a aplicação terapêutica deste transgene metodologia.
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Protocol
Geração de transgênicos CBRb mouse e todos os cuidados com animais e experiências associadas com o estudo foram aprovadas pelos cuidados institucionais do Animal de Creighton University e uso Comité (IACUC) e realizado por suas orientações.
1. transgênicos CB-Myc6-construção de Rb1
Nota: A clonagem em um vetor de pTet_Splice de CBRb foi feita em um processo de várias etapa (figura 1A e 1B).
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Realize a clonagem do primeiro estágio, no pCS2 + CB-Myc6 vector.
- Para criar a construção CBRb do transgene, amplificar um fragmento de cDNA de Rb1 1583-bp-long (528 aminoácidos correspondente à região de aminoácido 369-896) da proteína RB1 usando o primer seguinte conjunto: para EcoRI +RB 1243F, use GGGGAATTCA TTAAATTCAGCAAGTGATCAACCTTCe XbaI + EcoRV +RB 2826R, use CCCTCTAGATATCTATTTGGACTCTCCTGGGAGATGTTTACTTCC.
- Clone o fragmento gerado (1546 bp) entre os locais de restrição EcoR1 e XbaI do pCS2 + CB-Myc6 vetor, como descrito anteriormente,1,12.
Nota: A construção de CB-Myc6 de 1012-bp-long (337 aminoácidos) fundida-se para o fragmento de Rb1 resultou em uma proteína de cerca de 865 aminoácidos (cerca de 108 kDa), que é ligeiramente menor do que a proteína endógena do RB1 (~ 110 kDa) (Figura 1 Um), com um tag de6 CB-Myc no N-terminal e Rb1 no C-terminal.
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Realize a segunda fase subcloning no vetor pTet-Splice.
- Para amplificar o fragmento de fusão CB-RB-Myc6 e ganhar o Tet-promotor, amplificar a fita, consistindo o CB-myc6-Rb1 usando cartilhas contendo o EcoRV (XbaI + EcoRV + RB 2826R) e sites de SalI : para SalI +CBF, Use o CCAGTCGACAGGATGTGGTGGTCCTTGATCCTTC.
- Subclone o fragmento gerado (2567 bp) para o vetor pTet-Splice, entre os locais de restrição SalI e EcoRV , de tal forma que sinalizam o transgene TetO-DN-CB-myc6-Rb1 inteiro, incluindo o intrão SV40 e a PolyA, podem ser isolados através de uma simples digestão com NotI (Figura 1B).
Nota: O fragmento NotI foi usado para gerar os financiadores de transgénicos.
2. em Vitro testes do Transgene TetO-DN-CB-myc6-Rb1
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Dox-Regulamento: Linha de celular NIH3T3
Nota: Salvo indicação contrária, todos os volumes foram ajustados para uma placa de 6.- Desenvolvem-se células NIH3T3 seguindo as especificações do fornecedor, utilizando o meio de cultura celular recomendado contendo 10% de soro bovino fetal a 37 ° C, com 10% de CO2.
- Cotransfect as células com pTet-Splice e vetores de pCMV-Tet3G (da etapa 1) por 24 h. sigam os passos abaixo mencionados para cotransfection.
- Misture 2 – 4 µ l do reagente baseado em lipídios transfeccao/poço e 1 mL de incompleta (sem o soro) Dulbecco modificado águia médio (DMEM) por 5 min à temperatura ambiente. Por um prato de 24 ou 12 --bem, use 250 ou 500 µ l de meios de cultura, respectivamente e ajustar o volume de reagente de Transfeccao de acordo.
- Adicionar 2-3 µ g de Plasmideo DNA/bem para o reagente de transfeccao-DMEM e incubar durante 20 min à temperatura ambiente.
- Adicione a mistura que contém DNA e o reagente de transfeccao em DMEM a cada poço. Após 3-4 h de incubação, adicione 1 mL de mídia completa (de modo que o volume final é 2 mL/poço). Manter as alíquotas de estoque Dox (1 mg/mL) e adicionar 2 µ l em cada um dos poços (+ Dox). Incube a 37 ° C com 5% CO2células.
Nota: Amostras de controlo devem consistir de cotransfected células não tratadas com Dox (-Dox), bem como NIH3T3 células transfectadas apenas com o vetor de pCMV-Tet3G liberada e tratadocom com Dox, por um período de 24h. Para pCMV-Tet3G, as concentrações de 0,1 a 1 µ g/mL Dox deve ser suficiente para induzir a expressão do transgene.
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Teste a reversibilidade da construção usando a linha de células HEK293.
- Para testar a reversibilidade do transgene TetO-DN-CB-myc6-Rb1 , células de cultura HEK293 do águia mínimo essencial médio (EMEM) seguindo as especificações do fornecedor e cotransfect com vetores tanto pTet-Splice e pCMV-Tet3G para 24h, conforme descrito acima (passo 2.1.2).
- Para a inactivação de transgene, remova a mídia contendo Dox após 24 h, lavar a células 2 x-3 x com solução salina tamponada fosfato (PBS) e incube-os em media Dox-free para um adicional 24h.
Nota: Em cima da Dox-remoção, o transgene inactivação e expressão da proteína regular devem ser retomados nesse prazo de 24 h.
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Para avaliar a funcionalidade da construção de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 em promover a proliferação celular não-programada, realize as análises funcionais usando uma linha de celular HEI-OC1, conforme descrito abaixo.
- Células de cultura HEI-OC1 em 10% DMEM sob permissiva condições (33 ° C com 10% CO2). Para estudos de proliferação celular, conte as células usando um contador de célula e placa 10.000 HEI-OC1 células numa placa de 96 poços em um volume de 200 µ l. Incube as células durante a noite.
- No dia seguinte, realizar uma cotransfection transitória de vetores pTet-Splice e pCMV-Tet3G, usando um reagente de transfeccao baseada em lipídios (ver passos 2.1.2). Em um poço separado, execute pmR-ZsGreen1 do transfection at2-µ g usando o reagente de transfeccao baseada em lipídios (etapas 2.1.2) para calcular a taxa de transfecção. Use células não transfectadas como controles.
- Detectar a presença de fluorescência verde sob um microscópio de fluorescência (excitação = 485 nm, emissão = 530 nm) para o transfectadas pilhas 24h depois do transfection. Registar a presença ou ausência de fluorescência verde e calcular a taxa de transfecção como o número total de células GFP-positivo (células transfectadas) sobre as células rotuladas com DAPI (células totais).
Nota: Estimamos uma taxa de transfecção de ~ 70%. - Para induzir a expressão do transgene, adicionar 1 µ g/mL Dox para um subconjunto de células transfectadas enquanto estiver usando o outro subconjunto como controle (-Dox). Use células de IES-OC1 não tratadas como controles adicionais.
- Para avaliar a proliferação celular, use um kit de proliferação de células de acordo com o protocolo do fabricante.
- Em breve, 48 h após a transfeccao, remover o meio de cultura celular e adicionar 100 µ l de solução corante-vinculação de 1x a cada poço do microplate. Incubar durante 1 h a 37 ° C.
- Depois disso, medir a intensidade de fluorescência de cada amostra, usando um leitor de microplacas de fluorescência (excitação = 485 nm, emissão = 530 nm).
- Para avaliar usando imunocitoquímica de proliferação celular, células de IES-OC1 em um vidro de tampa em uma placa de 12 da placa e incubar durante uma noite a 37 ° C.
- No dia seguinte, cotransfect com a tala pTet e pCMV-Tet3G e realizar o tratamento de Dox (+ Dox). Use células untransfected como controles. Processo HEI-OC1 células para a rotulagem de Ki-67.
- Fixe as células com paraformaldeído 4% (PFA) em PBS, pH 7,4, durante 10 minutos à temperatura ambiente. Lavar as células 3 x com PBS gelado e incube as celulas em 0,25% de detergente não-iônico em PBS por 10 min.
- Lavar as células novamente, 3 x em PBS por 5 min e bloco usando 10% de soro em uma câmara umidificada por 1h à temperatura ambiente.
- Incube as celulas em 500 µ l do anticorpo primário do Ki-67 (diluição de 1: 200) para 3h em temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C.
- Lavar as células 3 x por 5 min com PBS. Depois disso, Incube as celulas com o anticorpo secundário por 1h à temperatura ambiente no escuro.
- Remover a solução de anticorpo secundário e lavar as células 3 x com PBS por 5 min no escuro.
- Para a rotulagem faloidina, Incube as celulas de IES-OC1 em 1: 200 faloidina por 30 min. Para rotular os núcleos das células, Incube as celulas com 5 µ g/mL DAPI durante 10 minutos à temperatura ambiente.
Nota: Certifique-se de que o conjugado de tintura faloidina é diferente do que o conjugado anticorpo secundário.
3. geração de /ROSA-CAG-rtTA de CBRb++ (CBRb) ratos transgênicos e em testes de Vivo da abordagem DN-CBRb
- Após a confirmação do Regulamento Dox eficaz do transgene TetO-DN-CB-myc6-Rb1 , purificar o fragmento NotI e microinjeção-los em zigotos de rato, que depois são transferidos para as fêmeas grávidas pseudo.
Nota: Esses procedimentos foram realizados na Universidade de Nebraska Medical Center (UNMC) Mouse genoma engenharia Core instalação. - Após o parto, os filhotes usando um primer conjunto específicos para a região de fusão do CB-Rb1 de genótipo: para F CBRb, use CTGTGGCATTGAATCAGAAATTGTGGCTGG 3 ' 5' e para CBRB R, use 5 ' GTACTTCTGCTATATGTGGCCATTACAACC 3 '.
Nota: Tamanho do produto do PCR observado em gel de agarose é 401 bp (região de CB 60-bp + 341-bp Rb1 região (tabela 1). Foram identificadas dez linhas de fundador independente, baseado na presença do transgene TetO-DN-CB-myc6-Rb1 . Em cinco destas linhas, descendência herdou o transgene, que confirmou a transmissão do germline do transgene. Uma das linhas transgénicas, finalmente, foi usada para estabelecer e manter a linha e gerar animais experimentais de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 para estudos adicionais. - Reproduzem os ratos adultos TetO-DN-CB-myc6-Rb1 à linha ROSA-CAG-rtTA tetraciclina indutor (Stock #006965) (Alternativamente, raça para uma linha de indutor de tTA) para gerar experimental DN-CBRb ratos. Genótipo a prole desta cruz usando o seguinte conjunto de primeira demão: para rtTA-WT R, use GGAGCGGGAGAAATGGATATG; para rtTA mutante R, use GCGAGGAGTTTGTCCTCAACC; e para rtTA comum, use AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT. Os tamanhos do produto PCR são 340 bp (mutante), 340 bp e 650 bp (heterozigoto) e 650 bp (tipo selvagem).
- Gere uma curva de dose-resposta da proteína RB1 Dox no tratamento para determinar a hora e a duração do tratamento necessária para eliciar uma expressão do transgene Dox.
Nota: Neste experimento, borrão ocidental e qRT-PCR foram utilizados para avaliar o tecido-específica do transgene ativação e expressão de RB1. - Execute a fluorescência em situ da hibridação (peixe) para confirmar a inserção genômica do transgene.
Nota: Isto foi realizado no centro de genômica aplicada do Hospital para crianças doentes (Toronto, Canadá). ELISA ou mancha ocidental (usando anticorpos específicos de proteínas) pode ser usado para avaliar a ativação do transgene, tecido-especificidade e alterações nos níveis do POI endógeno. Para a construção de DN-CB-myc6-Rb1 , foi utilizado um anticorpo anti-RB1.
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Representative Results
Geralmente, a concepção de uma mutação de DN exige uma quantidade considerável de informações sobre a estrutura e função do POI. Em contraste, a estratégia de DN apresentada aqui é particularmente útil quando as informações estruturais e funcionais para o POI são limitadas. Se o POI é uma proteína multiméricas, uma fusão de uma subunidade de uma protease lisossômica dominante pode inibir o multimer montado e, potencialmente, outros ligantes através de uma combinação de proteólise das subunidades endógenas e subcellular desvio do multimer para a lisossoma. Para confirmar a clonagem bem sucedida e testar a eficácia de ativação Dox-regulada do transgene, purificada pTet-Splice plasmídeo contendo o TetO-DN-CB-myc6-Rb1 construção foi transfectada em células de rato NIH3T3 que expressa estàvel o rtTA proteína, mas não de Rb113. Na ausência de Dox, células expressando rtTA exibido sem expressão RB1, Considerando que uma expressão de RB1 robusto foi observada na presença de Dox(Figura 2). Em seguida, para testar a reversibilidade do sistema, nós cotransfected as células HEK293 (que endogenamente expressam Rb114) com purificada pTet-Splice /TetO-DN-CB-myc6-Rb1 e os vetores de pCMV-Tet3G. Como esperado, a expressão da proteína endógena RB1 foi significativamente inibida na ativação do transgene pela adição de Dox nos meios de cultura de células (Figura 2B). Para testar a reversibilidade do sistema, após um período de 24 h, em um subconjunto de células HEK293, substituímos os meios de cultura de células contendo Dox com mídia livre de Dox fresca e incubadas as células para um adicional h 24. apoiar a reversibilidade Dox-regulado, RB1 expressão foi restaurada após a remoção de Dox dos meios de cultura (Figura 2B). Transfectadas células HEK293 que não foram tratadas com Dox ou células HEK293 Dox-tratados transfectadas com o pCMV-Tet3G vetor apenas (Figura 2B) mostrou níveis basais de expressão endógena de RB1. Porque NIH3T3 células não expressam a proteína RB1 naturalmente, a reatividade de RB1 positiva é devido ao acúmulo da proteína RB1 transgénico. Dado o nosso interesse no potencial efeito proliferativo da construção de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 no sistema auditivo, medimos o conteúdo total de DNA em pTet-Splice /TetO-DN-CB-myc6-Rb1- e HEI-OC1 pCMV-Tet3G-transfectadas células ( órgão do ouvido interno de uma linhagem de células de Corti-derivado) na presença e na ausência de Dox. Consistente com a hipótese de trabalho aqui apresentado, um aumento significativo do conteúdo de DNA (correspondendo a um aumento no número de células) foi observado em Dox-tratados mas não não tratada (controle) transfectadas HEI-OC1 células (Figura 3A - 3 C ).
Após a confirmação in vitro da atividade do transgene e função, foi gerado um modelo do rato transgénico. PEIXE, usando uma TetO-DN-CB-myc6-Rb1 Digoxigenina (DIG)-peroxidase de rabanete de cavalo (HRP) / sonda tiramina-biotina/avidina-Cy5-rotulados e G-borda de fibroblastos splenocytes e orelha de camundongos machos foram realizados para confirmar a inserção do transgene na genoma de ratos transgênicos. Entre os cinco fundadores de transmissão da linha germinal, inserção de linha 14 mostrou um transgene consistente dentro do segmento 10C 3 ~ D2 (Figura 4A - 4C). Os ratos desta linha foram usados para estabelecer as colónias de reprodução e gerar animais experimentais para estudos adicionais. Para determinar o tempo ideal para a indução de Dox e TetO-DN-CB-myc6-Rb1 transgene ativação, dividimos os ratos transgénicos em três grupos diferentes, no qual Dox foi administrado na água potável para comprimentos variáveis de tempo: grupo 1 (3 dias de tratamento), grupo 2 (7 dias de tratamento) e grupo 3 (10 dias de tratamento). Após a conclusão do tratamento, mudanças na expressão da proteína RB1 foram avaliadas pela mancha ocidental (Figura 5A - 5D). Porque o DN e o nativo RB1 proteínas têm peso moleculares similares, eles não podem ser resolvidos do outro em um western blot. No entanto, consistente com um aumento inicial na proteína RB1 (devido ao acúmulo de proteínas endógenas e DN-RB1), houve um aumento inicial na expressão de proteína RB1 total nos cochleae rato geneticamente modificado em relação ao grupo controle (Figura 5 A). Além disso, consistente com a atividade inibitória e proteolítica do produto TetO-DN-CB-myc6-Rb1 transgene, uma redução quantificável em RB1 expressão foi observada nos grupos 2 e 3 em relação ao grupo controle e 1 grupos ( Figura 5A - 5D). Digno de nota, mais de 10 dias de tratamento não resultou em qualquer alteração adicional na expressão de proteínas de RB1. Assim, 10 dias de tratamento Dox foi considerado ideal e utilizados para seus estudos.
Porque o rtTA e, consequentemente, a ativação do transgene TetO-DN-CB-myc6-Rb1 estão sob o promotor ROSA-CAG onipresente, RB1 poderia ser potencialmente inibida em qualquer tecido ou célula onde RB1is endogenamente expresso (por exemplo, pulmões, coração, retina). Para testar esta premissa e avaliar a especificidade do tecido do transgene, cochleae, pulmões, coração e biópsias de olho foram dissecadas de TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA, e controle de ratos (não carregando o transgene ROSA-CAG-rtTA ) foram avaliado por RB1 expressão (figura 6A - 6C). Independentemente do tecido analisado, observou-se uma redução significativa na proteína RB1 em TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA , mas não no grupo controle (Figura 6A). Em contraste, qRT-PCR analisa nos olhos, coração e cochleae de Dox-tratados TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA e ratos controle correspondência idade mostrou uma significativa upregulation da transcrição DN-CBRb nos tecidos do antigo, mas não o Este último ratos (Figura 6C). No total, estes resultados confirmam a eficiência da construção. Um aumento na expressão de transcrição reflete a indução efetiva do transgene Dox-regulado. Da mesma forma, uma redução na expressão da proteína é consistente com a degradação proteolítica e roteamento do RB1 endógena.
Figura 1: multi-step clonagem da geração do inducible e CBRb TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA. (A) este painel mostra a clonagem do fragmento Rb1 no vetor pCS2-CB-Myc6 . Um produto de gene Rb1 1583-bp foi amplificado usando a EcoRI + RB1243 para a frente e a RB2826 + Xba + EcoRV reversos primers PCR. O fragmento de Rb1 resultante foi clonado entre os locais de restrição EcoRI e Xbal do vetor pCS2 contendo o construção de CB-Myc6 para gerar o vetor pCS2 + CB-myc6 + Rb1 . (B) o CB-myc6 + Rb1 fragmento foi clonado no vetor pTetSplice entre os locais de restrição SalI e EcoRV . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Eficácia da ativação do transgene Dox-regulado. (A) NIH3T3 células geralmente não expressam RB113. Confirmando a ativação eficiente da construção de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 , uma análise ocidental do borrão com o anticorpo anti-RB1 revelou uma expressão de RB1 robusto na presença de Dox (faixas 1 e 3), mas não na sua ausência (faixas 2 e 4). (B) células HEK293, que expressam endogenamente Rb114, foram cotransfected com TetO-DN-CB-myc6-Rb1 e o vetor de liberada pCMV-Tet3G. Na ausência de Dox (faixa 1), observou-se uma expressão de RB1 positivo. A adição de Dox ao sistema causou o TetO-DN-CB-myc6-Rb1 ativação e RB1 downregulation (faixa 2). A expressão de RB1 foi retomada 24 h após Dox foi removido da mídia (faixa 3). C = controle, untransfected HEK293 células não tratadas com Dox. Esta é uma adaptação de uma figura, originalmente publicada na revista fronteiras em neurociência celular2. Sua reprodução concorda com retenção de direitos autorais de fronteiras'política sobre autores'. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : DN-CBRb Dox-mediada do transgene ativação aumenta a proliferação celular. (A) HEI-OC1 células cotransfected com purificada TetO-DN-CB-myc6-Rb1, e os vetores de pCMV-Tet3G foram cultivados na ausência (−) ou presença (+) da Dox. Proliferação celular estava determinada a 48 h após o transfeccao usando um ensaio de proliferação. Proliferação de variação percentual foi calculada usando uma mudança nos valores de fluorescência com células untransfected como um controle. Um aumento modesto, mas significativo número de celular foi observado nas células transfectadas, Dox tratamento a seguir. Em contraste, nenhuma mudança significativa foi observada entre células transfectadas de IES-OC1 Dox não tratada com (−) e o controle untransfected. (B) HEI-OC1 células untransfected ou (C) cotransfected com purificada TetO-DN-CB-myc6-Rb1 e os vetores de pCMV-Tet3G cultivados na presença (+) da Dox foram rotulados com Ki-67 (vermelho), faloidina (verde) e DAPI (azul). P < 0,05. Barra de escala = 10 µm. Esta é uma adaptação de uma figura, originalmente publicada na revista fronteiras em neurociência celular2. Sua reprodução concorda com retenção de direitos autorais de fronteiras'política sobre autores'. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Fluorescente em situ confirmação de hibridação (peixe) da inserção do genoma do transgene TetO-DN-CB-myc6-Rb1 . Um pCS2-CBRb (Digoxigenina sonda/anti-DIG-HRP/tyramide-biotina/avidina-Cy5, em vermelho) teste sonda foi hibridizada splenocytes e orelha fibroblasto célula da metafase para ver se o sinal da sonda pode ser detectado ou não com um tamanho de inserção de cópias de um alvo de 2,5 kb. O pCS2-CBRb teste sonda hibridizada com um cromossoma 10 com sinais de sonda dubleto brilhante, que mostrou a inserção do transgene TetO-DN-CB-myc6-Rb1 dentro do segmento 10 C 3-D2. A sonda de controle RP23 - 267 24 (espectro verde) hibridizado ao cromossoma 10 na banda 10A1 como esperado e confirmado que o DNA de CBRb de interesse inserido no cromossomo 10. (A), este painel mostra banda G metáfase. (B), este painel mostra a imagem de peixe de amplificação (TSA) de sinal tyramide da metáfase mesmo como mostrado no painel A. (C), este painel mostra imagens compostas de cromossoma 10 mostrando (1) G-borda, TSA (2) peixe, e peixes (3) TSA com invertido DAPI de borda. Vermelho = sonda pCS2-CBRb; azul = DAPI de borda; verde = RP23 - 267 24 sonda de controle. Barra de escala = 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : DN-CBRb transgene ativação na orelha interna de pós-natal (P) 36 TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA+ (CBRb+) e ROSA-CAG-rtTA+ (CBRb−) ratos após 3 (grupo 1), 7 (grupo 2) e 10 (grupo 3) dias de Dox tratamento. (-C) Anti-RB1, que reage com ambos hyperphosphorylated e hypophosphorylated formas de RB1, como bem como anti-c-myc anticorpos foram utilizados para a detecção. Densitométricos análise foi feita utilizando o software ImageJ. Os correspondentes valores obtidos foram normalizados para o controle negativo CBRb− (-) e, em seguida, a β-actina. Os níveis de expressão relativos RB1 são mostrados por baixo de cada borrão. (D) A representação gráfica dos níveis de expressão de RB1 normalizados plotada contra a detecção de destaques um RB1 consistentemente inferior de diferentes tratamentos em CBRb+ (+) amostras. Cada raia no borrão ocidental gel e cada coluna do quadro correspondem a um indivíduo diferente. P < 0.05.This figura foi originalmente publicada na revista fronteiras em neurociência celular2. Sua reprodução concorda com retenção de direitos autorais de fronteiras'política sobre autores'. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 : Análises espaciais da ativação TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA transgene em P18 TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA+ (+) e DN-CBRb+ROSA-CAG-rtTA− negativo ratos controle (-) coração, olhos, pulmões e cóclea. (A) confirmando a eficiência da ativação mediada por Dox transgene, a expressão do RB1 endógena foi ativador na CBRb+/ tecidosROSA-CAG-rtTA+ , mas não nos tecidos ratos controle negativo. Densitométricos análise foi realizada conforme descrito na Figura 5. Os níveis de expressão relativos RB1 são mostrados por baixo de cada borrão. (B) este painel mostra uma representação gráfica dos níveis de expressão de RB1 normalizados plotados contra os diferentes tecidos. Uma variação interindividual em níveis endógenos de RB1 pode explicar as diferenças nas respostas individuais para a ativação do transgene e RB1 downregulation. (C) RT-PCR analisa no olho, coração, e cochleae revelou uma significativa upregulation da transcrição TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA em tecidos tratados com Dox TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA+ , mas não no DN-CBRb+ROSA-CAG-rtTA− negativo grupo controle. /RtTA CBRb++ = TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA+; CBRb−/rtTA+ = ROSA-CAG-rtTA+; P < 0,05. Esta figura foi originalmente publicada na revista fronteiras em neurociência celular2. Sua reprodução concorda com retenção de direitos autorais de fronteiras'política sobre autores'. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: condição PCR utilizada para controlar o CB-Rb1 região de fusão.
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Discussion
Para contornar as limitações associadas com as estratégias tradicionais de transgénicas, procuramos gerar um modelo de mouse em que um POI endógena pode ser condicionalmente inativado pela superexpressão uma forma mutante de DN do de uma forma spatiotemporal. Suprimir a função de POIs endógenas, várias opções foram propostos15,16,17. Modificamos um anterior estratégia genética1 , combinando o sistema transcriptional Dox-dependente de uma estratégia simples, empregando uma fusão de protease lisossômica CB para gerar um peptídeo mutante cuja expressão afeta a expressão de o POI endógena2. Mais importante ainda, esta técnica não requer nenhum conhecimento prévio do percurso associado com o POI. A atual estratégia de inibição de proteínas DN demonstra que o sinal de localização dos lisossomos sobre o gene de fusão CBRb desvia o inteiro complexo de RB-interagindo em direção a lisossoma2,3. Uma vez dentro do lisossoma proteolítica processamento destas proteínas é iniciado, levando à sua degradação3. A propriedade intrínseca da proteína CB-fundido, associada com o inducibility reversível do sistema de TetO, isso torna uma alternativa útil para estratégias de transgénicas tradicionais (por exemplo, nocaute completo gene, exclusão condicional), particularmente quando a eliminação completa do gene de interesse não é desejável.
Inicialmente focamos a pesquisa sobre a proteína RB1. Mutações de DN são mais facilmente descritas em proteínas que funcionam como um dímero ou mediastino. Até à data, não há provas de uma interação direta e física entre moléculas de RB1. No entanto, a natureza inerente da sua actividade permite a presença de várias moléculas de RB1 no mesmo complexo em um determinado momento. Por exemplo, a ligação do hypophosphorylated RB1 para o E2F1-DP heterodímero fornece um sítio de ligação adicionais, que normalmente é ocupado por histona deacetilase (HDAC)18,19,20. Por outro lado, HDAC1 interage fisicamente com RB1 e este complexo, por sua vez, vincula o heterotrimer E2F1-DP-RB1, assim fornecendo transcrição adicionais repressão18. Acordo com esta abordagem, se pelo menos uma das moléculas RB1 no grupo é um mutante de DN, impedirá o complexo de repressão da transcrição, enquanto reduz os níveis de RB1 endógena, provocando assim um fenótipo de RB1-nulo. Aqui, inibição de RB1 endógena observou-se 10 dias após a administração de Dox em água potável. A dose ideal para indução de Dox pode, no entanto, precisa ser determinado empiricamente para cada sistema. Além disso, desde que a maioria da sequência do gene Rb1 foi usado sobre a maquiagem de construção, é possível que, mesmo na ausência de RB1 endógena, o mutante RB1 pode interagir com e provocam a inibição do DN de qualquer um dos parceiros de ligação do RB1. Esta premissa pode ser testada por avaliar o nível de expressão de moléculas de RB1-ligação conhecidas.
Inactivação muito necessária, finamente regulada temporal e reversível de proteína irá fornecer a base para o desenvolvimento de uma ampla variedade de estudos em um número ainda maior de campos de pesquisa, buscando para lançar luz sobre os complexos mecanismos bioquímicos subjacentes os vários aspectos do gene e proteinactivity. Dependendo do POI, compreender sua complexidade molecular é susceptível de melhorar a capacidade dos pesquisadores para projetar estratégias de sucesso terapêuticas. Transgene maior especificidade pode ser conseguida criando o mouse DN dos promotores tecido-específica ou tTA ou rtTA linhas de condução.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
O pCS2 + CB-Myc6 vector foi um presente do Marshall Horwitz (Universidade de Washington, Seattle, WA, Estados Unidos da América). As células de IES-OC1 foram gentilmente cedidas por Fedrico Kalinec (David Geffen School of Medicine, UCLA, Los Angeles, CA, EUA). Suporte técnico foi fornecido por UNMC Mouse genoma engenharia núcleo (C.B. Itala, Don Harms, Rolen Quadros) e a Creighton University Biomedical Imaging usina integrada (Richard Hallworth, John Billheimer). A engenharia de genoma UNMC Mouse foi apoiado por um prêmio de desenvolvimento institucional (ideia) do NIH/NIGMS, conceda número GM103471 P20. A usina integrada de imagem biomédica foi apoiada pela escola de medicina e doações GM103427 e GM110768 do NIH/NIGMS Universidade Creighton. A instalação foi construída com o apoio de subsídios do centro nacional para recursos de pesquisa (RR016469) e o NIGMS (GM103427). As linhas de rato geradas neste estudo foram mantidas em instalações de recurso Animal da Universidade de Creighton, cuja infra-estrutura foi melhorada através de uma concessão pelo NIH/NCRR G20RR024001. Este trabalho recebido passado apoio através de um NIH/NCRR 5P20RR018788-/ NIH/NIGMS 8P20GM103471 COBRE conceder (a Shelley D. Smith), NIH/ORIP R21OD019745-01A1 (S.M.R.-S.) e uma bolsa de investigação emergentes da Fundação de saúde auditiva (de S. Jorge). O conteúdo desta pesquisa é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do institutos nacionais da saúde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM | GIBCO-BRL | 11965-084 | |
| Minimum Essential Medium Eagle, MEME | Sigma | M8042 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442 | |
| Lipofectamine | DharmaFECT | T-2010-03 | |
| Sal I | Roche | 11745622 | |
| EcoRV-HF | New England BioLabs | R3195S | |
| NotI | Roche | 13090730 | |
| CaspaTag | Millipore | APT523 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Staurosporine | Sigma | S4400 | |
| CyQuant NF cell proliferation kit | Invitrogen | C35007 | |
| Retinoblastoma 1 antibody | Abcam | Ab6075 | |
| c-Myc antibody | Sigma | M5546 | |
| b-actin | Sigma | A5316 | |
| Ki-67 | Thermofisher scientific | MA5-14520 | |
| Phallodin | Thermofisher scientific | A12379 | |
| Fluorescence microplate reader | FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech | ||
| Epifluorescence microscope | NikonEclipse80i | ||
| The TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) mouse line is available from the Jackson Laboratory as JAX#032011. |
References
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