Hier presenteren we een protocol voor de ontwikkeling van een dominant-negatieve afleidbare systeem, waarin elk eiwit kan voorwaardelijk worden geïnactiveerd door omkeerbaar overexpressing een dominant-negatieve mutant versie van het.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Afleidbare en omkeerbare Dominant-negatief (DN) eiwit remming
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Dominant-negatief (DN) eiwit inhibitie is een krachtige methode om te manipuleren eiwitfunctie en biedt diverse voordelen ten opzichte van andere genoom gebaseerde benaderingen. Bijvoorbeeld, hoewel chimeer en Cre-LoxP gerichte strategieën hebben op grote schaal gebruikt, de intrinsieke beperkingen van deze strategieën (dat wil zeggen, lekke promotor activiteit, mozaïek Cre expressie, enz.) zijn aanmerkelijk beperkt hun toepassing. Bovendien is een volledige schrapping van vele endogene genen embryonically dodelijk, waardoor het onmogelijk is om te studeren genfunctie in postnatale leven. Om deze uitdagingen, we hebben aanzienlijke wijzigingen aangebracht in een vroege gentechnologie-protocol en een korte (transgene) versie van het gen Rb1 gecombineerd met een lysosomale protease procathepsin B (CB), voor het genereren van een DN-muismodel van Rb1 (CBRb). Als gevolg van de aanwezigheid van een lysosomale protease, worden het gehele CB-RB1 fusieproteïne en haar interactie complex gerouteerd voor proteasoom-gemedieerde afbraak. Bovendien kan de aanwezigheid van een tetracycline inductor (rtTA)-element in de transgene constructie een afleidbare en omkeerbare regulering van de RB1 proteïne. De aanwezigheid van een alomtegenwoordige ROSA-CAG-promotor in de muismodel CBRb maakt het een nuttig instrument om te verrichten van voorbijgaande aard en omkeerbaar Rb1 gene ablatie en onderzoekers een resource voor het begrijpen van haar activiteiten in vrijwel elk celtype waar RB1 wordt uitgedrukt.
Inleiding
Meeste benaderingen die gericht zijn op de gen- en eiwit ablations is afhankelijk van permanente processen, die over het algemeen tot de volledige uitbanning of afkappen van het gen, RNA opeenvolgingen of proteïne van belang (POI leiden). Het algemene doel van deze methode is om ingenieur een recombinant eiwit te schaffen van de functie van endogene, wild-type eiwit. Wij hebben revisited en vernieuwde een alternatieve strategie1,2, dat voorziet in de tijdelijke ablatie van een POI via DN remming. Deze methode werkt voor zowel multimeric als monomeer peptiden, maar is het meest geschikt voor de eiwitten die in ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Generatie van de transgene CBRb muis en alle dierenverzorgers en experimenten die is gekoppeld aan de studie werden goedgekeurd door de Creighton University dier zorginstellingen en gebruik Comité (IACUC) en uitgevoerd door hun richtlijnen.
1. transgene CB-Myc6-Rb1 Construct
Opmerking: Het klonen van CBRb in een vector pTet_Splice werd gedaan in een proces van meerdere stappen (figuur 1A en 1B).
-
Voeren de eerste fase klonen in de pCS2 + CB-Myc6 vector.
- Maken van de constructie van de transgenic CBRb, e....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In het algemeen, ontwerpen van een mutatie DN vereist een aanzienlijke hoeveelheid informatie over de structuur en functie van het POI. In tegenstelling, is de DN-strategie die hier gepresenteerd vooral handig wanneer de structurele en functionele informatie voor het POI beperkt is. Als het POI een multimeric eiwit is, een fusie van een subeenheid aan een lysosomale protease dominant kan remmen de geassembleerde multimer en mogelijk andere liganden door een combinatie van proteolyse van d.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Wij willen om te omzeilen van de beperkingen die zijn gekoppeld aan de traditionele transgene strategieën, genereren een muismodel waarin een endogene POI kan voorwaardelijk worden geïnactiveerd door overexpressing een DN gemuteerde vorm van het Spatio wijze. Afschaffing van de functie van endogene POI's, zijn verschillende opties voorgestelde15,16,17. We hebben een eerdere genetische strategie1 bewerkt d.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De pCS2 + CB-Myc6 vector was een geschenk van Marshall Horwitz (Universiteit van Washington, Seattle, WA, Verenigde Staten). De HEI-OC1 cellen werden beschikbaar gesteld door Fedrico Kalinec (David Geffen School of Medicine, UCLA, Los Angeles, CA, USA). Technische ondersteuning werd verstrekt door de UNMC muis genoom Engineering kern (C.B. Gurumurthy, Don Harms, Rolen Quadros) en de Creighton University geïntegreerde Biomedical Imaging faciliteit (Richard Hallworth, John Billheimer). De UNMC Mouse genoom Engineering werd ondersteund door een institutioneel Development Award (idee) van de NIH/NIGMS, verlenen nummer P20 GM103471. De geïntegreerde Biomedical Imaging faci....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM | GIBCO-BRL | 11965-084 | |
| Minimum Essential Medium Eagle, MEME | Sigma | M8042 | |
| Fetaal bovien serum | Sigma | F2442 | |
| Lipofectamine | DharmaFECT | T-2010-03 | |
| Sal I | Roche | 11745622 | |
| EcoRV-HF | New England BioLabs | R3195S | |
| NotI | Roche | 13090730 | |
| CaspaTag | Millipore | APT523 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Staurosporine | Sigma | S4400 | |
| CyQuant NF cell proliferatiekit | Invitrogen | C35007 | |
| Retinoblasoom 1 antilichaam | Abcam | Ab6075 | |
| c-Myc antilichaam | Sigma | M5546 | |
| b-actin | Sigma | A5316 | |
| Ki-67 | Thermofisher scientific | MA5-14520 | |
| Fallodie | Thermofisher scientific | A12379 | |
| Fluorescentie microplaatlezer | FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech | ||
| Epifluorescentie microscoop | NikonEclipse80i | ||
| De TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) muislijn is verkrijgbaar bij het Jackson Laboratory als JAX#032011. |
Referenties
- Li, F. Q., et al. Preferential MyoD homodimer formation demonstrated by a general method of dominant negative mutation employing fusion with a lysosomal protease. Journal of Cell Biology. 135 (4), 1043-1057 (1996).
- Tarang, S., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
