Summary
Hier presenteren we een protocol voor de ontwikkeling van een dominant-negatieve afleidbare systeem, waarin elk eiwit kan voorwaardelijk worden geïnactiveerd door omkeerbaar overexpressing een dominant-negatieve mutant versie van het.
Abstract
Dominant-negatief (DN) eiwit inhibitie is een krachtige methode om te manipuleren eiwitfunctie en biedt diverse voordelen ten opzichte van andere genoom gebaseerde benaderingen. Bijvoorbeeld, hoewel chimeer en Cre-LoxP gerichte strategieën hebben op grote schaal gebruikt, de intrinsieke beperkingen van deze strategieën (dat wil zeggen, lekke promotor activiteit, mozaïek Cre expressie, enz.) zijn aanmerkelijk beperkt hun toepassing. Bovendien is een volledige schrapping van vele endogene genen embryonically dodelijk, waardoor het onmogelijk is om te studeren genfunctie in postnatale leven. Om deze uitdagingen, we hebben aanzienlijke wijzigingen aangebracht in een vroege gentechnologie-protocol en een korte (transgene) versie van het gen Rb1 gecombineerd met een lysosomale protease procathepsin B (CB), voor het genereren van een DN-muismodel van Rb1 (CBRb). Als gevolg van de aanwezigheid van een lysosomale protease, worden het gehele CB-RB1 fusieproteïne en haar interactie complex gerouteerd voor proteasoom-gemedieerde afbraak. Bovendien kan de aanwezigheid van een tetracycline inductor (rtTA)-element in de transgene constructie een afleidbare en omkeerbare regulering van de RB1 proteïne. De aanwezigheid van een alomtegenwoordige ROSA-CAG-promotor in de muismodel CBRb maakt het een nuttig instrument om te verrichten van voorbijgaande aard en omkeerbaar Rb1 gene ablatie en onderzoekers een resource voor het begrijpen van haar activiteiten in vrijwel elk celtype waar RB1 wordt uitgedrukt.
Introduction
Meeste benaderingen die gericht zijn op de gen- en eiwit ablations is afhankelijk van permanente processen, die over het algemeen tot de volledige uitbanning of afkappen van het gen, RNA opeenvolgingen of proteïne van belang (POI leiden). Het algemene doel van deze methode is om ingenieur een recombinant eiwit te schaffen van de functie van endogene, wild-type eiwit. Wij hebben revisited en vernieuwde een alternatieve strategie1,2, dat voorziet in de tijdelijke ablatie van een POI via DN remming. Deze methode werkt voor zowel multimeric als monomeer peptiden, maar is het meest geschikt voor de eiwitten die in een vergadering van de multimeric functioneren.
De methode bestaat uit het smelten van de lysosomale protease CB aan een subeenheid van een multimeric POI (CB smelting complexe). De resulterende CB fusie complexe kan communiceren met en proteolytically de endogene eiwit verteren of afleiden van het gehele complex van het CB-POI op het lysosoom als aangetaste3. Een combinatie van de complexe CB-fusie met de afleidbare aard van het tetracycline-gecontroleerde transcriptionele (TetO) activeringssysteem voorziet bovendien in een afleidbare en beheerste expressie van de transgenic in een omkeerbare mode2. Hoewel het nuttig in veel gevallen, kan de volledige schrapping van genen of eiwitten in vivo resulteren in letaliteit4,5,6. Ook weefsel-specifieke, voorwaardelijke schrapping van sommige genen of eiwitten met behulp van de Cre/Lox systeem mogelijk niet eenvoudig, zoals het uiteindelijk tot permanent verlies van kritieke genomic elements7 leiden zal. Daarom, afhankelijk van het gen of POI, zal geen van deze benaderingen zijn efficiënt in het verstrekken van een nuttig model voor latere studies, met name genen of eiwitten functionele studies in late postnatale en volwassen muizen.
Te omzeilen van de problemen in verband met een dergelijke aanpak en verstrekken bewijs-van-beginsel op de effectiviteit van de voorgestelde methode, die wij hebben gekozen voor het testen van de methode die hier wordt gepresenteerd door het genereren van een voorwaardelijke DN-versie van de proteïne Retinoblastoom 1 (RB1). Verschillende opties zijn voorgestelde8,9,10 tot afschaffing van de functie van endogene RB1; echter allemaal geconfronteerd enkele van dezelfde beperkingen hierboven besproken: permanente germline schrapping van RB1 is embryonically dodelijk en, conform haar tumor suppressor rol, permanente RB1 voorwaardelijke schrapping leidt tot een verscheidenheid van tumoren11. Hoewel een DN versie van RB1 niet van nature lijkt, een beter alternatief voor de momenteel beschikbare strategieën moet voorzien in een stoffelijk gecontroleerde inactivatie van de endogene RB1 en bieden een alternatief mechanisme te herstellen uiteindelijk haar functie. De basis voor een dergelijke constructie werd meer dan twee decennia geleden beschreven1. Echter, als gevolg van technologische beperkingen het ontbrak een mechanisme voor controle transgenic activering, reactie en weefsel specificiteit. Deze studie is de eerste te combineren de elegantie van de doxycycline (Dox)-afhankelijke transcriptionele systeem met een gemanipuleerde transgene constructie van lysosomale protease CB en Rb1 eiwitten. De resulterende CBRb muismodel zorgt voor een tijdelijk gereglementeerde Dox-gemedieerde RB1 voorschrift2. Het voordeel van het gebruik van een dergelijke Proteoom gebaseerde aanpak om te studeren van genfuncties is dat het voor elke gen van belang, met minimale informatie over haar activiteiten kan worden aangenomen.
De voorgestelde DN transgenic strategie biedt vele voordelen ten opzichte van de traditionele benaderingen. Eerst, DN eiwit remming leidt tot slechts een gedeeltelijke ablatie eiwit activiteit, dus het behoud van een residuele endogene expressie. Zo'n resultaat is zeer wenselijk in situaties waar een volledige eliminatie van eiwit activiteit tot embryonale letaliteit leidt, een onderzoek om te bestuderen van de genfunctie in een levende muis sterk te beperken. Ten tweede, de aanwezigheid van het TetO systeem kunt transgenic activering alleen in aanwezigheid van een antibioticum, dat voor een efficiënte en omkeerbare controle van de transgenic activiteit zorgt. Dus, door op te houden de antibiotica administratie, de transgene systeem kan worden gedeactiveerd, en een normale RB1 expressie is terug op zijn plaats. Ten derde, de specificiteit van de transgenic expressie kan variëren naargelang de promotor van keuze. Terwijl wij hebben besloten de alomtegenwoordige ROSA-CAG-promotor voor bewijs-van-principe, is plaatsen de transgenic onder een weefsel-specifieke promotor waarschijnlijk tot beperking van ongewenste transgenic expressie en vergemakkelijken van studies over de therapeutische toepassing van deze transgenic methodologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Generatie van de transgene CBRb muis en alle dierenverzorgers en experimenten die is gekoppeld aan de studie werden goedgekeurd door de Creighton University dier zorginstellingen en gebruik Comité (IACUC) en uitgevoerd door hun richtlijnen.
1. transgene CB-Myc6-Rb1 Construct
Opmerking: Het klonen van CBRb in een vector pTet_Splice werd gedaan in een proces van meerdere stappen (figuur 1A en 1B).
-
Voeren de eerste fase klonen in de pCS2 + CB-Myc6 vector.
- Maken van de constructie van de transgenic CBRb, een 1583-bp-long Rb1 cDNA fragment (528 aminozuren overeenkomt met de aminozuur-regio 369-896) versterken van het eiwit van de RB1 met behulp van de volgende primer instellen: gebruik voor EcoRI +RB 1243F, GGGGAATTCA TTAAATTCAGCAAGTGATCAACCTTC, en XbaI + EcoRV +RB 2826R, gebruik CCCTCTAGATATCTATTTGGACTCTCCTGGGAGATGTTTACTTCC.
- Kloon het fragment gegenereerd (1546 bp) tussen de EcoR1 en XbaI sites van de beperking van de pCS2 + CB-Myc6 vector als eerder beschreven1,12.
Opmerking: De 1012-bp-long CB-Myc6 constructie (337 aminozuren) gesmolten naar het fragment Rb1 resulteerde in een proteïne van ongeveer 865 aminozuren (ongeveer 108 kDa), die iets kleiner is dan de endogene RB1 proteïne (~ 110 kDa) (Figuur 1 Een), met een CB-Myc6 tag op de N-terminus en Rb1 in het C-terminus.
-
De tweede fase subcloning in de pTet-Splice vector uitvoeren
- Om de CB-RB-Myc6 fusion fragment te vergroten en zo de Tet-promotor, versterken de cassette, bestaande uit de CB-myc6-Rb1 gebruikend inleidingen met de EcoRV (XbaI + EcoRV + RB 2826R) en SalI sites: voor SalI +CBF, gebruik CCAGTCGACAGGATGTGGTGGTCCTTGATCCTTC.
- Subclone het fragment gegenereerd (2567 bp) in de pTet-Splice vector, tussen de beperkingsplaatsen SalI en EcoRV , zodanig dat de gehele TetO-DN-CB-myc6-Rb1 transgenic, met inbegrip van de SV40 intron en de PolyA signaal, kunnen worden geïsoleerd door middel van een enkele spijsvertering met kennisgevingen (Figuur 1B).
Opmerking: De kennisgevingen fragment werd gebruikt voor het genereren van de transgene financiers.
2. in Vitro testen van de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 transgenic
-
Dox-verordening: NIH3T3 cellijn
Opmerking: Tenzij anders vermeld, zijn alle volumes voor een 6-well-plaat aangepast.- Het groeien van cellen van de NIH3T3 van de leverancier specificaties, met behulp van de aanbevolen cel voedingsbodems met 10% foetale runderserum bij 37 ° C met 10% CO2na.
- De cellen met pTet-Splice cotransfect en pCMV-Tet3G-vectoren (uit stap 1) voor 24 h. de stappen hieronder vermelde voor cotransfection.
- Meng 2 – 4 µL van de lipide gebaseerde transfectie reagens/put en 1 mL van onvolledig (zonder serum) Dulbecco van bewerkt Eagle Medium (DMEM) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Gebruik van 250 of 500 µL van voedingsbodems, respectievelijk voor een 12 - of 24-well plaat, en de volume van de reagens van de transfectie dienovereenkomstig aanpassen.
- 2 – 3 µg plasmide DNA/putje toevoegen aan de transfectie reagens-DMEM en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg de mix met DNA en het transfectiereagens in DMEM aan elk putje. Na 3-4 uur incubatie, voeg 1 mL volledige media (zodat het eindvolume 2 mL per putje is). Houd aliquots van Dox voorraad (1 mg/mL) en voeg 2 µL in elk van de putten (+ Dox). Incubeer de cellen bij 37 ° C met 5% CO2.
Opmerking: Controlemonsters moeten bestaan uit cotransfected cellen niet behandeld met Dox (-Dox), evenals NIH3T3 cellen transfected alleen met de transactivator pCMV-Tet3G-vector en gedurende een periode van 24 uur behandeld met Dox. Voor pCMV-Tet3G, concentraties van 0,1-1 µg/mL Dox zou voldoende moeten zijn voor het opwekken van de transgenic expressie.
-
Test de omkeerbaarheid van de constructie die met behulp van de cellijn van HEK293.
- Om te testen de omkeerbaarheid van de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 transgenic, cultuur HEK293 cellen in Eagle's Minimum essentiële Medium (EMEM) na specificaties van de leverancier en cotransfect met pTet-Splice én pCMV-Tet3G vectoren voor 24u, zoals beschreven boven (stap 2.1.2).
- Voor de inactivering van transgenic, verwijder het medium van Dox-bevattende na 24 h en wassen van de cellen 2 x-3 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) broeden ze in Dox-vrije media voor een aanvullende 24 h.
Opmerking: Na Dox-verwijdering, moeten de transgenic inactivering en regelmatige eiwit expressie binnen die periode van 24 uur worden hervat.
-
Uitvoeren om te beoordelen van de functionaliteit van de constructie van de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 biij ongeplande celproliferatie, de functionele analyses met behulp van een cellijn HEI-OC1, zoals hieronder beschreven.
- Cultuur HEI-OC1 cellen in 10% DMEM onder tolerante omstandigheden (33 ° C met 10% CO2). Voor cel proliferatie studies, met behulp van een cel teller en plaat 10.000 HEI-OC1 cellen op een 96-wells-plaat in een volume van 200 µL cellen te tellen. Incubeer de cellen 's nachts.
- Voer op de volgende dag, een voorbijgaande cotransfection van pTet-Splice en pCMV-Tet3G vectoren met behulp van een lipide gebaseerde transfectiereagens (Zie stappen 2.1.2). In een aparte goed, pmR-ZsGreen1 transfectie at2-µg met behulp van het lipide gebaseerde transfectiereagens (stappen 2.1.2) voor het berekenen van het tarief van de transfectie worden uitgevoerd. Niet-transfected cellen als besturingselementen gebruiken.
- Detecteren van de aanwezigheid van groene fluorescentie onder een fluorescentie Microscoop (excitatie = 485 nm, emissie = 530 nm) voor de transfected cellen 24u na transfectie. Neem de aanwezigheid of afwezigheid van groene fluorescentie en bereken het percentage van de transfectie als het totale aantal GFP-positieve cellen (transfected cellen) over de cellen die zijn gemarkeerd met de DAPI (totaal aantal cellen).
Opmerking: Wij een tarief van de transfectie van ~ 70% geschat. - Om te induceren transgenic expressie, 1 µg/mL Dox aan een subset van transfected cellen toevoegen tijdens het gebruik van de andere subset als besturingselement (-Dox). Onbehandelde HEI-OC1 cellen worden gebruikt als extra besturingselementen.
- Om te beoordelen celproliferatie, door een cel proliferatie kit volgens protocol van de fabrikant te gebruiken.
- Kortom, 48 h na transfectie, verwijder het kweekmedium cel en voeg 100 µL van 1 x kleurstof-bindoplossing aan elk putje van de microplate. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C.
- Daarna meet de intensiteit van de fluorescentie van elk monster met behulp van een fluorescentie microplate reader (excitatie = 485 nm, emissie = 530 nm).
- Verder beoordelen celproliferatie met immunocytochemie, de cellen van de HEI-OC1 op een glas van de cover in een 12-well plaat plaat en na een nacht bebroeden bij 37 ° C.
- De volgende dag, cotransfect met de pTet-Splice en pCMV-Tet3G en het uitvoeren van de behandeling van Dox (+ Dox). Untransfected cellen als besturingselementen gebruiken. Proces HEI-OC1 cellen voor het labelen van Ki-67.
- Het herstellen van de cellen met de 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS, pH 7.4, gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Wassen van de cellen 3 x met ijskoude PBS en Incubeer de cellen in de niet-ionogene wasmiddel van de 0,25% in PBS gedurende 10 minuten.
- Wassen van de cellen opnieuw, 3 x in PBS voor 5 min, en blok 10% serum met een bevochtigde kamer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Incubeer de cellen in 500 µL van Ki-67 primair antilichaam (1:200 verdunning) gedurende 3 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C.
- Wassen van de cellen 3 x voor 5 min met PBS. Incubeer de cellen met het secundaire antilichaam gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker na dat.
- Verwijder de secundair antilichaam-oplossing en wassen van de cellen 3 x met PBS voor 5 minuten, elk in het donker.
- Incubeer de cellen van de HEI-OC1 in 1:200 phalloidin voor 30 min voor phalloidin labeling. Als u het label van de kernen van cellen, Incubeer de cellen met 5 µg/mL DAPI gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
Opmerking: Zorg ervoor dat de geconjugeerde van de kleurstof phalloidin anders dan de geconjugeerde van secundair antilichaam is.
3. productie van CBRb+/ROSA-CAG-rtTA+ (CBRb) transgene muizen en In Vivo tests van de DN-CBRb-aanpak
- Na bevestiging wordt door de effectieve Dox regulering van de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 transgenic zuiveren het fragment van de kennisgevingen en microinject hen in muis zygoten, die later naar pseudo-zwangere vrouwen overgebracht worden.
Opmerking: Deze procedures werden uitgevoerd bij de Universiteit van Nebraska Medical Center (UNMC) muis genoom Engineering Core faciliteit. - Na de levering, de pups met behulp van een primer specifieke regio ingesteld op de CB-Rb1 fusion genotype: CBRb F, 5' CTGTGGCATTGAATCAGAAATTGTGGCTGG 3 ' gebruiken, en voor CBRB R, gebruiken voor 3 5 ' GTACTTCTGCTATATGTGGCCATTACAACC '.
Opmerking: De grootte van het PCR product waargenomen op agarose gel is 401 bp (60-bp CB regio + 341-bp Rb1 regio (tabel 1). Tien onafhankelijke oprichter regels werden vastgesteld, gebaseerd op de aanwezigheid van de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 transgenic. In vijf van deze lijnen erfde nakomelingen de transgenic, die de overdracht van de kiemcellen van de transgenic bevestigd. Een van de transgene lijnen werd uiteindelijk gebruikt voor het vaststellen en handhaven van de lijn en genereren van proefdieren TetO-DN-CB-myc6-Rb1 voor verdere studies. - Volwassen TetO-DN-CB-myc6-Rb1 muizen naar de ROSA-CAG-rtTA tetracycline inductor regel (voorraad #006965) (als alternatief, breed aan een tTA inductor lijn) voor het genereren van experimentele DN-CBRb muizen fokken. Genotype van de nakomelingen van dit kruis met behulp van de volgende set van de primer: gebruik voor rtTA-WT R, GGAGCGGGAGAAATGGATATG; gebruik voor rtTA Mutant R, GCGAGGAGTTTGTCCTCAACC; en voor rtTA Common, gebruik AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT. De PCR product maten zijn 340 bp (mutant), 340 bp en 650 bp (heterozygote) en 650 bp (wild-type).
- Een dosis-responscurve van het eiwit van de RB1 na de Dox behandeling om de tijd en de duur van de Dox behandeling nodig te verduidelijken met een transgenic-expressie te genereren.
Opmerking: In dit experiment, werden westelijke vlek en qRT-PCR gebruikt om weefsel-specifieke transgenic activering en RB1 expressie te evalueren. - Fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) te bevestigen de genomic invoeging van de transgenic uitvoeren
Opmerking: Dit werd uitgevoerd op het centrum voor toegepast genomica van het ziekenhuis voor zieke kinderen (Toronto, Canada). ELISA of het westelijke bevlekken (met eiwit-specifieke antilichaam) kan worden gebruikt ter beoordeling van transgenic activering, weefsel-specificiteit en veranderingen in de niveaus van de endogene POI. Voor de constructie van de DN-CB-myc6-Rb1 gebruikten we een anti-RB1 antilichaam.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In het algemeen, ontwerpen van een mutatie DN vereist een aanzienlijke hoeveelheid informatie over de structuur en functie van het POI. In tegenstelling, is de DN-strategie die hier gepresenteerd vooral handig wanneer de structurele en functionele informatie voor het POI beperkt is. Als het POI een multimeric eiwit is, een fusie van een subeenheid aan een lysosomale protease dominant kan remmen de geassembleerde multimer en mogelijk andere liganden door een combinatie van proteolyse van de endogene subeenheden en subcellular omlegging van de multimer aan het lysosoom. Om te bevestigen succesvol klonen en testen van de effectiviteit van Dox-gereglementeerde transgenic activering, gezuiverde pTet-Splice plasmide met de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 was construct transfected in muis NIH3T3 cellen die stabiel de rtTA uitgedrukt eiwit, maar niet Rb113. Bij het ontbreken van Dox weergegeven cellen uiten rtTA geen RB1 uitdrukking, overwegende dat een robuuste RB1 uitdrukking werd waargenomen in aanwezigheid van Dox(Figuur 2). Vervolgens, om te testen de omkeerbaarheid van het systeem, cotransfected we HEK293 cellen (die endogeen express Rb114) met gezuiverde pTet-Splice /TetO-DN-CB-myc6-Rb1 en de pCMV-Tet3G-vectoren. Zoals verwacht, was de uitdrukking van de endogene RB1 proteïne aanzienlijk geremd op transgenic activering door de toevoeging van Dox in de cel cultuur media (Figuur 2B). Om te testen de omkeerbaarheid van het systeem, na een periode van 24 uur per dag, in een subset van HEK293 cellen, we de voedingsbodems van Dox-bevattende cel vervangen door verse Dox-vrije media en de cellen voor een aanvullende 24 h. ter ondersteuning van de omkeerbaarheid van Dox-gereglementeerde, RB1 geïncubeerd expressie werd gerestaureerd na Dox verwijdering uit de voedingsbodems (Figuur 2B). Transfected cellen van de HEK293 die niet werden behandeld met Dox of Dox-behandeld HEK293 cellen transfected met de pCMV-Tet3G vector alleen (Figuur 2B) toonde basale niveaus van endogene RB1 expressie. Omdat NIH3T3 cellen RB1 eiwit natuurlijk niet uiten doen, wordt de positieve RB1 reactiviteit is als gevolg van de accumulatie van de transgene RB1 proteïne. Gezien onze interesse in het mogelijke proliferatieve effect van de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 constructie in het auditieve systeem, we het totale gehalte van het DNA in pTet-Splice gemeten /TetO-DN-CB-myc6-Rb1- en HEI-OC1 pCMV-Tet3G-transfected cellen () orgaan van het binnenoor van een Corti afkomstige cellijn) in de aanwezigheid en de afwezigheid van Dox. In overeenstemming met de werkhypothese hier gepresenteerd, een aanzienlijke stijging van de DNA-inhoud (overeenkomend met een toename van het aantal cellen) werd waargenomen in Dox behandeld maar niet onbehandeld (control) transfected cellen van de HEI-OC1 (figuur 3A - 3 C ).
Naar aanleiding van de in vitro bevestiging van de transgenic activiteit en de functie, een transgeen muismodel werd gegenereerd. VIS, met behulp van een TetO-DN-CB-myc6-Rb1 heksenkruid (DIG)-paard radijs peroxidase (HRP) / tyramine-Biotine/avidin-Cy5-geëtiketteerden sonde, en G-banding van mannelijke muizen splenocytes en oor fibroblasten werden uitgevoerd om te bevestigen de transgenic opneming in de transgene muizen genoom. Onder de vijf germline verzendende stichters, gesegmenteerde lijn 14 toonde een consistent transgenic invoeging binnen 10C 3 ~ D2 (figuur 4A - 4 C). Muizen uit deze lijn werden gebruikt om de stand van de kolonies kweken en het genereren van proefdieren voor verdere studies. Om te bepalen van de optimale tijd voor de Dox inductie en TetO-DN-CB-myc6-Rb1 transgenic activering, we de transgene muizen verdeeld in drie verschillende groepen, waarin Dox werd toegediend in het drinkwater voor variabele lengtes van tijd: groep 1 (3 dagen van behandeling), groep 2 (7 dagen na behandeling) en groep 3 (10 dagen na behandeling). Na afronding van de behandeling, werden veranderingen in de RB1 eiwituitdrukking beoordeeld door Westelijke Bevlekkende (figuur 5A - 5 D). Omdat het DN en inheemse RB1 eiwitten gelijkaardige molecuulgewichten hebben, kunnen niet ze worden opgelost van elkaar op een westelijke vlek. Echter consistent met een aanvankelijke toename in RB1 eiwit (als gevolg van de accumulatie van DN-RB1 en endogene eiwitten), was er een aanvankelijke toename van de totale RB1 eiwituitdrukking in de transgene muis cochleae in vergelijking met de controlegroep (Figuur 5 A). Bovendien, in overeenstemming met de remmende en proteolytic activiteit van het TetO-DN-CB-myc6-Rb1 transgenic product, een meetbare afname van de RB1 expressie werd waargenomen in de groepen 2 en 3 ten opzichte van groep 1 en controlegroepen ( Figuur 5A - 5 D). Van de nota, behandeling langer dan 10 dagen niet leiden tot verdere wijzigingen in RB1 eiwit expressie. 10 dagen van Dox behandeling werd dus beschouwd als optimale en gebruikte voor verdere studies.
Omdat de rtTA en, bijgevolg, TetO-DN-CB-myc6-Rb1 transgenic activering onder de alomtegenwoordige ROSA-CAG -promotor zijn, RB1 potentieel kan worden geremd in alle weefsels of cellen waar RB1is endogeen uitgedrukt (bijv. longen, hart, netvlies). Om te testen dit uitgangspunt en evalueren van de transgenic weefsel specificiteit, cochleae, longen, hart en ogen biopten werden ontleed van TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA, en controle muizen (niet de ROSA-CAG-rtTA transgenic uitvoering) waren beoordeeld voor RB1 expressie (figuur 6A - 6 C). Ongeacht het weefsel geanalyseerd, werd een aanzienlijke vermindering in RB1 eiwit waargenomen in TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA maar niet in de controlegroep (Figuur 6A). In schril contrast, qRT-PCR worden geanalyseerd in het oog, hart en cochleae van Dox-behandeld TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA en leeftijd-matched controle muizen toonde een significante opregulatie van de DN-CBRb transcriptie in de weefsels van de voormalige maar niet de laatste muizen (Figuur 6C). Over het geheel genomen is deze resultaten bevestigen de efficiëntie van de constructie. Een stijging transcript expressie weerspiegelt de effectieve Dox-gereglementeerde transgenic inductie. Ook komt een vermindering van eiwit expressie overeen met de Routering en Proteolytische afbraak van de endogene RB1.
Figuur 1: multi-step klonen van de CBRb en de generatie van de afleidbare TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA. (A) dit paneel toont het klonen van de Rb1 fragment in de vector pCS2-CB-Myc6 . Een 1583-bp Rb1 gene product was PCR versterkt met de EcoRI + RB1243 vooruit en de omgekeerde inleidingen Xba + EcoRV + RB2826 . Het resulterende Rb1 fragment werd gekloond tussen de beperkingsplaatsen EcoRI en Xbal van de pCS2-vector met de constructie van de CB-Myc6 voor het genereren van de CB-myc6, pCS2 + Rb1 vector. (B) de CB-myc6 + Rb1 fragment werd in de vector pTetSplice tussen de beperkingsplaatsen SalI en EcoRV gekloond. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Doeltreffendheid van de activering van Dox-gereglementeerde transgenic. (A) NIH3T3 cellen doen meestal niet uitdrukken voor RB113. Bevestiging van de efficiënte activering van de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 construct, bleek een westelijke vlekkenanalyse met het anti-RB1 antilichaam een robuuste RB1 expressie in aanwezigheid van Dox (banen 1 en 3), maar niet in afwezigheid (rijstroken 2 en 4). (B) HEK293 cellen, die endogeen express Rb114, waren cotransfected met TetO-DN-CB-myc6-Rb1 en de pCMV-Tet3G-transactivator-vector. Bij het ontbreken van Dox lane (1), werd een positieve RB1 uitdrukking waargenomen. De toevoeging van Dox aan het systeem veroorzaakt de activering van de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 en RB1 Downregulatie (lane 2). De RB1 expressie werd hervat 24u nadat Dox werd verwijderd uit de media (lane 3). C = controle, untransfected HEK293 cellen niet behandeld met Dox. Dit is een aanpassing van een figuur die oorspronkelijk gepubliceerd in het tijdschrift Frontiers in Cellulaire neurowetenschappen2. De reproductie stemt in met de grenzen'beleid inzake auteurs' auteursrecht bewaren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Dox-gemedieerde DN-CBRb transgenic activering verhoogt celproliferatie. (A) cellen van de HEI-OC1 cotransfected met gezuiverde TetO-DN-CB-myc6-Rb1en de pCMV-Tet3G-vectoren werden gekweekt bij afwezigheid (−) of (+) aanwezigheid van Dox. Celproliferatie was vastbesloten 48 h na de transfectie met behulp van een proliferatie assay. De procentuele verandering in de proliferatie was berekend op basis van een verandering in fluorescentie waarden met untransfected cellen als een besturingselement. Een bescheiden maar significante toename van het aantal cellen werd waargenomen in de transfected cellen, na Dox behandeling. Daarentegen geen significante veranderingen werden waargenomen tussen transfected cellen van de HEI-OC1 niet behandeld met (−) Dox en de untransfected controle. (B) untransfected van de HEI-OC1 cellen of (C) cotransfected met gezuiverde TetO-DN-CB-myc6-Rb1 en de pCMV-Tet3G-vectoren in de aanwezigheid (+) van Dox gekweekte waren gelabeld met Ki-67 (rood), Phalloidin (groen) en DAPI (blauw). P < 0.05. Schaal bar = 10 µm. Dit is een aanpassing van een figuur die oorspronkelijk gepubliceerd in het tijdschrift Frontiers in Cellulaire neurowetenschappen2. De reproductie stemt in met de grenzen'beleid inzake auteurs' auteursrecht bewaren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Fluorescent in situ hybridisatie (FISH) bevestiging van de genomic invoeging van de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 transgenic. Een pCS2-CBRb (Heksenkruid sonde/anti-DIG-HRP/tyramide-Biotine/avidin-Cy5, in het rood) testpunt werd gekruist te splenocytes en oor fibroblast cel-metafase te zien als het signaal van de sonde kan worden herkend of niet met een één-kopie invoegen doelgrootte van 2.5 kb. De pCS2-CBRb test sonde gekruist aan één chromosoom 10 met de heldere, doublet sonde signalen die de invoeging van de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 transgenic binnen het segment 10 C 3-D2 toonde. De sonde van de controle RP23 - 267G 24 (Spectrum groen) gekruist aan chromosoom 10 op band 10A1 zoals verwachte en bevestigd dat de CBRb DNA van belang chromosoom 10 ingevoegd. (A) dit paneel toont de G-band metafase. (B) dit paneel toont het tyramide signaal versterking (TSA) vis beeld van de dezelfde metafase zoals in deelvenster A. (C) dit paneel toont samengestelde afbeeldingen van chromosoom 10 tonen (1) G-banding, TSA (2) de vis, en (3) TSA vis met omgekeerde DAPI "banding". Rood = pCS2-CBRb sonde; blauw = DAPI "banding"; groen = RP23 - 267G 24 controle sonde. Schaal bar = 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : DN-CBRb transgenic activering in het binnenoor van postnatale (P) 36 TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA+ (CBRb+) en ROSA-CAG-rtTA+ (CBRb−) muizen na 3 (groep 1), 7 (groep 2) en 10 (groep 3) dagen van Dox behandeling. (A-C) Anti-RB1, die met zowel de hyperphosphorylated en de hypophosphorylated vormen van RB1, reageert zoals goed als anti-c-myc antilichamen werden gebruikt voor de detectie. Densitometric analyse werd gedaan met behulp van ImageJ software. De bijbehorende waarden die verkregen werden genormaliseerd naar de negatieve controle CBRb− (-) en vervolgens naar β-actine. De relatieve RB1 expressie niveaus worden weergegeven onder elke vlek. (D) De grafische weergave van genormaliseerde RB1 expressie niveaus uitgezet tegen de verschillende behandelingen hoogtepunten een consistent lagere RB1 detectie in CBRb+ (+) monsters. Elke rijstrook op het gel voor westelijke vlek en elke kolom in de afbeelding komen overeen met een andere persoon. P < 0.05.This figuur werd oorspronkelijk gepubliceerd in het tijdschrift Frontiers in Cellulaire neurowetenschappen2. De reproductie stemt in met de grenzen'beleid inzake auteurs' auteursrecht bewaren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6 : Ruimtelijke analyses van de TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA transgenic activering in P18 TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA+ (+) en DN-CBRb+/ROSA-CAG-rtTA− negatieve controle (-) muizen hart, ogen, longen en slakkenhuis. (A) bevestiging van de efficiëntie van transgenic Dox-gemedieerde activering, de uitdrukking van de endogene RB1 was werden in de CBRb+/ROSA-CAG-rtTA+ weefsels maar niet in de negatieve controle muizen weefsels. Densitometric analyse werd uitgevoerd zoals beschreven in Figuur 5. De relatieve RB1 expressie niveaus worden weergegeven onder elke vlek. (B) dit paneel toont een grafische weergave van genormaliseerde RB1 expressie niveaus uitgezet tegen de verschillende weefsels. Een interindividual variant van endogene RB1 niveaus kan verschillen in individuele reacties op transgenic activering en RB1 Downregulatie verklaren. (C) RT-PCR analyseert in oog, hart, en cochleae bleek een belangrijke opregulatie van het TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA transcript in Dox-behandeld TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA+ weefsels, maar niet in de DN-CBRb+/ROSA-CAG-rtTA− negatieve controlegroep. CBRb+/rtTA+ = TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA+; CBRb−/rtTA+ = ROSA-CAG-rtTA+; P < 0.05. Dit cijfer werd oorspronkelijk gepubliceerd in het tijdschrift Frontiers in Cellulaire neurowetenschappen2. De reproductie stemt in met de grenzen'beleid inzake auteurs' auteursrecht bewaren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Tabel 1: PCR voorwaarde gebruikt voor het controleren van de CB-Rb1 fusion regio.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wij willen om te omzeilen van de beperkingen die zijn gekoppeld aan de traditionele transgene strategieën, genereren een muismodel waarin een endogene POI kan voorwaardelijk worden geïnactiveerd door overexpressing een DN gemuteerde vorm van het Spatio wijze. Afschaffing van de functie van endogene POI's, zijn verschillende opties voorgestelde15,16,17. We hebben een eerdere genetische strategie1 bewerkt door het combineren van het Dox-afhankelijke transcriptionele systeem een eenvoudige strategie een fusie van de lysosomale protease-CB voor het genereren van een mutant peptide waarvan de expressie is van invloed op de expressie van dienst de endogene POI2. Bovenal is deze techniek vereist geen voorafgaande kennis van het traject het POI is gekoppeld. De huidige strategie voor DN eiwit remming toont aan dat het signaal van de lysosomale localisatie op het CBRb fusion gen het gehele RB-interactie complex richting lysosoom2,3 afleidt. Eenmaal binnen lysosoom, proteolytic processing van deze eiwitten wordt geïnitieerd, wat leidt tot hun afbraak3. De intrinsieke eigenschap van de CB-gesmolten proteïne, gekoppeld aan de omkeerbare inducibility van het TetO systeem, maakt dit een goed alternatief voor traditionele transgene strategieën (bijv. volledige gene knock-out, voorwaardelijke verwijdering), met name wanneer de volledige verwijdering van het gen van belang is niet wenselijk.
We in eerste instantie het onderzoek gericht op de RB1 proteïne. DN mutaties worden gemakkelijkst beschreven in de eiwitten die als een dimeer of multimeren functioneren. Tot op heden is er geen bewijs van een directe fysieke interactie tussen RB1 moleculen. Niettemin, de aard van haar activiteiten zorgt voor de aanwezigheid van meerdere RB1 moleculen in hetzelfde complex op een bepaald moment. De binding van hypophosphorylated RB1 aan de E2F1-DP heterodimer bevat bijvoorbeeld een extra binding site, die normaal wordt bezet door histon deacetylase (HDAC)18,19,20. Aan de andere kant, HDAC1 fysiek interageert met RB1 en dit complex, op zijn beurt, bindt aan de heterotrimer van de E2F1-DP-RB1, waardoor extra transcriptie repressie18. Volgens deze benadering als ten minste één van de RB1 moleculen in de groep een mutant, DN is, het zal voorkomen dat het complex onderdrukken van transcriptie, terwijl het vermindert de niveaus van endogene RB1, aldus aanleiding kunnen geven tot een RB1-null fenotype. Hier, werd remming van endogene RB1 waargenomen 10 dagen na de toediening van Dox in drinkwater. De optimale dosis voor Dox inductie, maar wellicht worden empirisch bepaald voor elk systeem. Bovendien, aangezien het merendeel van de gensequentie Rb1 werd gebruikt op de samenstelling van de constructie, is het mogelijk dat zelfs in de afwezigheid van endogene RB1, de mutant RB1 kan met communiceren en uitlokken van de DN-remming van om het even welk van de RB1 van bindende partners. Dit uitgangspunt kan worden getest door de beoordeling van het niveau van de expressie van bekende RB1-bindende moleculen.
Broodnodige, fijn gereglementeerde tijdelijke en omkeerbare eiwit inactivatie zal de basis vormen voor de ontwikkeling van een breed scala van studies in een nog groter aantal onderzoeksgebieden zoeken om te werpen licht op de complexe biochemische mechanismen ten grondslag liggen aan de verschillende aspecten van de gen- en proteinactivity. Afhankelijk van het POI, inzicht in de complexiteit van de moleculaire dreigt onderzoekers vermogen voor het ontwerpen van succesvolle therapeutische strategieën te verbeteren. Verhoogde transgenic specificiteit kan worden bereikt door het fokken van de DN-muis aan weefsel-specifieke initiatiefnemers tTA of rtTA lijnen rijden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De pCS2 + CB-Myc6 vector was een geschenk van Marshall Horwitz (Universiteit van Washington, Seattle, WA, Verenigde Staten). De HEI-OC1 cellen werden beschikbaar gesteld door Fedrico Kalinec (David Geffen School of Medicine, UCLA, Los Angeles, CA, USA). Technische ondersteuning werd verstrekt door de UNMC muis genoom Engineering kern (C.B. Gurumurthy, Don Harms, Rolen Quadros) en de Creighton University geïntegreerde Biomedical Imaging faciliteit (Richard Hallworth, John Billheimer). De UNMC Mouse genoom Engineering werd ondersteund door een institutioneel Development Award (idee) van de NIH/NIGMS, verlenen nummer P20 GM103471. De geïntegreerde Biomedical Imaging faciliteit werd gesteund door de Creighton University School of Medicine en subsidies, GM103427 en GM110768 van de NIH/NIGMS. De faciliteit is gebouwd met steun van subsidies uit het National Center for onderzoeksmiddelen (RR016469) en de NIGMS (GM103427). De lijnen van de muis gegenereerd in deze studie werden onderhouden bij Creighton University's dier Resource faciliteit, waarvan infrastructuur werd verbeterd door middel van een subsidie door de NIH/NCRR G20RR024001. Dit werk ontvangen verleden ondersteuning via een NIH/NCRR 5P20RR018788-/ NIH/NIGMS 8P20GM103471 COBRE toekennen (Shelley D. Smith), NIH/ORIP R21OD019745-01A1 (S.M.R.-S.) en een opkomende subsidie van het onderzoek van de Hearing Health Foundation (naar S. Tarang). De inhoud van dit onderzoek is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM | GIBCO-BRL | 11965-084 | |
| Minimum Essential Medium Eagle, MEME | Sigma | M8042 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442 | |
| Lipofectamine | DharmaFECT | T-2010-03 | |
| Sal I | Roche | 11745622 | |
| EcoRV-HF | New England BioLabs | R3195S | |
| NotI | Roche | 13090730 | |
| CaspaTag | Millipore | APT523 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Staurosporine | Sigma | S4400 | |
| CyQuant NF cell proliferation kit | Invitrogen | C35007 | |
| Retinoblastoma 1 antibody | Abcam | Ab6075 | |
| c-Myc antibody | Sigma | M5546 | |
| b-actin | Sigma | A5316 | |
| Ki-67 | Thermofisher scientific | MA5-14520 | |
| Phallodin | Thermofisher scientific | A12379 | |
| Fluorescence microplate reader | FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech | ||
| Epifluorescence microscope | NikonEclipse80i | ||
| The TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) mouse line is available from the Jackson Laboratory as JAX#032011. |
References
- Li, F. Q., et al. Preferential MyoD homodimer formation demonstrated by a general method of dominant negative mutation employing fusion with a lysosomal protease. Journal of Cell Biology. 135 (4), 1043-1057 (1996).
- Tarang, S., et al. Generation of a retinoblastoma (rb)1-inducible dominant-negative (DN) mouse model. Frontiers Cellular Neuroscience. 9 (52), (2015).
- Kominami, E., et al. The selective role of cathepsins B and D in the lysosomal degradation of endogenous and exogenous proteins. FEBS Letters. 287 (1-2), 189-192 (1991).
- Cortellino, S., et al. Defective ciliogenesis, embryonic lethality and severe impairment of the sonic hedgehog pathway caused by inactivation of the mouse complex A intraflagellar transport gene Ift122/Wdr10, partially overlapping with the DNA repair gene Med1/Mbd4. Developmental Biology. 325 (1), 225-237 (2009).
- Ferreira, C., et al. Early embryonic lethality of H ferritin gene deletion in mice. Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3021-3024 (2000).
- Lee, E. Y., et al. Mice deficient for rb are nonviable and show defects in neurogenesis and haematopoiesis. Nature. 359 (6393), 288-294 (1992).
- Turlo, K. A., et al. When cre-mediated recombination in mice does not result in protein loss. Genetics. 186 (3), 959-967 (2010).
- Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).
- Zhang, J., et al. The first knockout mouse model of retinoblastoma. Cell Cycle. 3 (7), 952-959 (2004).
- Zhao, H., et al. Deletions of retinoblastoma 1 (Rb1) and its repressing target S phase kinase-associated protein 2 (Skp2) are synthetic lethal in mouse embryogenesis. Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10201-10209 (2016).
- Yamasaki, L., et al. Loss of E2F-1 reduces tumorigenesis and extends the lifespan of Rb1(+/-) mice. Nature Genetics. 18 (4), 360-364 (1998).
- Li, F. Q., et al. Selection of a dominant negative retinoblastoma protein (RB) inhibiting satellite myoblast differentiation implies an indirect interaction between MyoD and RB. Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5129-5139 (2000).
- Pitkanen, K., et al. Expression of the human retinoblastoma gene product in mouse fibroblasts: Effects on cell proliferation and susceptibility to transformation. Experimental Cell Research. 207 (1), 99-106 (1993).
- Chano, T., et al. Neuromuscular abundance of RB1CC1 contributes to the non-proliferating enlarged cell phenotype through both RB1 maintenance and TSC1 degradation. International Journal of Molecular Medicine. 18 (3), 425-432 (2006).
- Kole, R., et al. RNA therapeutics: Beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (2), 125-140 (2012).
- Yamamoto, A., et al. The ons and offs of inducible transgenic technology: A review. Neurobiology of Disease. 8 (6), 923-932 (2001).
- Houdebine, L. M., et al. Transgenic animal models in biomedical research. Methods in Molecular Biology. 360, 163-202 (2007).
- Brehm, A., et al. Retinoblastoma protein recruits histone deacetylase to repress transcription. Nature. 391 (6667), 597-601 (1998).
- Lu, Z., et al. E2F-HDAC complexes negatively regulate the tumor suppressor gene ARHI in breast cancer. Oncogene. 25 (2), 230-239 (2006).
- Magnaghi-Jaulin, L., et al. Retinoblastoma protein represses transcription by recruiting a histone deacetylase. Nature. 391 (6667), 601-605 (1998).
