Summary
Здесь мы представляем протокол развивать систему индуцибельной Доминант отрицательных, в котором любой белок может быть условно инактивированная обратимо экспрессирующих черепашки версии Доминант отрицательные.
Abstract
Доминант отрицательные (DN) белок является мощный способ манипулировать функции протеина и предлагает несколько преимуществ над другими подходы, основанные на геном. Например хотя химерных и Cre-LoxP ориентации стратегий широко использовались, встроенные ограничения этих стратегий (т.е., протекающая промоутер активность, мозаика Cre выражения и т.д.) значительно ограничили их приложения. Кроме того полное исключение много эндогенные генов embryonically смертельной, что делает невозможным для изучения функции гена в послеродовой период жизни. Для решения этих проблем, мы внесли значительные изменения в начале протокол генной инженерии и короткая (трансгенных) версия Rb1 гена в сочетании с лизосомальных протеазы procathepsin B (CB), чтобы создать модель мыши DN Rb1 (НАСВВП). Благодаря наличию лизосомальных протеазы весь CB-RB1 синтез белка и его взаимодействующих комплекса маршрутизируются протеасом опосредованной деградации. Кроме того присутствие элемента индуктором (rtTA) тетрациклина в трансгенных конструкция позволяет индуцибельной и обратимым регулирование RB1 белка. Наличие повсеместно Роза-CAG промоутер в мышиной модели НАСВВП делает его полезным инструментом для выполнения переходных и обратимым Rb1 гена абляции и исследователи ресурс для понимания ее деятельности в практически любой тип клеток, где выражается RB1.
Introduction
Большинство подходов, направленных на генов и белков аблаций полагаются на постоянные процессы, которые обычно приводят к полной ликвидации или усечение гена, РНК последовательности или протеин интереса (POI). Общая цель этого метода является инженер рекомбинантных белков отменить функцию эндогенные, одичал тип протеина. У нас пересмотреть и обновленный альтернативная стратегия1,2, который позволяет для временного абляции POI через ингибитирование DN. Этот метод работает для multimeric и мономерных пептидов, но лучше всего подходит для белков, которые функционируют в сборке multimeric.
Этот метод состоит из фьюзинга лизосомальных протеазы CB для субблока multimeric Пои (CB фьюжн комплекс). Результирующая CB фьюжн комплекс может взаимодействовать с и proteolytically дайджест эндогенного белка или отвлекать весь комплекс CB-Пои для Лизосома деградированных3. Кроме того сочетание CB фьюжн комплекс с индуцибельной характер системы контролируемой тетрациклин transcriptional активации (Тето) позволяет выражение индуцибельной и контролируемых трансген в реверсивные мода2. Хотя полезно во многих случаях, полное исключение генов или белков в естественных условиях может привести к летальность4,5,6. Аналогичным образом ткани конкретным, условного удаления некоторых генов или белки, с использованием системы Cre/Lox не может быть простым, как это в конечном счете, приведет к постоянной потере критических геномной элементы7. Таким образом, в зависимости от гена или POI, ни один из этих подходов будет эффективным в предоставлении полезной моделью для последующих исследований, особенно генов или белки функциональных исследований в конце послеродового и взрослых мышей.
Чтобы обойти проблемы, связанные с такими подходами и обеспечить доказательство принципа эффективности предложенного метода, мы выбрали для тестирования метода, представленные здесь, создавая условный DN версию белка ретинобластомы 1 (RB1). Несколько вариантов были предлагаемые8,9,10 отменить функцию эндогенного RB1; Однако, все они сталкиваются некоторые из те же ограничения, обсуждавшиеся выше: исключить постоянное микрофлорой RB1 embryonically смертельной, и, в соответствии с его опухоль подавитель роль, постоянного RB1 условного удаления приводит к различных опухолей11. Даже несмотря на то, что версия DN RB1, как представляется, не происходят естественно, лучшей альтернативы для имеющихся в настоящее время стратегии позволяют временно контролируемых инактивации эндогенного RB1 и предоставить альтернативный механизм в конечном итоге восстановить ее функция. Основой для такой конструкции был описан более двух десятилетий назад1. Однако из-за технологических ограничений, это не механизм для активации управления трансген, ответ и специфика ткани. Это исследование является первым, чтобы совместить элегантность доксициклин (Dox)-зависимых транскрипционный анализ системы с конструкцией инженерии трансгенных лизосомальных протеазы CB и Rb1 белков. Полученная в результате модель мыши НАСВВП позволяет временно регулируемых Dox опосредованной RB1 правила2. Преимущество использования такого подхода, основанного на протеома для изучения функции гена является, что он может быть принят для любого гена интереса, с минимальной информации о своей деятельности.
Предлагаемая стратегия трансген DN имеет много преимуществ над традиционными подходами. Во-первых DN белка ингибирование приводит к только частичное абляции активности белка, таким образом, сохраняя остаточного эндогенного выражение. Такой результат является весьма желательным в ситуациях, где полная ликвидация деятельности белка приводит к эмбриональной летальность, значительно ограничивает любое расследование для изучения функции гена в живой мыши. Во-вторых наличие системы Тето позволяет трансген активации только в присутствии антибиотик, который позволяет для эффективной и обратимым контроль деятельности трансген. Таким образом путем прекращения антибиотиков, трансгенных система может быть отключена, и нормальное выражение RB1 обратно на место. В-третьих специфика трансген выражение может варьироваться в зависимости от промоутера выбора. В то время как мы выбрали вездесущие Роза-CAG промоутер для доказательства в принципе, поместив трансген под ткани конкретной промоутера, скорее всего ограничить нежелательные трансген выражение и облегчения исследования терапевтического применения этой трансген методология.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Поколение трансгенные мыши НАСВВП и ухода за животными и эксперименты, связанные с исследованием были одобрены Крейтон университета институциональный уход за животными и использования Комитет (IACUC) и осуществляется их руководящих принципов.
1. трансгенных CB-Myc6-Rb1 конструкции
Примечание: Клонирование НАСВВП в pTet_Splice вектор было сделано в рамках многоэтапного процесса (рис. 1A и 1B).
-
Выполните первый этап клонирования в pCS2 + CB-Myc6 вектора.
- Чтобы создать конструкцию НАСВВП трансген, усиливают фрагмент cDNA Rb1 1583-ВР Лонг (528 аминокислоты, соответствует аминокислота региона 369-896) белка RB1, используя следующие грунтовка: для EcoRI +РБ 1243F, используйте GGGGAATTCA TTAAATTCAGCAAGTGATCAACCTTCи XbaI + EcoRV +РБ 2826R, используйте CCCTCTAGATATCTATTTGGACTCTCCTGGGAGATGTTTACTTCC.
- Клон фрагмент создан (1546 bp) между EcoR1 и XbaI места ограничения pCS2 + вектор CB-Myc6 как описано в1,12.
Примечание: 1012-ВР долго CB-Myc6 конструкцию (337 аминокислоты) снаряжен Rb1 -фрагмент привели в протеине примерно 865 аминокислот (около 108 кДа), который является немного меньше, чем эндогенного белка RB1 (~ 110 кДа) (рис. 1 ), С тегом6 CB-Myc на N-конечная и Rb1 в C-terminus.
-
Выполните второй этап subcloning в pTet-Splice вектор.
- Усилить фрагмент слияния CB-RB-Myc6 и получить тет промоутер, усиливают кассеты, состоящий из CB-myc6-Rb1 с праймерами, содержащий EcoRV (XbaI + EcoRV + РБ 2826R) и Сали сайты: для Сали +CBF, Использование CCAGTCGACAGGATGTGGTGGTCCTTGATCCTTC.
- Subclone созданный фрагмент (2567 bp) в pTet-Splice вектор, между Сали и EcoRV места ограничения, таким образом, что весь Тето-DN-CB-myc6-Rb1 трансген, включая SV40 Интрон и поля сигнала, могут быть изолированы посредством одного пищеварение с персо (рис. 1Б).
Примечание: Ноти фрагмент был использован для создания трансгенных спонсоров.
2. в Vitro тестирование Тето DN-CB-myc6-Rb1 трансген
-
DOX положение: Линия клетки NIH3T3
Примечание: Если не указано иное, все тома были скорректированы для 6-ну плиты.- Растут NIH3T3 клетки после спецификации поставщика, используя рекомендованные клетки культуры носителя, содержащего 10% плода бычьим сывороточным при 37 ° C с 10% CO2.
- Cotransfect клетки с pTet соединитель и векторов pCMV-Tet3G (из шага 1) за 24 ч. Выполните шаги, указанные ниже для cotransfection.
- Смешайте 2 – 4 мкл Реагента/скважины на основе липидов transfection и 1 мл из неполной (без сыворотки) Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM) за 5 мин при комнатной температуре. Для 12 - или 24-ну плиты используйте 250 или 500 мкл культуры средств массовой информации, соответственно и отрегулируйте громкость реагент трансфекции соответственно.
- Добавить 2-3 мкг плазмидной ДНК/хорошо трансфекции реагент DMEM и проинкубируйте втечение 20 мин при комнатной температуре.
- Добавьте смесь, содержащую ДНК и трансфекции реагента в среде DMEM для каждой скважины. После 3-4 ч инкубации добавьте 1 mL полной СМИ (так что окончательный объем 2 мл/хорошо). Держите аликвоты Dox акций (1 мг/мл) и добавить 2 мкл в каждом из скважины (+ Dox). Инкубируйте клетки при 37 ° C с 5% CO2.
Примечание: Примеры элементов управления должен состоять из cotransfected клеток, не получавших Dox (-Dox), а также NIH3T3 клетки transfected только с transactivator pCMV-Tet3G вектора и относиться с Dox в течение 24 ч. Для pCMV-Tet3G, концентрации 0,1-1 мкг/мл Dox должно быть достаточно, чтобы побудить трансген выражение.
-
Протестируйте обратимости конструкции, используя линии клетки HEK293.
- Для тестирования обратимости Тето-DN-CB-myc6-Rb1 трансген, культуры HEK293 клетки в орла минимум основных средних (EMEM) после спецификации производителя и cotransfect с pTet соединитель и pCMV-Tet3G векторов на 24 часа, как описано выше (шаг 2.1.2).
- Для дезактивации трансген удалите Dox содержащих СМИ после 24 ч, мыть x-3 x 2 клетки с-фосфатный буфер (PBS) и инкубировать их в Dox свободных СМИ на дополнительные 24 часа.
Примечание: Dox-удаления трансген инактивации и регулярные белков должна быть возобновлена в течение этого периода 24 h.
-
Чтобы оценить функциональность Тето-DN-CB-myc6-Rb1 конструкции в содействии незапланированные пролиферации, выполняют функциональный анализ с использованием клеток линии HEI-OC1, как описано ниже.
- Культура клетки HEI-OC1 в 10% DMEM под разрешительной условия (33 ° C с 10% CO2). Для исследования распространения клеток подсчитать ячейки, используя счетчик соматических клеток и пластины 10000 HEI-OC1 клетки на 96-луночных тарелку в объеме 200 мкл. Инкубируйте клетки на ночь.
- На следующий день, выполняют временные cotransfection pTet соединения и pCMV-Tet3G векторов с использованием реагентов на основе липидов трансфекции (см. шаги 2.1.2). В отдельной скважины выполняют pmR-ZsGreen1 трансфекции at2-мкг с помощью трансфекции липидных реагента (шаги 2.1.2) для расчета ставки transfection. Использование не transfected клеток как элементы управления.
- Определить наличие зеленой флуоресценцией под флуоресцентным микроскопом (возбуждения = 485 Нм, выбросов = 530 Нм) для transfected клеток 24 ч после transfection. Запись наличие или отсутствие зеленого флуоресценции и рассчитать ставку трансфекции как общее количество GFP-положительных клеток (transfected клеток) над клетки, помечены DAPI (всего клетки).
Примечание: Мы оценили трансфекции ставка ~ 70%. - Чтобы побудить трансген выражение, добавить 1 мкг/мл Dox подмножество transfected клеток при использовании других подмножества как управления (-Dox). Использование необработанной HEI-OC1 клетки как дополнительные элементы управления.
- Чтобы оценить пролиферации клеток, используйте комплект распространения клеток согласно протоколу производителя.
- В краткой 48 ч после трансфекции, удалите средство культуры клеток и 100 мкл 1 x краска привязки решения к каждой скважины микроплиты. Инкубировать 1 час при температуре 37 ° C.
- После этого, измеряют интенсивность флуоресценции каждого образца с помощью Считыватель микропланшетов флуоресцирования (возбуждения = 485 Нм, выбросов = 530 Нм).
- Для дальнейшей оценки пролиферации клеток с помощью immunocytochemistry, пластина HEI-OC1 клетки на покрытие стекла в пластине 12-Ну и Инкубируйте на ночь на 37 ° C.
- На следующий день cotransfect с pTet соединения и pCMV-Tet3G и выполнять Dox лечения (+ Dox). Используйте untransfected клетки как элементы управления. Процесс вуза-OC1 клетки для маркировки Ki-67.
- Исправьте клетки с параформальдегида 4% (PFA) в PBS, рН 7,4, за 10 мин при комнатной температуре. Вымыть клетки 3 x с ледяной PBS и инкубации клеток в 0,25% неионные моющего средства в PBS на 10 мин.
- Вымыть клетки снова, 3 x в PBS на 5 мин и блока с помощью 10% сыворотки в камере увлажненные за 1 ч при комнатной температуре.
- Инкубировать клетки в 500 мкл основное антитело Ki-67 (разбавления 1: 200) для 3 ч при комнатной температуре или на ночь при 4 ° C.
- Вымыть клетки 3 x 5 мин с PBS. После этого инкубации клеток с вторичное антитело за 1 ч при комнатной температуре в темноте.
- Удаление решения вторичного антитела и вымыть клетки 3 x с PBS для 5 мин в темноте.
- Фаллоидин маркировки, Инкубируйте HEI-OC1 клеток в 1: 200 Фаллоидин за 30 мин. Чтобы пометить ядер клеток, инкубации клеток с 5 мкг/мл DAPI 10 мин при комнатной температуре.
Примечание: Убедитесь, что краска конъюгата Фаллоидин отличается от вторичного антитела конъюгата.
3. поколение /ROSA-CAG-rtTA НАСВВП++ (НАСВВП) трансгенных мышей и Vivo тестирование DN-НАСВВП подход
- После подтверждения эффективного регулирования Dox Тето-DN-CB-myc6-Rb1 трансген очищают Ноти фрагмент и microinject их в мыши зигот, которые позже переносятся в псевдо-беременных самок.
Примечание: Эти процедуры были проведены в университете штата Небраска медицинский центр (UNMC) мыши генома инженерных Core объекта. - После родов, генотип, установить щенков, используя праймер для региона фьюжн CB-Rb1 : для НАСВВП F, используйте 5' CTGTGGCATTGAATCAGAAATTGTGGCTGG 3′, а для НАСВВП R, 5′ GTACTTCTGCTATATGTGGCCATTACAACC 3′.
Примечание: Размер продукта PCR, наблюдается на геле агарозы-401 bp (60-ВР CB регион + 341-ВР Rb1 региона (таблица 1). Были определены десять независимых основатель линии, основанный на присутствие трансген Тето-DN-CB-myc6-Rb1 . В пяти из этих линий потомства унаследовал трансген, который подтвердил передачу микрофлорой трансген. В конечном итоге один из трансгенных линий использовался для установления и поддержания линии и создания экспериментальных животных Тето-DN-CB-myc6-Rb1 для дальнейших исследований. - Порода взрослых Тето-DN-CB-myc6-Rb1 мышей линии индуктором тетрациклин Роза-CAG-rtTA (фондовой #006965) (в качестве альтернативы, порода к линии индуктором tTA) для создания экспериментальной DN-НАСВВП мышей. Генотип потомство это крест используя следующий набор грунтовка: для rtTA-WT-R, используйте GGAGCGGGAGAAATGGATATG; для rtTA мутант R используйте GCGAGGAGTTTGTCCTCAACC; и для rtTA общем, используйте AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT. Размеры продукта ПЦР – 340 340 bp (мутанты), bp и 650 bp (гетерозиготности) и 650 bp (одичал тип).
- Создание кривой доза ответ после лечения Dox определить время и длительность лечения Dox необходимо выявить трансген выражения протеина RB1.
Примечание: В этом эксперименте Западная помарка и qRT-PCR были использованы для оценки ткани конкретных трансген активации и RB1 выражение. - Выполняют флуоресценции в situ гибридизация (рыбы) для подтверждения геномной вставки трансген.
Примечание: Это была проведена в центре применяется геномики госпиталя для больных детей (Торонто, Канада). ELISA или Западный blotting (с помощью белка специфические антитела) может использоваться для оценки активации трансген, ткани специфика и изменения уровня эндогенного POI. Для построения DN-CB-myc6-Rb1 мы использовали антитела анти RB1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Как правило проектирование DN мутация требуется значительное количество информации о структуре и функции POI. В отличие от DN стратегия, представленная здесь особенно полезна, когда структурной и функциональной информации для POI ограничен. Если Пои multimeric белок, слияние одного подразделения для лизосомных протеазы преимущественно может ингибировать собрал multimer и, возможно, другие лиганды путем сочетания протеолиза эндогенного подразделений и внутриклеточных утечки multimer к Лизосома. Чтобы подтвердить успешное клонирование и проверить эффективность Dox регулируемых трансген активации, очищенный pTet-Splice плазмида, содержащий Тето-DN-CB-myc6-Rb1 конструкции был transfected в мыши NIH3T3 клетки, которые стабильно выразил rtTA белок, но не Rb113. В отсутствие Dox выражая rtTA ячеек выражение не RB1, тогда как выражение надежные RB1 наблюдался в присутствии Dox (рисA). Далее, чтобы проверить реверсивность системы, мы cotransfected HEK293 клетки (которые эндогенно Экспресс Rb114) с очищенной pTet-Splice /Тето-DN-CB-myc6-Rb1 и pCMV-Tet3G векторов. Как и ожидалось, выражение эндогенного белка RB1 был значительно тормозится на трансген активации добавлением Dox в средствах культуры клеток (рис. 2B). Для тестирования реверсивность системы, после периода 24 ч, в подмножество HEK293 клеток, мы заменили Dox содержащих клеток культуры средств массовой информации с свежими Dox свободных СМИ и инкубировали клетки для дополнительных 24 h., поддерживая Dox регулируемых обратимости, RB1 выражение было восстановлено после удаления Dox носителя культуры (рис. 2B). Transfected клеток HEK293, которые не обращались с Dox или transfected клеток Dox лечение HEK293 с pCMV-Tet3G вектора только (рис. 2B) показали базальный уровень эндогенного RB1 выражения. Потому что NIH3T3 клетки не выразить RB1 белка, естественно, позитивные реактивности RB1 — вследствие накопления трансгенных RB1 белка. Учитывая наш интерес в потенциальных пролиферативной эффект Тето-DN-CB-myc6-Rb1 конструкции в слуховой системе, мы измерили общего содержания ДНК в pTet-Splice /Тето-DN-CB-myc6-Rb1- и pCMV-Tet3G-transfected HEI-OC1 клетки () внутреннее ухо орган Корти производные клеточной линии) в присутствии и отсутствии Dox. В соответствии с рабочей гипотезы, представленные здесь, было отмечено значительное увеличение содержание ДНК (соответствующее увеличение количества клеток) в Dox лечение, но не лечения (управления) transfected HEI-OC1 клеток (рис. 3A - 3 C ).
После подтверждения в пробирке трансген деятельности и функции была создана модель трансгенные мыши. РЫБА, используя Тето-DN-CB-myc6-Rb1 digoxigenin (DIG)-пероксидазой (ПХ) / тирамин биотин/авидин Cy5-меченых зонд и G-диапазонов splenocytes и уха фибробластов самцов мышей были выполнены для подтверждения трансген вставки в геном трансгенных мышей. Среди пяти учредителей передачи микрофлорой, линия 14 показали последовательную трансген вставки в пределах сегмента 10C 3 ~ D2 (рис. 4A - 4 C). Мышей от этой линии были использованы для установить разведения колоний и создания экспериментальных животных для дальнейших исследований. Чтобы определить оптимальное время для Dox индукции и Тето-DN-CB-myc6-Rb1 трансген активации, мы разделили трансгенных мышей на три различные группы, в котором Dox вводили в питьевой воде для переменной длины времени: Группа 1 (3 дня лечения), Группа 2 (7 дней лечения) и Группа 3 (10 дней лечения). После завершения лечения изменения в выражении протеина RB1 были оценены западных blotting (Рисунок 5A - 5 D). Потому что DN и родной RB1 белки имеют аналогичные молекулярным весом, они не могут решаться друг от друга на западную помарку. Однако в соответствии с увеличением первоначальной RB1 белка (вследствие накопления DN-RB1 и эндогенных белков), было увеличение первоначального общего выражения протеина RB1 в cochleae трансгенные мыши, по сравнению с контрольной группой (рис. 5 A). Кроме того, в соответствии с тормозящее и протеолитической активности Тето-DN-CB-myc6-Rb1 трансген продукта, количественно RB1 выражение наблюдалось снижение в группы 2 и 3, по сравнению с группы 1 и управления группами ( Рисунок 5A - 5 D). Следует отметить лечения более чем 10 дней не завершились каких-либо дальнейших изменений в выражении протеина RB1. Таким образом 10 дней лечения Dox был рассмотрен оптимальный и используется для дальнейшего исследования.
Потому что rtTA и, следовательно, Тето-DN-CB-myc6-Rb1 трансген активации под вездесущие Роза-CAG промоутер, RB1 может потенциально препятствует в любой ткани или клетки, где RB1is эндогенно выражено (например, легкие, сердце, сетчатки). Для тестирования этой предпосылки и оценить специфичность ткани трансген, cochleae, легкие, сердце и глаза биопсии были расчленены от TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA, и были управления мышей (не нося трансген Роза-CAG-rtTA ) оценку RB1 выражение (рис. 6A - 6 C). Независимо от того, проанализированы ткани наблюдалось значительное снижение в RB1 белка в TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA , но не в группе контроля(рис. 6). В противоположность, qRT ПЦР анализ в глаза, сердце и cochleae Dox лечение TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA и соответствует возрасту управления мышей показало значительное upregulation Стенограмма DN-НАСВВП в тканях бывшего но не Последняя мышь (рис. 6C). В целом эти результаты подтверждают эффективность конструкции. Увеличение Стенограмма выражение отражает эффективное Dox регулируемых трансген индукции. Кроме того снижение экспрессии белка согласуется с маршрутизации и протеолитических деградации эндогенного RB1.
Рисунок 1: многоэтапный клонирование НАСВВП и поколения индуцибельной TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA. (A) группа показывает клонирование фрагмента Rb1 в вектор pCS2-CB-Myc6 . 1583-ВР Rb1 гена продукт был усиливаются с помощью EcoRI + RB1243 вперед и Xba + EcoRV + RB2826 обратный праймеры PCR. Результирующий фрагмент Rb1 был клонирован между EcoRI и Xbal места ограничения pCS2 вектора, содержащего CB-Myc6 конструкции для создания векторных pCS2 + CB-myc6 + Rb1 . Фрагмент (.B) CB-myc6 + Rb1 был клонирован в pTetSplice вектор между сайтами ограничение Сали и EcoRV . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Эффективность активации Dox регулируемых трансген. (A) NIH3T3 клетки обычно не выражают RB113. Подтверждением эффективности активации Тето-DN-CB-myc6-Rb1 конструкции, Западный анализ помаркой с антитела анти RB1 показали надежную RB1 выражение присутствии Dox (дорожки 1 и 3), но не в его отсутствие (дорожки 2 и 4). (B) HEK293 клетки, которые эндогенно Экспресс Rb114, были cotransfected с Тето-DN-CB-myc6-Rb1 и pCMV-Tet3G transactivator вектора. В отсутствие Dox (полоса 1) было отмечено позитивное выражение RB1. Добавление Dox в системе вызвало Тето-DN-CB-myc6-Rb1 активации и RB1 Даунрегуляция (пер. 2). RB1 выражение было возобновлено 24 ч после Dox был удален из СМИ (пер. 3). C = контроль, untransfected HEK293 клетки, не получавших Dox. Это адаптация с фигурой, первоначально опубликовано в журнале границ в клеточном неврологии2. Его воспроизведение соглашается с границ«политики на авторов» авторского права удержания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Dox опосредованной DN-НАСВВП трансген активация увеличивает пролиферации. (A) HEI-OC1 клетки cotransfected с очищенной Тето-DN-CB-myc6-Rb1, и pCMV-Tet3G векторов были культивировали в отсутствие (−) или наличие (+) Dox. Пролиферация клеток был определен 48 ч после трансфекции, с помощью анализа распространения. Изменения в процентах распространения была рассчитана с использованием изменения в значениях флуоресценции с untransfected клетки как элемент управления. Скромный, но значительное увеличение количества клеток наблюдалось в transfected клеток, после лечения Dox. В отличие от этого, никаких существенных изменений не наблюдались между transfected клеток HEI-OC1 Dox не относиться с (−) и untransfected управления. (B) untransfected ХЕЙ-OC1 клетки или (C) cotransfected с очищенной Тето-DN-CB-myc6-Rb1 и pCMV-Tet3G векторов, культивируемых в присутствии (+) Dox были помечены Ki-67 (красный), Фаллоидин (зеленый) и DAPI (синий). P < 0,05. Шкалы бар = 10 мкм. Это адаптация с фигурой, первоначально опубликовано в журнале границ в клеточном неврологии2. Его воспроизведение соглашается с границ«политики на авторов» авторского права удержания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Флуоресцентные в situ гибридизация (рыба) подтверждение геномной вставки трансген Тето-DN-CB-myc6-Rb1 . PCS2-НАСВВП (digoxigenin зонд/анти-DIG-ПХ/tyramide биотин/авидин Cy5, в красном) пробник был гибридизированных splenocytes и уха метафаза клетки фибробластов чтобы увидеть, если сигнал зонда может быть обнаружены или не с одной копии целевого Вставка размером 2,5 КБ. PCS2-НАСВВП пробник гибридизированных к одной хромосома 10 с яркими, Дуплет зонд сигналы, которые показали вставки Тето-DN-CB-myc6-Rb1 трансген в пределах сегмента 10 C 3-D2. RP23 - 267G 24 (спектра зеленый) зонд контроля гибридизированных к хромосома 10 на группы 10A1 как ожидаемый и подтвердил, что ДНК НАСВВП интерес вставлен в хромосома 10. (A) Эта панель показывает G-группа метафаза. (B) Эта группа показывает изображение рыбы амплификации (TSA) сигнала tyramide от же метафаза как показано на панели A. (C) Эта группа показывает составного изображения хромосома 10 показаны (1) G-диапазонов, рыбы (2) TSA, и (3) TSA рыбы с инвертированным DAPI диапазонов. Красный = pCS2-НАСВВП зонд; синий = DAPI диапазонов; Зеленый = RP23 - 267G 24 управления зонд. Шкалы бар = 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : DN-НАСВВП трансген активации во внутреннем ухе послеродовой (P) 36 TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA+ (НАСВВП+) и Роза-CAG-rtTA+ (НАСВВП−) мышах после 3 (Группа 1), 7 (Группа 2) и 10 (Группа 3) дней Dox лечение. (A-C) Анти-RB1, который реагирует с hyperphosphorylated и hypophosphorylated формами RB1, как хорошо как анти c-myc антитела были использованы для обнаружения. Денситометрических анализ был проведен с использованием ImageJ программного обеспечения. Получены соответствующие значения были нормализованы в отрицательный контроль НАСВВП− (-) и затем к β-миозина. Относительные уровни выражения RB1 показываются под каждое пятно. (D) Графическое представление нормализованных уровни выражения RB1 заговор против освещаются ниже RB1 обнаружения различных методов лечения в НАСВВП+ (+) образцов. Каждый Лейн на западной помарке гель и каждый столбец на графическом соответствуют разные личности. P < 0.05.This рисунок был первоначально опубликован в журнале границ в клеточном неврологии2. Его воспроизведение соглашается с границ«политики на авторов» авторского права удержания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6 : Пространственный анализ TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA активации трансген P18 TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA+ (+) и DN-НАСВВП+/Роза-CAG-rtTA− негативный контроль (-) мышах сердца, глаз, легких и улитки. (A) подтверждение эффективности трансген Dox опосредованной активации, проявление эндогенных RB1 был downregulated в НАСВВП+/Роза-CAG-rtTA+ тканей, но не в тканях мышей отрицательного контроля. Денситометрических анализ был выполнен как описано на рисунке 5. Относительные уровни выражения RB1 показываются под каждое пятно. (B) этой панели отображается графическое представление нормализованных уровни выражения RB1, заговор против различных тканей. Межличностных вариация на эндогенные RB1 уровнях могут объяснить различия в отдельных ответах трансген активации и RB1 даунрегуляция. (C) ПЦР-анализ в глаза, сердце, и cochleae показал значительный upregulation TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA стенограммы в тканях Dox лечение TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA+ , но не в DN-НАСВВП+/Роза-CAG-rtTA− негативный контрольной группы. /RtTA НАСВВП++ = TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA+; НАСВВП−/rtTA+ = Роза-CAG-rtTA+; P < 0,05. Эта цифра была опубликована в журнале границ в клеточном неврологии2. Его воспроизведение соглашается с границ«политики на авторов» авторского права удержания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Таблица 1: ПЦР условие, используемое для проверки CB-Rb1 регион фьюжн.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Чтобы обойти ограничения, связанные с традиционными трансгенных стратегии, мы стремились создать модель мыши, в котором эндогенного POI могут быть условно инактивированная экспрессирующих DN мутантные формы его на основе пространственно-временных. Чтобы отменить функцию эндогенного POIs, несколько вариантов были предлагаемой15,16,17. Мы изменили ранее генетическая стратегия1 путем объединения Dox зависимых транскрипционный анализ системы простой стратегии, используя сочетание лизосомальных протеазы CB для создания мутантных пептид, выражением которого влияет на выражение эндогенные POI2. Самое главное этот метод требует никаких предварительных знаний о пути, связанные с POI. Текущая стратегия для ингибирования белка DN демонстрирует, что сигнал лизосомальных локализации на фьюжн ген НАСВВП отвлекает весь комплекс взаимодействующих РБ к Лизосома2,3. Раз внутри Лизосома, инициируется протеолитических обработки этих белков, привело к их деградации3. Встроенные свойства CB-кварцевое белка, связанные с обратимым inducibility Тето системы, делает это полезной альтернативой традиционным трансгенных стратегии (например, полный геном нокаут, условного удаления), особенно когда полное удаление гена интереса не является желательным.
Мы первоначально посвящены исследования RB1 белка. DN мутации являются наиболее легко описано в белки, которые функционируют как димер или мультимеры. На сегодняшний день, нет никаких доказательств прямого физического взаимодействия между молекулами RB1. Тем не менее присущие природе своей деятельности позволяет наличие нескольких RB1 молекул в том же комплексе в заданное время. Например привязка hypophosphorylated RB1 E2F1-DP гетеродимера обеспечивает дополнительные привязки сайта, который обычно занимают гистоновых деацетилаз (ГДАЦ)18,19,20. С другой стороны HDAC1 физически взаимодействует с RB1, и в свою очередь, этот комплекс связывается E2F1-DP-RB1 heterotrimer, обеспечивая тем самым дополнительный транскрипции репрессий18. Согласно такой подход если по крайней мере один из RB1 молекул в группе DN мутант, он будет препятствовать комплекс репрессии транскрипции, в то время как он снижает уровень эндогенного RB1, таким образом вызывая фенотип RB1-null. Здесь эндогенного RB1 Ингибирование наблюдалось через 10 дней после отправления Dox в питьевой воде. Оптимальная доза Dox индукции может однако, должны определяться эпирически для каждой системы. Кроме того поскольку большая часть последовательности гена Rb1 была использована на конструкцию макияж, вполне возможно, что даже в отсутствие эндогенного RB1, мутант RB1 может взаимодействовать с и вызывают ингибирование DN любого из партнеров привязки RB1. Эта посылка может быть проверена путем оценки уровня выражения известных RB1-связывания молекул.
Столь необходимые, тонко регулируемых временное и обратимое белка инактивации обеспечит основу для разработки широкого спектра исследований в даже более широкое количество исследований поля поиска, чтобы пролить свет на сложных биохимических механизмов лежащие в основе различные аспекты генной инженерии и proteinactivity. В зависимости от POI понимание молекулярных сложности, вероятно улучшить способность исследователей разработки успешных терапевтических стратегий. Увеличение трансген специфичности может быть достиган разведение DN мыши ткани конкретных промоутеров, вождение tTA или rtTA линии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
PCS2 + CB-Myc6 вектор был подарок от Хорвитц Маршалл (Вашингтонский университет, Сиэтл, Вашингтон, США). ХЕЙ-OC1 клетки были любезно предоставлены Fedrico Kalinec (Дэвид Геффен школа медицины, Калифорнийского университета, Лос-Анджелес, Калифорния, США). Техническая поддержка была оказана UNMC мыши генома инженерных ядро (К.Б. Gurumurthy, Дон Хармс, Rolen Quadros) и Крейтон университета комплексной биомедицинских изображений объекта (Richard Hallworth, Джон Billheimer). UNMC мыши генома инженерных была поддержана институционального развития Award (IDea) от NIH/NIGMS, предоставьте номер P20 GM103471. Интегрированный биомедицинских изображений объекта было поддержано Крейтон университета Школа медицины и грантов, GM103427 и GM110768 от NIH/NIGMS. Объект был построен при поддержке грантов от национального центра для исследования ресурсов (RR016469) и NIGMS (GM103427). Мыши линии, созданные в этом исследовании были сохранены на Крейтон университета животных ресурсов Фонда, инфраструктура которой была улучшена посредством гранта NIH/NCRR G20RR024001. Эта работа получила в прошлом поддержка через низ/NCRR 5P20RR018788-/ низ/NIGMS 8P20GM103471 КОБРЕ предоставить (Shelley д. Смит), NIH/ORIP R21OD019745-01A1 (Ш.М.Р-S.) и возникающих исследовательский грант от фонда здравоохранения слушания (для S. таранг). Содержание этого исследования является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения национальных институтов здоровья.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM | GIBCO-BRL | 11965-084 | |
| Minimum Essential Medium Eagle, MEME | Sigma | M8042 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442 | |
| Lipofectamine | DharmaFECT | T-2010-03 | |
| Sal I | Roche | 11745622 | |
| EcoRV-HF | New England BioLabs | R3195S | |
| NotI | Roche | 13090730 | |
| CaspaTag | Millipore | APT523 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Staurosporine | Sigma | S4400 | |
| CyQuant NF cell proliferation kit | Invitrogen | C35007 | |
| Retinoblastoma 1 antibody | Abcam | Ab6075 | |
| c-Myc antibody | Sigma | M5546 | |
| b-actin | Sigma | A5316 | |
| Ki-67 | Thermofisher scientific | MA5-14520 | |
| Phallodin | Thermofisher scientific | A12379 | |
| Fluorescence microplate reader | FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech | ||
| Epifluorescence microscope | NikonEclipse80i | ||
| The TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) mouse line is available from the Jackson Laboratory as JAX#032011. |
References
- Li, F. Q., et al. Preferential MyoD homodimer formation demonstrated by a general method of dominant negative mutation employing fusion with a lysosomal protease. Journal of Cell Biology. 135 (4), 1043-1057 (1996).
- Tarang, S., et al. Generation of a retinoblastoma (rb)1-inducible dominant-negative (DN) mouse model. Frontiers Cellular Neuroscience. 9 (52), (2015).
- Kominami, E., et al. The selective role of cathepsins B and D in the lysosomal degradation of endogenous and exogenous proteins. FEBS Letters. 287 (1-2), 189-192 (1991).
- Cortellino, S., et al. Defective ciliogenesis, embryonic lethality and severe impairment of the sonic hedgehog pathway caused by inactivation of the mouse complex A intraflagellar transport gene Ift122/Wdr10, partially overlapping with the DNA repair gene Med1/Mbd4. Developmental Biology. 325 (1), 225-237 (2009).
- Ferreira, C., et al. Early embryonic lethality of H ferritin gene deletion in mice. Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3021-3024 (2000).
- Lee, E. Y., et al. Mice deficient for rb are nonviable and show defects in neurogenesis and haematopoiesis. Nature. 359 (6393), 288-294 (1992).
- Turlo, K. A., et al. When cre-mediated recombination in mice does not result in protein loss. Genetics. 186 (3), 959-967 (2010).
- Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).
- Zhang, J., et al. The first knockout mouse model of retinoblastoma. Cell Cycle. 3 (7), 952-959 (2004).
- Zhao, H., et al. Deletions of retinoblastoma 1 (Rb1) and its repressing target S phase kinase-associated protein 2 (Skp2) are synthetic lethal in mouse embryogenesis. Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10201-10209 (2016).
- Yamasaki, L., et al. Loss of E2F-1 reduces tumorigenesis and extends the lifespan of Rb1(+/-) mice. Nature Genetics. 18 (4), 360-364 (1998).
- Li, F. Q., et al. Selection of a dominant negative retinoblastoma protein (RB) inhibiting satellite myoblast differentiation implies an indirect interaction between MyoD and RB. Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5129-5139 (2000).
- Pitkanen, K., et al. Expression of the human retinoblastoma gene product in mouse fibroblasts: Effects on cell proliferation and susceptibility to transformation. Experimental Cell Research. 207 (1), 99-106 (1993).
- Chano, T., et al. Neuromuscular abundance of RB1CC1 contributes to the non-proliferating enlarged cell phenotype through both RB1 maintenance and TSC1 degradation. International Journal of Molecular Medicine. 18 (3), 425-432 (2006).
- Kole, R., et al. RNA therapeutics: Beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (2), 125-140 (2012).
- Yamamoto, A., et al. The ons and offs of inducible transgenic technology: A review. Neurobiology of Disease. 8 (6), 923-932 (2001).
- Houdebine, L. M., et al. Transgenic animal models in biomedical research. Methods in Molecular Biology. 360, 163-202 (2007).
- Brehm, A., et al. Retinoblastoma protein recruits histone deacetylase to repress transcription. Nature. 391 (6667), 597-601 (1998).
- Lu, Z., et al. E2F-HDAC complexes negatively regulate the tumor suppressor gene ARHI in breast cancer. Oncogene. 25 (2), 230-239 (2006).
- Magnaghi-Jaulin, L., et al. Retinoblastoma protein represses transcription by recruiting a histone deacetylase. Nature. 391 (6667), 601-605 (1998).
