Summary
Burada içinde protein var koşullu olarak ters bir baskın negatif mutant yorum overexpressing tarafından inaktive bir baskın negatif indüklenebilir sistemi geliştirmek için bir iletişim kuralı mevcut.
Abstract
Baskın-negatif (DN) protein inhibisyonu protein işlevi işlemek için güçlü bir yöntemdir ve diğer genom tabanlı yaklaşımlar birkaç avantaj sunar. Örneğin, her ne kadar chimeric ve hedefleme stratejileri yaygın olarak kullanıldığını Cre-LoxP , bu stratejileri (Sızıntılı organizatörü etkinlik, mozaik Cre ifade, vb) iç sınırlamaları önemli ölçüde sınırlı onların uygulama. Ayrıca, birçok endojen genlerin tam silme postnatal hayatta gen işlevini incelemek imkansız hale embryonically, ölümcüldür. Bu sorunları ele almak üzere, biz erken bir genetik mühendisliği protokolü için yapılan önemli değişiklikler ve kısa bir (transgenik) sürüm Rb1 gen lizozomal bir proteaz ile kombine procathepsin B (Rb1 bir DN fare modeli oluşturmak için CB), (CBRb). Lizozomal bir proteaz varlığı nedeniyle, tüm CB-RB1 füzyon protein ve onun etkileşen karmaşık proteasome-aracılı bozulması için yönlendirilir. Ayrıca, tetrasiklin uyarıcı (rtTA) elementini transgenik yapısında varlığını indüklenebilir ve tersinir yönetmelik RB1 protein sağlar. CBRb fare modelindeki her yerde ROSA-CAG Organizatör varlığı nerede RB1 ifade edilir geçici ve tersinir Rb1 gen ablasyon taşımak ve araştırmacılar faaliyete hemen hemen herhangi bir hücreye anlamak için bir kaynak sağlamak için yararlı bir araç yapar.
Introduction
Genellikle tam ortadan kaldırılması veya kesme gen, RNA dizileri veya protein (POI) ilgi neden kalıcı süreçleri, çoğu yaklaşımlar gen ve protein ablations amaçlayan güveniyor. Bu yöntem genel amacı endojen, vahşi tipi proteinin işlev kaldırılması için Rekombinant protein mühendisi etmektir. Biz revisited ve geçici ablasyon poi DN inhibisyonu yoluyla izin veren bir alternatif strateji1,2, revamped. Bu yöntem inşaat için her ikisi multimeric ve monomeric peptidler ama multimeric derlemesinde işlev proteinler için uygundur.
Yöntem bir multimeric POI (CB füzyon karmaşık) bir alt birim için lizozomal proteaz CB eritme oluşur. Sonuç CB füzyon karmaşık ile etkileşim ve proteolytically endojen protein sindirimi veya bozulmuş3olmak lysosome için tüm CB-POI karmaşık aktarma. Ayrıca, CB füzyon karmaşık bir birleşim tetrasiklin kontrollü transkripsiyon harekete geçirmek (TetO) sistem indüklenebilir doğası ile geri dönüşümlü moda2transgene indüklenebilir ve kontrollü bir ifade sağlar. Birçok durumda yararlı olsa da genleri veya proteinler içinde vivo tam silinmesine ölümcül4,5,6' neden olabilir. Bu sonuçta, kritik genomik elements7kalıcı kaybına yol açacaktır aynı şekilde, bazı genlerin veya Cre/Lox sistemini kullanarak proteinler doku özgü, koşullu silinmesine basit, olmayabilir. Bu nedenle, gen veya POI bağlı olarak, bu yaklaşımlardan hiçbiri sonraki çalışmaları için uzun bir faydalı model sağlanmasında etkili olacaktır özellikle genler veya protein fonksiyonel çalışmalarda geç Doğum sonrası ve yetişkin mice.
Bu tür yaklaşımlar ile ilgili sorunları aşmak ve sağlamak için ilke kanıt önerilen yöntemin etkinliği üzerine burada koşullu bir DN sürüm Retinoblastom 1 (RB1) protein üreten tarafından sunulan yöntemini sınamanızı sağlamak seçtik. Çeşitli seçenekler endojen RB1 fonksiyonu ortadan kaldırmak için önerilen8,9,10 olmuştur; Ancak, tüm bunların bazı yukarıda açıklanan aynı sınırlamaları karşı karşıya: RB1 silinmesiyle kalıcı germline embryonically öldürücü ve tümör baskılayıcı rolü, kalıcı ile tutarlı RB1 koşullu silme tümörler11çeşitli için yol açar. RB1 bir DN sürümü doğal olarak görünmüyor olsa da, şu anda mevcut stratejileri daha iyi bir alternatiftir endojen RB1 bir geçici kontrollü inactivation için izin ve sonunda geri yüklemek için alternatif bir mekanizmaya onun işlev. Böyle bir yapı için temel üzerinde yirmi yıl önce açıklanan1. Ancak, teknolojik sınırlamalar nedeniyle, denetim transgene harekete geçirmek, yanıt ve doku özgüllük bir mekanizma yoktu. Bu zarafeti doksisiklin (Dox) ile birleştirmek için ilk çalışmadır-bağımlı transkripsiyon sistemi lizozomal proteaz CB ve Rb1 proteinlerin bir mühendislik transgenik inşa ile. Elde edilen CBRb fare modeli için bir geçici olarak düzenlenmiş Dox aracılı RB1 sağlar düzenleme2. Gen işlevini incelemek için böyle bir Proteom tabanlı yaklaşım kullanmanın avantajı bu faaliyet hakkında çok az bilgi ile ilgi herhangi bir gen için kabul edilebilir olduğunu.
Önerilen DN transgene strateji geleneksel yaklaşımlar birçok avantaj sunar. İlk olarak, DN protein inhibisyon sadece kısmi bir ablasyon için böylece bir kalıntı endojen ifade koruyarak protein etkinliği olarak, yol açar. Böyle bir sonuç nereye embriyonik ölümcül, büyük ölçüde sınırlayan bir canlı fare işlevinde gen çalışmaya herhangi bir soruşturma için protein etkinlik tam bir kaldırılması çıktığını durumlarda son derece arzu edilir. İkinci olarak, sadece bir transgene faaliyet verimli ve tersinir denetimi için izin veren bir antibiyotik, huzurunda transgene harekete geçirmek TetO sistemi sağlar. Bu nedenle, antibiyotik yönetim çıkıyordu tarafından transgenik sistem devre dışı bırakılabilir ve normal RB1 ifade geri yerdir. Üçüncü olarak, transgene ifade özgüllük seçim düzenleyici bağlı olarak değişebilir. Her yerde ROSA-CAG organizatörü ilkesi kanıt için seçtik, bir doku özgü organizatörü altında transgene yerleştirerek istenmeyen transgene ifade kısıtlamak ve bu transgene tedavi uygulanması çalışmaları kolaylaştırmak muhtemeldir metodoloji.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Transgenik CBRb fare ve tüm hayvan bakımı ve çalışma ile ilgili deneyler nesil Creighton Üniversitesi Kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış ve kendi kurallarına göre yapılır.
1. transgenik CB-Myc6-Rb1 yapı
Not: CBRb bir pTet_Splice vektör klonlama bir çok adımlı işlem (Şekil 1A ve 1B) yapıldı.
-
İlk sahne klonlama pCS2 + CB-Myc6 vektör gerçekleştirin.
- CBRb transgene yapı oluşturmak, 1583-bp-uzun Rb1 cDNA parçası (528 amino asitler amino asit bölgesine 369-896 karşılık gelen) aşağıdaki astar kullanarak RB1 protein yükseltmek için ayarlayın: EcoRI +RB 1243için F, GGGGAATTCA kullanın TTAAATTCAGCAAGTGATCAACCTTCve CCCTCTAGATATCTATTTGGACTCTCCTGGGAGATGTTTACTTCCXbaI + EcoRV +RB 2826R için kullanın.
- Klon parça (1546 bp) pCS2 + CB-Myc6 vektör olarak yukarıda açıklanan1,12 EcoR1 ve XbaI kısıtlama siteler arasında oluşturulan.
Not: biraz endojen RB1 protein (~ 110 kDa) küçük bir protein yaklaşık 865 amino asitlerin (yaklaşık 108 kDa), Rb1 parça erimiş 1012-bp-uzun CB-Myc6 yapı (337 amino asitler) sonuçlandı (Şekil 1 Bir), N-terminus ve Rb1 C-terminus adlı bir CB-Myc6 etiketi ile.
-
İkinci sahne pTet-Splice vektör subcloning gerçekleştirin.
- CB-RB-Myc6 füzyon parçası yükseltmek ve Tet-organizatörü geçirmesine, EcoRV (XbaI + EcoRV + RB 2826R) ve SalI siteleri içeren primerler kullanılarak CB-myc6-Rb1 oluşan kaset, yükseltmek: SalI +CBf, CCAGTCGACAGGATGTGGTGGTCCTTGATCCTTCkullanın.
- SalI ve EcoRV kısıtlama site böyle arasında pTet-Splice vektör içine oluşturulan parçası (2567 bp) subclone SV40 intron ve PolyA dahil olmak üzere tüm TetO-DN-CB-myc6-Rb1 transgene sinyal, bir şekilde NotI (Şekil 1B) ile tek bir sindirim yoluyla ayrılmış olabilir.
Not: NotI parçası transgenik fon oluşturmak için kullanılmıştır.
2 TetO-DN-CB-myc6-Rb1 Transgene in vitro test.
-
DOX-Yönetmelik: NIH3T3 hücre kültürünü
Not: Aksi belirtilmediği sürece, tüm birimleri 6-şey plaka için ayarlanmış bulunuyor.- Satıcı belirtimleri, önerilen hücre kültür % 10 ile % 10 CO237 ° C'de fetal Sığır serum içeren medyayı kullanarak takip NIH3T3 hücrelerin büyümesine.
- PTet-Splice hücrelerle cotransfect ve pCMV-Tet3G vektörlerinden (adım 1) için 24 h cotransfection için aşağıda belirtilen adımları izleyin.
- 2-4 µL lipid tabanlı transfection reaktif/kuyu ve 1 mL, eksik (serum) olmadan Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (DMEM) Oda sıcaklığında 5 min için karıştırın. 12 veya 24 iyi tabağı, 250 ya da 500 µL kültür ortamının sırasıyla kullanın ve transfection reaktif hacmi buna göre ayarlayın.
- 2-3 µg, plazmid DNA/iyi transfection reaktif-DMEM ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya.
- DNA ve her şey için DMEM içinde transfection reaktif içeren karışımı ekleyin. (Son Hacim 2 mL/iyi olması), kuluçka 3-4 h sonra komple medya 1 mL ekleyin. Aliquots Dox stok (1 mg/mL) tutmak ve 2 µL her wells (+ Dox) ekleyin. %5 CO237 ° C'de hücreler kuluçkaya.
Not: Cotransfected hücreleri Dox ile tedavi değil kontrol örnekleri oluşur (-Dox), yanı sıra NIH3T3 hücreleri sadece transactivator pCMV-Tet3G vektör ile transfected ve 24 saat süreyle Dox ile tedavi. PCMV-Tet3G, konsantrasyonu için 0,1 – 1 µg/mL Dox transgene ifade ikna etmek için yeterli olmalıdır.
-
HEK293 hücre satırı kullanarak yapı reversibility sınayın.
- TetO-DN-CB-myc6-Rb1 transgene reversibility, kültür HEK293 hücreler kartal'ın en az gerekli Orta (satıcının özellikleri takip EMEM içinde) test etmek ve 24 h için pTet ek yeri ve pCMV-Tet3G vektörler ile açıklandığı gibi cotransfect (adım 2.1.2) yukarıda.
- Transgene inactivation için 24 saat sonra Dox içeren medyayı çıkarın, hücreleri 2 x-3 x fosfat tamponlu tuz (PBS) ile yıkayın ve onları Dox ücretsiz medya ek bir 24 saat kuluçkaya.
Not: DOX-kaldırma üzerine transgene inactivation ve normal protein ifade 24 saat süre içinde devam.
-
Zamanlanmamış hücre çoğalması teşvik TetO-DN-CB-myc6-Rb1 yapı işlevselliğini değerlendirmek için aşağıda açıklandığı gibi bir Hee OC1 hücre satırı kullanarak fonksiyonel analizleri gerçekleştirmek.
- Kültür Hee OC1 hücrelerde % 10 DMEM altında keyfi koşullarda (33 ° C % 10 CO2). Hücre çoğalması çalışmaları için bir hücre sayaç ve plaka 10.000 Hee OC1 hücreleri 200 µL birimindeki bir 96-şey plaka üzerinde kullanarak hücreleri saymak. Hücreleri gecede kuluçkaya.
- Ertesi gün, geçici bir cotransfection pTet-Splice ve pCMV-Tet3G vektörlerin lipid tabanlı transfection reaktif kullanarak gerçekleştirmek (2.1.2 adımlara bakın). Ayrı bir kuyuda pmR-ZsGreen1 transfection at2-µg transfection oranını hesaplamak için lipid tabanlı transfection reaktifi (adım 2.1.2) kullanarak gerçekleştirin. Sigara transfected hücreleri denetimleri kullanın.
- Bir floresan mikroskop altında yeşil floresans var olup olmadığını belirlemek (uyarma 485 = nm, emisyon 530 = nm) transfected için hücreleri 24 saat sonra transfection. Yeşil floresans olup kaydetmek ve DAPI ile (Toplam hücreleri) etiketli hücreleri üzerinde GFP pozitif hücreler (transfected hücreleri) toplam sayısı transfection oranını hesaplamak.
Not: ~ %70 transfection oranında tahmin. - Transgene ifade ikna etmek için 1 µg/mL Dox transfected hücre alt grubunu için diğer alt denetimi olarak kullanırken eklediğiniz (-Dox). Tedavi edilmemiş Hee OC1 hücreleri ek denetimleri kullanın.
- Hücre çoğalması değerlendirmek için bir hücre proliferasyonu kiti üreticinin protokolüne göre kullanın.
- Kısacası, 48 h transfection sonra hücre kültür orta kaldırın ve boya-bağlama çözüm x 1 100 µL Mikroplaka her şey için ekleyin. 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya
- Bundan sonra her örnek bir Floresan Mikroplaka Okuyucu kullanarak floresans yoğunluğunu ölçmek (uyarma 485 = nm, emisyon 530 = nm).
- Daha fazla immunocytochemistry kullanarak hücre çoğalması değerlendirmek için bir 12-şey plaka bir cam Hee OC1 hücrelerdeyse plaka ve gecede 37 ° C'de kuluçkaya
- Ertesi gün, pTet-Splice ve pCMV-Tet3G ile cotransfect ve gerçekleştirmek Dox arıtma (+ Dox). Untransfected hücreleri denetimleri kullanın. İşlem Hee OC1 hücreleri Ki-67 etiketleme için.
- PBS, pH 7.4, oda sıcaklığında 10 dakika içinde %4 paraformaldehyde (PFA) ile hücreleri tamir. 3 hücreleri yıkama x ile buz gibi PBS ve %0.25 10 min için PBS içinde non-iyonik deterjan hücrelerde kuluçkaya.
- Hücreleri yıkama PBS 3 x 5 min ve oda sıcaklığında 1 h için oksijen odasında % 10 serum kullanarak bloğu için tekrar.
- Ki-67 birincil antikor (1: 200 seyreltme) Oda sıcaklığında 3 h için 500 µL hücrelerde kuluçkaya veya bir gece 4 ° C'de
- 3 hücreleri yıkama x PBS ile 5 min için. Bundan sonra karanlık oda sıcaklığında 1 h için ikincil antikor hücrelerle kuluçkaya.
- İkincil antikor çözümü kaldırmak ve hücreleri 3 yıkama x PBS ile 5 min her karanlık için.
- Phalloidin etiketleme için 1: 200 phalloidin için 30 min Hee OC1 hücrelerde kuluçkaya. Hücre çekirdekleri etiketlemek için 5 µg/mL DAPI oda sıcaklığında 10 dakika için hücrelerle kuluçkaya.
Not: Phalloidin boya eşlenik ikincil antikor eşlenik farklı olduğundan emin olun.
3. nesil CBRb+/ROSA-CAG-rtTA+ (CBRb), transgenik fareler ve Vivo DN-CBRb yaklaşımın test
- TetO-DN-CB-myc6-Rb1 transgene etkili Dox Yönetmeliği onayı, üzerine NotI parçası arındırmak ve onları sözde hamile kadın daha sonra transfer fare zigotları içine microinject.
Not: Bu yordamları Nebraska Üniversitesi Tıp Merkezi (UNMC) fare genom mühendislik çekirdek tesisinde gerçekleştirilmiştir. - Sonra teslim, bir astar kullanma belgili tanımlık pups ayarla belirli CB-Rb1 füzyon bölgesine genotip: CBRb F, 5' CTGTGGCATTGAATCAGAAATTGTGGCTGG 3'kullanın ve 5'GTACTTCTGCTATATGTGGCCATTACAACC 3'cbrb R için kullanın.
Not: Özel jel üzerinde gözlenen PCR ürünü 401 boyutudur bp (60-bp CB region + 341-bp Rb1 bölge (Tablo 1). TetO-DN-CB-myc6-Rb1 transgene varlığı dayalı on bağımsız kurucusu satır belirlendi. Beş bu satırları, Döl transgene germline iletimini doğruladı transgene miras kaldı. Transgenik satırlardan birini sonuçta kurmak ve çizgi korumak ve deneysel TetO-DN-CB-myc6-Rb1 hayvanlar için daha fazla çalışmalar oluşturmak için kullanılmıştır. - Deneysel DN-CBRb fareler oluşturmak için yetişkin TetO-DN-CB-myc6-Rb1 fareler ROSA-CAG-rtTA tetrasiklin uyarıcı hattı (hisse senedi #006965) (alternatif olarak, tTA uyarıcı hattına doğurmak) için doğurmak. Genotip bu aşağıdaki astar kümesi kullanarak çapraz yavruları: GGAGCGGGAGAAATGGATATG; rtTA-WT R için kullanın rtTA Mutant R için GCGAGGAGTTTGTCCTCAACC kullanın; ve ortak rtTA için AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT kullanın. 340 PCR ürünü ölçüleridir bp (mutant), 340 bp ve 650 bp (heterozygote) ve 650 bp (vahşi türü).
- Bir doz-yanıt eğrisi Dox tedavi bir transgene ifade temin gerekli uzunluğu ve zamanı belirlemek için Dox tedavi aşağıdaki RB1 protein üretir.
Not: Bu deneyde, Batı leke ve qRT-PCR doku özgü transgene harekete geçirmek ve RB1 ifade değerlendirmek için kullanıldı. - Floresans in situ hibridizasyon (balık) transgene genomik ekleme onaylamak için gerçekleştirin.
Not: Bu merkezde uygulanan genomik için hastane hasta çocuklar için (Toronto, Kanada) gerçekleştirilmiştir. ELISA veya Batı (protein özgü antikor kullanarak) kurutma transgene harekete geçirmek, doku-özgüllük ve endojen POI düzeyde değişiklikler değerlendirmek için kullanılabilir. DN-CB-myc6-Rb1 inşa etmek için biz bir anti-RB1 antikor kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Genellikle, bir DN mutasyon tasarlama yapısı hakkında bilgi önemli miktarda ve işlev poi gerektirir. Buna ek olarak, yapısal ve fonksiyonel bilgi POI için sınırlı olduğunda burada sunulan DN strateji özellikle yararlıdır. POI bir multimeric protein ise, lizozomal bir proteaz için bir alt birim bir füzyonu baskın monte multimer ve büyük olasılıkla, diğer ligandlar proteolizis endojen alt birimleri ve hücre altı saptırma bir birleşimi yoluyla engellediğini multimer lysosome için. Başarılı klonlama onaylamak ve Dox düzenlenir transgene harekete geçirmek, saf pTet-Splice plazmid TetO-DN-CB-myc6-Rb1 içeren etkinliğini test etmek için yapı stabil rtTA ifade fare NIH3T3 hücrelere transfected yapıldı. protein, ama değil Rb113. Sağlam bir RB1 ifade Dox (Şekil 2A) huzurunda gözlendi, ancak Dox yokluğunda rtTA ifade hücreleri yok RB1 ifade görüntülenir. Ardından, sistem reversibility test etmek için biz (hangi endogenously Rb114hızlı) HEK293 hücreleri ile arıtılmış pTet-ek yeri cotransfected /TetO-DN-CB-myc6-Rb1 ve pCMV-Tet3G vektörel çizimler. Beklendiği gibi endojen RB1 protein ifadesi önemli ölçüde transgene harekete geçirmek üstünde Dox ek hücre kültür medya (Şekil 2B) tarafından inhibe. HEK293 hücreleri, alt kümesinde bir 24 saat süre aşağıdaki sistem, reversibility test etmek için Dox içeren hücre kültür medya ile taze Dox ücretsiz medya yerini ve hücreler için bir ek 24 h reversibility Dox düzenlenir, RB1 destekleyen inkübe ifade Dox kaldırmadan kültür ortamından (Şekil 2B) geri yüklendi. Dox ile tedavi değil HEK293 hücre transfected veya HEK293 Dox tedavi hücrelerin bazal düzeyleri endojen RB1 ifade gösterdi pCMV-Tet3G ile vektör yalnızca (Şekil 2B) transfected. NIH3T3 hücreleri RB1 protein doğal olarak ifade değil, olumlu RB1 reaktivite transgenik RB1 protein birikmesi nedeniyle olmasıdır. TetO-DN-CB-myc6-Rb1 yapı potansiyel proliferatif etkisini bizim ilgi işitme sisteminin göz önüne alındığında, biz pTet-Splice toplam DNA içeriğinde ölçülen /TetO-DN-CB-myc6-Rb1- ve pCMV-Tet3G-transfected HEI-OC1 hücreleri () iç kulak Corti türetilmiş hücre kültürünü organı) varlığı ve yokluğu Dox. Burada sunulan çalışma hipotezi ile tutarlı, (cep numarasını artışa karşılık gelen) DNA içeriği önemli bir artış Dox tedavi gözlendi ama HEI OC1 hücreleri (Şekil 3A - 3 C değil tedavi edilmemiş (kontrol) transfected ).
Tüp bebek onay transgene faaliyet ve işlevi bir transgenik fare modeli oluşturuldu. Balık, TetO-DN-CB-myc6-Rb1 digoxigenin (kazmak) kullanarak-at turp peroksidaz (HRP) / İngilizce-biotin/avidin-Cy5-etiketli sonda ve G bantlama, erkek farelerin splenocytes ve kulak fibroblastlar gerçekleştirilen transgene ekleme onaylamak için transgenik fareler genom. Beş germline aktaran kurucuları arasında tutarlı bir transgene gösterdi hat 14 ekleme içinde segment 10C 3 ~ D2 (Şekil 4A - 4 C). Fareler bu satırından üreme koloniler kurmak ve daha ileri çalışmalar için deneysel hayvan oluşturmak için kullanılmıştır. Dox indüksiyon ve TetO-DN-CB-myc6-Rb1 transgene harekete geçirmek için en uygun zamanı belirlemek için biz transgenik fareler neyin Dox yönetilen içme suyu değişken zaman uzunlukları için üç farklı gruba ayrılır: Grup 1 tedavi (3 gün), Grup 2 (7 gün) tedavi ve Grup 3 (tedavi 10 gün). Tedavi tamamlandıktan sonra değişiklikleri RB1 protein ifadesindeki western Blot (Şekil 5A - 5 Dtarafından) değerlendirildi. DN ve yerel RB1 proteinler benzer moleküler ağırlık olmadığından, birbirinden Batı bir leke çözümlenemiyor. Ancak, ilk artış ile tutarlı RB1 protein (nedeniyle DN-RB1 ve endojen proteinleri birikimi), toplam RB1 protein (Şekil 5 kontrol grubuna göre transgenik fare cochleae ifadede ilk bir artış vardı A). Ayrıca, inhibitör ve proteolitik aktivite TetO-DN-CB-myc6-Rb1 transgene ürün ile tutarlı, RB1 ifade ölçülebilir bir azalma 2 ve Grup 1 ve kontrol gruplar için ( göre 3 grupta gözlenmiştir Şekil 5A - 5 D). Not, başka herhangi bir değişim RB1 protein ifade içinde tedavi 10 günden daha uzun sonuçlanmamıştır. Böylece, Dox tedavi 10 gün olarak kabul en uygun ve daha fazla çalışmaları için kullanılan.
Çünkü rtTA ve sonuç olarak, TetO-DN-CB-myc6-Rb1 transgene etkinleştirme altında her yerde ROSA-CAG organizatörü RB1 potansiyel olarak herhangi bir doku veya hücre nerede RB1is endogenously ifade inhibe olabilir (örneğin, akciğerler, kalp, Retina). Bu öncül test etmek ve transgene'nın doku özgüllük değerlendirmek için cochleae, akciğer, kalp ve göz biyopsi TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTAdisseke ve kontrol fareler ( ROSA-CAG-rtTA transgene taşımıyor) olduğunu RB1 ifade (Şekil 6A - 6 C) değerlendirildi. Analiz doku ne olursa olsun TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA ama kontrol grubu (Şekil 6A) içinde RB1 protein önemli bir azalma gözlendi. Keskin aksine, qRT-PCR analizleri göz, kalp ve cochleae Dox tedavi TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA ve yaş eşlemeli kontrol fareler DN-CBRb transkript önemli bir upregulation eski ama dokularda değil gösterdi İkinci fare (Şekil 6C). Özet olarak, bu sonuçlar inşa verimliliğini onaylayın. Transkript ifade bir artış etkili Dox düzenlenir transgene indüksiyon yansıtır. Aynı şekilde, protein ifade bir azalma endojen RB1 yönlendirme ve proteolitik bozulması ile tutarlıdır.
Resim 1: çok adım CBRb ve indüklenebilir nesil klonlama TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA. (A)Bu panel gösterir Rb1 parçası pCS2-CB-Myc6 vektör klonlama. 1583-bp Rb1 gen ürünü PCR EcoRI + RB1243 ileri ve Xba + EcoRV + RB2826 ters primerler kullanılarak güçlendirilmiş oldu. Elde edilen Rb1 parçası arasında pCS2 + CB-myc6 + Rb1 vektör oluşturmak için CB-Myc6 yapı içeren pCS2 vektör EcoRI ve Xbal kısıtlama siteleri klonlanmış. (B) CB-myc6 + Rb1 parçası SalI ve EcoRV kısıtlama siteler arasında pTetSplice vektör içine klonlanmış. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Dox düzenlenir transgene harekete geçirmek verimliliğini. (A)NIH3T3 hücreleri değil genellikle hızlı RB113. TetO-DN-CB-myc6-Rb1 yapı verimli aktivasyonu teyit, bir western blot Analizi anti-RB1 antikor ile sağlam bir RB1 ifade Dox (şerit 1 ve 3) huzurunda, ancak onun yokluğu (şerit 2 ve 4) saptandı. (B) endogenously Rb114hızlı, HEK293 hücreleri cotransfected TetO-DN-CB-myc6-Rb1 ve pCMV-Tet3G transactivator vektör ile. Dox (lane 1) yokluğunda, olumlu bir RB1 ifade gözlendi. Dox toplama sistemine TetO-DN-CB-myc6-Rb1 harekete geçirmek ve RB1 downregülasyon (lane 2) neden oldu. DOX ortamdan (lane 3) kaldırıldıktan sonra RB1 ifade 24 h ettirildi. C denetim, = untransfected HEK293 hücre Dox ile tedavi değil. Bir uyarlaması aslında hücresel sınırlar2dergide yayınlanan bir rakam bu. Üreme ufuklar'ilke' yazarlar üzerinde telif hakkı saklama ile kabul eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Dox aracılı DN-CBRb transgene etkinleştirme artırır hücre proliferasyonu. (A)Hee OC1 hücre cotransfected ile arıtılmış TetO-DN-CB-myc6-Rb1ve pCMV-Tet3G vektörler yokluğu (−) veya (+) varlığı Dox kültürlü. Hücre çoğalması 48 h nükleer silahların yayılmasına karşı tahlil kullanarak transfection sonra tespit edilmiştir. Nükleer silahların yayılmasına karşı yüzde değişim bir değişiklik untransfected hücreleri floresan değerlerle bir denetim olarak kullanılarak hesaplanır. Cep numarasını mütevazı ama önemli bir artış transfected hücrelerde Dox tedavi aşağıdaki gözlendi. Buna ek olarak, hiçbir önemli değişiklikler transfected Hee OC1 hücreler arasında gözlendi (−) ile tedavi Dox ve untransfected denetim. (B) Hee OC1 hücreleri untransfected veya (C) saf TetO-DN-CB-myc6-Rb1 ile cotransfected ve pCMV-Tet3G vektörler varlığı (+) Dox kültürlü Ki-67 (kırmızı), Phalloidin (yeşil) ve DAPI (mavi) ile etiketli. P < 0,05. Ölçek çubuğu 10 µm =. Bir uyarlaması aslında hücresel sınırlar2dergide yayınlanan bir rakam bu. Üreme ufuklar'ilke' yazarlar üzerinde telif hakkı saklama ile kabul eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : TetO-DN-CB-myc6-Rb1 transgene genomik ekleme floresan situ hibridizasyon (balık) onayı. Bir pCS2-CBRb (digoxigenin sonda/anti-DIG-HRP/tyramide-biotin/avidin-Cy5, kırmızı) testi sondası melezleşmiştir sonda sinyali tespit edildi görmek için splenocytes ve kulak fibroblast hücre metafaz veya 2,5 kb bir kopyasını hedef Ekle büyüklüğü ile değil. PCS2-CBRb bir kromozom 10 TetO-DN-CB-myc6-Rb1 transgene segment 10 C 3-D2 içinde ekleme gösterdi parlak, kütleye sonda sinyallerle melezleşmiştir sonda sınayın. RP23 - 267G 24 (spektrum yeşil) denetim sonda CBRb DNA ilgi kromozom 10 eklenen kromozom 10 bant 10A1 beklenen ve onaylanmış olarak, melezleşmiştir. (A) Bu panel programları G-bant metafaz. (B) bu panelin panel Agösterildiği gibi aynı metafaz tyramide sinyal güçlendirme (TSA) balık görüntüden gösterir. (C) Bu panel kromozom (1) G bantlama, (2) TSA balık, gösterilen 10 bileşik görüntüler gösterir ve (3) TSA BALIKLA DAPI bantlama ters. Kırmızı pCS2-CBRb sonda; = mavi DAPI bantlama; = yeşil = RP23 - 267G 24 denetim sonda. Ölçek çubuğu 10 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : DN-CBRb transgene aktivasyonu postnatal (P) 36 iç kulak TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA+ (CBRb+) ve ROSA-CAG-rtTA+ (CBRb−) fareler sonra 3 (Grup 1), 7 (Grup 2) ve 10 (Grup 3) Dox günlerinde tedavisi. (A-C) Anti-RB1, iyi olarak anti-c-myc antikorlar algılama için kullanılan hangi RB1, hem hyperphosphorylated hem de hypophosphorylated formları ile tepki verir. Densitometric analiz yapıldı ImageJ yazılımını kullanarak. Elde edilen karşılık gelen değerler negatif kontrol CBRb normalleştirilmiş− (-) ve β-aktin sonra için. Göreli RB1 ifade düzeyleri her leke altında gösterilir. (D) Normalleştirilmiş RB1 ifade düzeyleri grafik gösterimi örnekleri karşı farklı tedaviler olayları bir sürekli alt RB1 algılama CBRb+ (+) ile çizilen. Her Lane'de Batı leke jeli ve her sütun grafiği üzerinde farklı bir kişiye karşılık gelir. P < 0.05.This rakam aslında günlük hücresel sınırlar2yayınlandı. Üreme ufuklar'ilke' yazarlar üzerinde telif hakkı saklama ile kabul eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6 : TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA transgene etkinleştirme P18 TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA+ (+) ve DN-CBRb+'mekansal analizler /ROSA-CAG-rtTA− negatif kontrol (-) fareler kalp, göz, akciğerler ve koklea. (A)Dox aracılı transgene harekete geçirmek verimliliğini teyit, endojen RB1 ifade CBRb+downregulated yapıldı /ROSA-CAG-rtTA+ dokular ama negatif kontrol fareler dokularda değil. Densitometric analiz Şekil 5' te açıklandığı gibi gerçekleştirildi. Göreli RB1 ifade düzeyleri her leke altında gösterilir. (B) Bu panel normalleştirilmiş RB1 ifade düzeyleri farklı dokuların karşı çizilen grafik gösterimi gösterir. Endojen RB1 düzeyleri üzerine görülmemelidir bir varyasyonu bireysel yanıt transgene harekete geçirmek ve RB1 downregülasyon farklılıkları açıklayabilir. (C) RT-PCR göz, kalp, inceliyor ve cochleae TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA+ Dox tedavi dokularda TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA transkript önemli bir upregulation ama ortaya DN-CBRb+içinde /ROSA-CAG-rtTA− negatif kontrol grubu. CBRb+/rtTA+ = TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA+; CBRb−/rtTA+ = ROSA-CAG-rtTA+; P < 0,05. Bu rakam ilk hücresel sınırlar2günlüğüne yayımlandı. Üreme ufuklar'ilke' yazarlar üzerinde telif hakkı saklama ile kabul eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Tablo 1: kontrol etmek için kullanılan PCR durumu CB-Rb1 füzyon bölgesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Geleneksel transgenik stratejileri ile ilgili sınırlamaları aşmak için hangi endojen bir POI koşullu olarak bir DN mutant formu kronolojik zamanmekansal bir şekilde overexpressing tarafından inaktive bir fare modeli oluşturmak çalıştı. Endojen İÇN fonksiyonu ortadan kaldırmak için çeşitli seçenekler önerilen15,16,17olmuştur. Bir önceki genetik strateji1 Dox bağımlı transkripsiyon sistemi basit bir strateji bir mutant peptid Ifade ifade etkiler üretmek için lizozomal proteaz CB bir füzyonu istihdam birleştirerek değiştirdiniz endojen POI2. En önemlisi, bu teknik POI ile ilişkili yolu önceden hiçbir bilgisi gerektirir. DN protein inhibisyonu için mevcut strateji lizozomal yerelleştirme sinyal CBRb füzyon gen tüm RB etkileşim karmaşık lysosome2,3doğru yönlendirme gösterir. Bir kez lysosome içinde proteolitik işleme bu proteinlerin, onların yıkımı3' e giden başlatılır. TetO sistem geri dönüşümlü inducibility ile ilişkili CB erimiş protein içsel özelliği bu özellikle geleneksel transgenik stratejileri (örneğin, tam gen nakavt, koşullu silme), yararlı bir alternatif yapar zaman tam silme gen ilgi çekici değil.
Biz başlangıçta araştırma RB1 protein üzerinde duruldu. DN mutasyonlar en kolay bir dimer veya multimers olarak işlev proteinler olarak açıklanmıştır. Bugüne kadar hiçbir kanıt RB1 molekülleri arasında doğrudan fiziksel etkileşimi yoktur. Yine de, kendi faaliyet içsel doğası aynı kompleks içinde birden çok RB1 molekülleri varlığı için belirli bir zamanda sağlar. Örneğin, hypophosphorylated bağlama RB1 E2F1-DP heterodimerdir için normalde histon deacetylase (HDAC)18,19,20tarafından işgal edilmiş bir ek bağlama sitesi sağlar. Öte yandan, HDAC1 fiziksel olarak RB1 ile etkileşim kurar ve bu kompleks, buna karşılık, böylece ek transkripsiyon baskı18-mek şartıyla E2F1-DP-RB1 heterotrimer için bağlar. RB1 molekülleri grubunda en az biri bir DN mutant ise bu yaklaşım başı olarak, bu karmaşık endojen RB1, böylece bir RB1 boş fenotip alabilme düzeyde azaltır süre transkripsiyon, bastırmak engeller. Burada, endojen RB1 inhibisyon 10 gün sonra Dox yönetim içme suyu gözlendi. Ancak, Dox indüksiyon için en uygun doz her sistem için ampirik olarak belirlenecek gerekebilir. Ayrıca, çoğu Rb1 gen dizisinin kullanılmıştır bu yana yapı makyaj yaparken, endojen RB1 yokluğunda bile, mutant RB1 çalışabileceği ve herhangi bir RB1'ın bağlama ortakları DN inhibisyonu temin ki mümkün olduğunu. Bu öncül bilinen RB1 bağlama molekülleri ifade düzeyini değerlendirmek tarafından test edilecek.
Duyulan, ince düzenlenmiş zamansal ve tersinir protein inactivation çok çeşitli çalışmalar araştırma alanları temel karmaşık biyokimyasal mekanizmalar ışık için arama daha da geniş sayıda gelişimi için temel sağlayacak Gen ve proteinactivity çeşitli yönlerini. POI bağlı olarak moleküler karmaşıklığı anlamak başarılı tedavi edici stratejiler tasarlamak için araştırmacıların yeteneğini geliştirmek muhtemeldir. Artan transgene özgüllük tTA veya rtTA satırları sürüş doku özel Organizatör DN fare ıslahı tarafından elde edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
PCS2 + CB-Myc6 vektör Marshall Horwitz (University of Washington, Seattle, WA, ABD) bir hediye oldu. Hee OC1 hücreleri nazikçe Fedrico Kalinec (David Geffen School of Medicine, UCLA, Los Angeles, Kaliforniya, ABD) tarafından temin edilmiştir. Teknik destek UNMC fare genom mühendislik çekirdek (C.B. Gurumurthy, Don Harms, rol Brezilya'lı) ve Creighton Üniversitesi entegre Biyomedikal görüntüleme tesis (Richard Hallworth, John Billheimer) tarafından sağlandı. UNMC fare genom mühendislik NIH/NIGMS, bir Kurumsal Geliştirme Ödülü (fikir) tarafından desteklenen sayı P20 GM103471 verin. Entegre Biyomedikal görüntüleme tesisin Creighton Üniversitesi Tıp ve hibe GM103427 ve GM110768 NIH/NIGMS dan tarafından desteklenmiştir. Tesisin Ulusal Merkezi gelen hibe desteği için araştırma kaynakları (RR016469) ile inşa edilmiştir ve NIGMS (GM103427). Bu çalışmada oluşturulan fare satırları Creighton Üniversitesi'nin hayvan kaynak tesis olan altyapı bir hibe NIH/NCRR G20RR024001 tarafından geliştirildi, muhafaza. Bu eser geçmiş COBRE vermek (Shelley D. Smith ile) bir NIH/NCRR 5P20RR018788-/ NIH/NIGMS 8P20GM103471, NIH/ORIP R21OD019745-01A1 (S.M.R.-S.) ve işitme Sağlık Vakfı (S. Tarang için) bir ortaya çıkan araştırma hibe yoluyla destek aldı. Bu araştırma içeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmiyor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM | GIBCO-BRL | 11965-084 | |
| Minimum Essential Medium Eagle, MEME | Sigma | M8042 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442 | |
| Lipofectamine | DharmaFECT | T-2010-03 | |
| Sal I | Roche | 11745622 | |
| EcoRV-HF | New England BioLabs | R3195S | |
| NotI | Roche | 13090730 | |
| CaspaTag | Millipore | APT523 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Staurosporine | Sigma | S4400 | |
| CyQuant NF cell proliferation kit | Invitrogen | C35007 | |
| Retinoblastoma 1 antibody | Abcam | Ab6075 | |
| c-Myc antibody | Sigma | M5546 | |
| b-actin | Sigma | A5316 | |
| Ki-67 | Thermofisher scientific | MA5-14520 | |
| Phallodin | Thermofisher scientific | A12379 | |
| Fluorescence microplate reader | FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech | ||
| Epifluorescence microscope | NikonEclipse80i | ||
| The TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) mouse line is available from the Jackson Laboratory as JAX#032011. |
References
- Li, F. Q., et al. Preferential MyoD homodimer formation demonstrated by a general method of dominant negative mutation employing fusion with a lysosomal protease. Journal of Cell Biology. 135 (4), 1043-1057 (1996).
- Tarang, S., et al. Generation of a retinoblastoma (rb)1-inducible dominant-negative (DN) mouse model. Frontiers Cellular Neuroscience. 9 (52), (2015).
- Kominami, E., et al. The selective role of cathepsins B and D in the lysosomal degradation of endogenous and exogenous proteins. FEBS Letters. 287 (1-2), 189-192 (1991).
- Cortellino, S., et al. Defective ciliogenesis, embryonic lethality and severe impairment of the sonic hedgehog pathway caused by inactivation of the mouse complex A intraflagellar transport gene Ift122/Wdr10, partially overlapping with the DNA repair gene Med1/Mbd4. Developmental Biology. 325 (1), 225-237 (2009).
- Ferreira, C., et al. Early embryonic lethality of H ferritin gene deletion in mice. Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3021-3024 (2000).
- Lee, E. Y., et al. Mice deficient for rb are nonviable and show defects in neurogenesis and haematopoiesis. Nature. 359 (6393), 288-294 (1992).
- Turlo, K. A., et al. When cre-mediated recombination in mice does not result in protein loss. Genetics. 186 (3), 959-967 (2010).
- Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).
- Zhang, J., et al. The first knockout mouse model of retinoblastoma. Cell Cycle. 3 (7), 952-959 (2004).
- Zhao, H., et al. Deletions of retinoblastoma 1 (Rb1) and its repressing target S phase kinase-associated protein 2 (Skp2) are synthetic lethal in mouse embryogenesis. Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10201-10209 (2016).
- Yamasaki, L., et al. Loss of E2F-1 reduces tumorigenesis and extends the lifespan of Rb1(+/-) mice. Nature Genetics. 18 (4), 360-364 (1998).
- Li, F. Q., et al. Selection of a dominant negative retinoblastoma protein (RB) inhibiting satellite myoblast differentiation implies an indirect interaction between MyoD and RB. Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5129-5139 (2000).
- Pitkanen, K., et al. Expression of the human retinoblastoma gene product in mouse fibroblasts: Effects on cell proliferation and susceptibility to transformation. Experimental Cell Research. 207 (1), 99-106 (1993).
- Chano, T., et al. Neuromuscular abundance of RB1CC1 contributes to the non-proliferating enlarged cell phenotype through both RB1 maintenance and TSC1 degradation. International Journal of Molecular Medicine. 18 (3), 425-432 (2006).
- Kole, R., et al. RNA therapeutics: Beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (2), 125-140 (2012).
- Yamamoto, A., et al. The ons and offs of inducible transgenic technology: A review. Neurobiology of Disease. 8 (6), 923-932 (2001).
- Houdebine, L. M., et al. Transgenic animal models in biomedical research. Methods in Molecular Biology. 360, 163-202 (2007).
- Brehm, A., et al. Retinoblastoma protein recruits histone deacetylase to repress transcription. Nature. 391 (6667), 597-601 (1998).
- Lu, Z., et al. E2F-HDAC complexes negatively regulate the tumor suppressor gene ARHI in breast cancer. Oncogene. 25 (2), 230-239 (2006).
- Magnaghi-Jaulin, L., et al. Retinoblastoma protein represses transcription by recruiting a histone deacetylase. Nature. 391 (6667), 601-605 (1998).
