Summary
Nous présentons ici un protocole visant à développer un système inductible dominant négatif, dans lequel toute protéine peut être inactivée conditionnellement par réversiblement surexprimant une version mutante dominant négatif de celui-ci.
Abstract
Inhibition de protéine dominant négatif (DN) est une méthode puissante pour manipuler la fonction des protéines et offre plusieurs avantages par rapport aux autres approches axées sur la génomique. Par exemple, bien que chimérique et Cre-LoxP stratégies de ciblage ont été largement utilisés, les limitations intrinsèques de ces stratégies (activité du promoteur qui fuit, expression de Cre de mosaïque, etc.) ont considérablement restreint leurs demande. En outre, un effacement complet de nombreux gènes endogènes est une létalité embryonnaire, rendant impossible d’étudier la fonction du gène dans la vie postnatale. Pour relever ces défis, nous avons apporté des changements importants à un protocole de génie génétique précoce et combiné (transgénique) version courte du gène Rb1 avec une protéase lysosomale B procathepsin (CB), générer un modèle de souris DN de Rb1 (CBRb). En raison de la présence d’une protéase lysosomale, la protéine de fusion CB-RB1 entière et son interaction complexe sont acheminés pour dégradation induite par le protéasome. En outre, la présence d’un élément inducteur (rtTA) de tétracycline dans la construction transgénique permet une régulation inductible et réversible de la protéine RB1. La présence d’un promoteur de ROSA-CAG omniprésent dans le modèle de souris CBRb rend un outil utile pour procéder à l’ablation de gène Rb1 transitoire et réversible et de fournir aux chercheurs une ressource pour comprendre son activité dans pratiquement n’importe quel type de cellules où la RB1 est exprimé.
Introduction
La plupart des approches visant à l’ablation des gènes et des protéines s’appuient sur des processus permanents, qui se traduisent généralement par l’élimination complète ou la troncation de la gène, de séquences d’ARN ou protéine d’intérêt (POI). L’objectif général de cette méthode est à l’ingénieur une protéine recombinante pour l’abolition de la fonction des protéines endogènes, sauvage. Nous avons revu et remanié une stratégie alternative1,2, qui permet l’ablation temporaire d’un POI par inhibition de la DN. Cette méthode fonctionne pour les multimères et peptides monomères mais est plus adaptée pour les protéines qui fonctionnent dans une assemblée de multimères.
La méthode consiste à fusionner la protéase lysosomale CB à une sous-unité d’un multimériques POI (complexe de fusion de CB). La résultante complexe de fusion CB peut interagir avec et clivage protéolytique digérer la protéine endogène ou détourner l’ensemble CB-POI pour le lysosome être dégradées3. En outre, une combinaison de la fusion de CB complexe avec le caractère inductible du système contrôlé par tétracycline l’activation transcriptionnelle (Fifi) permet une expression inductible et contrôlée du transgène dans un mode réversible2. Bien qu’utiles dans de nombreuses circonstances, la suppression complète des gènes ou des protéines in vivo peut entraîner la létalité4,5,6. De même, tissu-spécifique, conditionnelle délétion de certains gènes ou les protéines utilisant le système Cre-Lox ne peut pas être simple, comme elle, en fin de compte, entraînera la perte permanente des éléments critiques de génomique7. Par conséquent, selon le gène ou POI, aucune de ces approches seront efficaces en fournissant un modèle utile pour des études ultérieures, en particulier des gènes ou des protéines des études fonctionnelles chez les souris adultes et postnatals fin.
Pour contourner les problèmes liés à ces approches et fournir preuve de principe sur l’efficacité de la méthode proposée, nous avons choisi de tester la méthode présentée ici en générant une version DN conditionnelle de la protéine du rétinoblastome 1 (RB1). Plusieurs options ont été proposées8,9,10 à abolir la fonction de RB1 endogène ; Cependant, chacun d’eux fait face à certaines limitations mêmes discutées plus haut : suppression de cellules germinales permanente de RB1 est mortelle embryonnaire et, conforme à son rôle de suppresseur de tumeur, permanente RB1 suppression conditionnelle mène à une variété de tumeurs11. Même si une version DN de RB1 ne semble pas se produire naturellement, une meilleure alternative pour les stratégies actuellement disponibles devrait permettre une inactivation temporellement contrôlée de la RB1 endogène et prévoient un autre mécanisme pour finalement restaurer sa fonction. La base d’une telle construction a été décrite il y a plus de vingt ans1. Toutefois, en raison des limitations technologiques, il lui manquait un mécanisme d’activation de transgène de contrôle, d’intervention et spécificité tissulaire. Cette étude est le premier à combiner l’élégance de la doxycycline (Dox)-système transcriptionnelle dépendant par une ingénierie construction transgénique de protéines de CB et Rb1 protéases lysosomales. Le modèle de souris CBRb qui en résulte permet une RB1 temporairement réglementée de Dox-mediated règle2. L’avantage d’utiliser une approche axée sur le protéome pour étudier la fonction du gène est qu’il peut être adopté pour n’importe quel gène d’intérêt, avec un minimum d’informations sur son activité.
La stratégie proposée du transgène DN offre de nombreux avantages par rapport aux approches traditionnelles. Tout d’abord, l’inhibition de protéine DN mène à seulement une ablation partielle en activité de la protéine, préservant ainsi une expression endogène résiduelle. Un tel résultat est hautement souhaitable dans des situations où une élimination complète de l’activité de la protéine entraîne une létalité embryonnaire, limitant grandement toute enquête pour étudier la fonction des gènes dans une souris vivante. En second lieu, la présence du système TetO permet l’activation du transgène qu’en présence d’un antibiotique, ce qui permet un contrôle efficace et réversible de l’activité du transgène. Ainsi, en cessant l’administration d’antibiotiques, le système transgénique peut être désactivé, et une expression normale de la RB1 est remis en place. En troisième lieu, la spécificité de l’expression de transgènes peut varier selon le promoteur de choix. Alors que nous avons choisi le promoteur omniprésent de ROSA-CAG pour preuve de principe, plaçant le transgène sous un promoteur spécifique aux tissus est susceptible de restreindre l’expression transgénique non désirées et de faciliter les études sur l’application thérapeutique de ce transgène méthodologie.
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Protocol
Génération de la souris transgénique de CBRb et tous les soins aux animaux et expériences liées à l’étude ont été approuvés par l’Université Creighton institutionnels, protection des animaux et utilisation Comité (IACUC) et effectué par des lignes directrices.
1. transgéniques CB-Myc6-Rb1 Construct
Remarque : Le clonage de CBRb dans un vecteur de pTet_Splice a été fait dans un processus en plusieurs étapes (Figure 1 a et 1 b).
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Effectuer le premier clonage d’étape dans le Bureau2 + vecteur CB-Myc6.
- Pour créer la construction du transgène CBRb, amplifier un fragment de cDNA de Rb1 1583-bp-long (528 acides aminés correspondant à la zone de l’acide aminé 369 – 896) de la protéine RB1 utilisant l’amorce suivante jeu : pour EcoRI +RB 1243F, utilisez GGGGAATTCA TTAAATTCAGCAAGTGATCAACCTTCet XbaI + EcoRV +RB 2826R, utilisez CCCTCTAGATATCTATTTGGACTCTCCTGGGAGATGTTTACTTCC.
- Clone le fragment généré (bp 1546) entre les sites de restriction EcoR1 et XbaI du Bureau2 + vecteur CB-Myc6 comme décrit précédemment1,12.
Remarque : La construction de la CB-Myc6 1012-bp-long (337 aminoacides) fusionnée au fragment Rb1 a donné lieu à une protéine d’environ 865 acides aminés (environ 108 kDa), qui est légèrement plus petite que la protéine RB1 endogène (~ 110 kDa) (Figure 1 Un), avec une étiquette de6 CB-Myc à l’extrémité N-terminale et Rb1 à l’extrémité C-terminale.
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Effectuer la deuxième étape subcloning dans le vecteur pTet-épissure.
- Pour amplifier le fragment de fusion CB-RB-Myc6 et d’acquérir le Tet-promoteur, amplifient la cassette, consistant en la CB-myc6-Rb1 en utilisant des amorces contenant les EcoRV (XbaI + EcoRV + RB 2826R) et les sites de SalI : pour SalI +CBF, Utilisez CCAGTCGACAGGATGTGGTGGTCCTTGATCCTTC.
- Subclone le fragment généré (2567 bp) dans le vecteur pTet épissure, entre les sites de restriction SalI et EcoRV , de telle manière que le transgène TetO-DN-CB-myc6-Rb1 entière, y compris l’intron SV40 et la PolyA signal, peuvent être isolés par une simple digestion avec NotI (Figure 1B).
Remarque : Le fragment de NotI a été utilisé pour générer les bailleurs de fonds transgéniques.
2. in Vitro test du transgène TetO-DN-CB-myc6-Rb1
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Dox-règlement : Lignée de cellules NIH3T3
Remarque : Sauf indication contraire, tous les volumes ont été ajustées pour une plaque 6 puits.- La croissance de cellules NIH3T3 conformément aux spécifications du vendeur, en utilisant les milieux de culture de cellule recommandée contenant du sérum de veau fœtal de 10 % à 37 ° C, avec 10 % de CO2.
- Cotransfect les cellules avec épissure pTet et vecteurs cmvp-Tet3G (de l’étape 1) pendant 24 h. suivent les étapes mentionnées ci-dessous pour analyse.
- Mélanger 2 – 4 µL de réactif/puits transfection à base de lipides et 1 mL de Dulbecco incomplète (sans sérum) modifié Eagle (DMEM) pendant 5 min à température ambiante. Pour une plaque de 12 ou 24 puits, utiliser 250 ou 500 µL de milieux de culture, respectivement et régler le volume de réactif de transfection en conséquence.
- Ajouter 2 à 3 µg de plasmide ADN/puits dans le réactif de transfection-DMEM et incuber pendant 20 min à température ambiante.
- Ajoutez le mélange contenant l’ADN et le réactif de transfection dans DMEM dans chaque puits. Après 3 – 4 h d’incubation, ajouter 1 mL de médias complet (de sorte que le volume final est de 2 mL/puits). Gardez les aliquotes de Dox stock (1 mg/mL) et ajouter 2 µL dans chacun des puits (+ Dox). Incuber les cellules à 37 ° C, avec 5 % de CO2.
Remarque : Échantillons de contrôle doivent être composé de cellules cotransfectés non traités par Dox (-Dox), ainsi que les cellules NIH3T3 transfectées seulement avec le vecteur de cmvp-Tet3G transactivateur et traitement par Dox pendant une période de 24h. Pour cmvp-Tet3G, les concentrations de 0,1 et 1 µg/mL Dox devrait être suffisante pour induire l’expression du transgène.
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Tester la réversibilité de la construction à l’aide de la lignée de cellules HEK293.
- Pour tester la réversibilité du transgène TetO-DN-CB-myc6-Rb1 , cellules HEK293 en culture dans la moyen essentiel d’aigle-Minimum (EMEM) conformément aux spécifications du vendeur et cotransfect avec les vecteurs d’épissure pTet tant cmvp-Tet3G pendant 24 h, tel que décrit (étape 2.1.2) ci-dessus.
- Pour l’inactivation du transgène, retirez le support contenant Dox après 24h, laver le cellules 2 de x x-3 avec du sérum physiologique tamponné au phosphate (PBS) et les incuber dans des milieux sans Dox pendant 24 h supplémentaires.
Remarque : Lors du retrait-Dox, le transgène inactivation et l’expression de la protéine régulière devraient être repris dans ce délai de 24h.
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Afin d’évaluer les fonctionnalités de la construction de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 dans la promotion de la prolifération cellulaire non programmée, effectuer des analyses fonctionnelles, à l’aide d’une lignée de cellules de HEI-OC1, tel que décrit ci-dessous.
- Dans 10 % des cellules de culture HEI-OC1 DMEM sous permissive des conditions (33 ° C avec 10 % de CO2). Pour les études de prolifération cellulaire, compter les cellules à l’aide d’un compteur de cellules et les cellules de HEI-OC1 plaque 10 000 sur une plaque à 96 puits en un volume de 200 µL. Incuber les cellules pendant la nuit.
- Le lendemain, effectuer une analyse transitoire des vecteurs pTet épissure et cmvp-Tet3G à l’aide d’un réactif à base de lipides transfection (voir étapes 2.1.2). Dans un endroit bien distinct, effectuer des pmR-ZsGreen1 transfection at2-µg en utilisant le réactif de transfection à base de lipides (étapes 2.1.2) pour calculer le taux de transfection. Utiliser les cellules non transfectées comme témoins.
- Détecter la présence d’une fluorescence verte sous un microscope à fluorescence (excitation = 485 nm ; émission = 530 nm) pour le transfectées cellules 24h après la transfection. Enregistrer la présence ou l’absence de fluorescence verte et calculer le taux de la transfection, le nombre total de cellules (cellules transfectées) de la GFP-positives sur les cellules marquées au DAPI (cellules totales).
Remarque : Nous avons estimé un taux de transfection d’environ 70 %. - Pour induire l’expression du transgène, ajouter 1 µg/mL Dox à un sous-ensemble de cellules transfectées tout en utilisant l’autre sous-ensemble comme contrôle (-Dox). Utiliser des cellules de HEI-OC1 non traitées comme des contrôles supplémentaires.
- Pour évaluer la prolifération des cellules, utilisez un kit de prolifération cellulaire selon le protocole du fabricant.
- En bref, 48 h après la transfection, enlevez le milieu de culture cellulaire et ajouter 100 µL de solution de colorant-liaison 1 x dans chaque puits de la microplaque. Incuber pendant 1 heure à 37 ° C.
- Par la suite, mesurer l’intensité de la fluorescence de l’échantillon à l’aide d’un lecteur de microplaques de fluorescence (excitation = 485 nm ; émission = 530 nm).
- Pour évaluer plus précisément la prolifération des cellules à l’aide d’immunocytochimie, les cellules de HEI-OC1 sur une lamelle couvre-objet dans une plaque de 12 puits de la plaque et incuber une nuit à 37 ° C.
- Le lendemain, cotransfect avec le pTet épissure et cmvp-Tet3G et exécuter le traitement Dox (+ Dox). Utiliser les cellules celllulaire comme témoins. Cellules de HEI-OC1 process pour l’étiquetage de Ki-67.
- Fixer les cellules avec 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dans du PBS, pH 7,4, pendant 10 min à température ambiante. Laver les cellules 3 x avec PBS glacée et incuber les cellules dans un détergent non ionique 0,25 % dans du PBS pendant 10 min.
- Laver les cellules encore une fois, 3 fois en PBS pendant 5 min et bloc à l’aide de 10 % de sérum dans une chambre humidifiée pendant 1 h à température ambiante.
- Incuber les cellules de 500 µL d’anticorps primaire de Ki-67 (dilution 1 : 200) pendant 3 h à température ambiante ou pendant la nuit à 4 ° C.
- Laver les cellules 3 x pendant 5 min avec du PBS. Après cela, incuber les cellules avec l’anticorps secondaire pendant 1 h à température ambiante dans l’obscurité.
- Enlever la solution de l’anticorps secondaire et laver les cellules 3 x avec PBS de 5 min chacun, dans l’obscurité.
- Pour l’étiquetage de la phalloïdine, incuber les cellules HEI-OC1 au 1 : 200 phalloïdine pendant 30 min. Pour étiqueter les noyaux des cellules, incuber les cellules avec 5 µg/mL DAPI pendant 10 min à température ambiante.
Remarque : Assurez-vous que le conjugué de colorant phalloïdine est différent que le conjugué d’anticorps secondaire.
3. génération de CBRb+/ROSA-CAG-rtTA+ (CBRb) des souris transgéniques et In Vivo, essais de l’approche de DN-CBRb
- Lors de la confirmation d’une réglementation effective du transgène TetO-DN-CB-myc6-Rb1 Dox, purifier le fragment NotI et leur microinject en zygotes de souris, qui sont ensuite transférés dans les femelles pseudo-gestantes.
Remarque : Ces procédures ont été menées à l’University of Nebraska Medical Center (UNMC) souris centre génomique de l’ingénierie Core. - Après l’accouchement, les chiots utilisant une amorce la valeur spécifiques à la région de fusion CB-Rb1 le génotype : pour CBRb F, utilisez 5' CTGTGGCATTGAATCAGAAATTGTGGCTGG 3′ et CBRB R, 5′ GTACTTCTGCTATATGTGGCCATTACAACC 3′.
Remarque : La taille du produit PCR sur gel d’agarose est 401 bp (région de CB 60-bp + région de Rb1 341-pb (tableau 1). Une dizaine de lignes fondateur indépendant ont été identifiés, basée sur la présence du transgène TetO-DN-CB-myc6-Rb1 . Dans cinq de ces lignes, la progéniture a hérité du transgène, qui a confirmé la transmission de la lignée germinale du transgène. Une des lignées transgéniques a été finalement utilisée pour l’établir et de maintenir la ligne et de générer des animaux de laboratoire TetO-DN-CB-myc6-Rb1 pour poursuivre ses études. - Se reproduisent des souris adultes de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 jusqu'à la ligne d’inducteur tétracycline ROSA-CAG-rtTA (Stock #006965) (alternativement, race à une ligne d’inducteur de tTA) pour générer des souris de DN-CBRb expérimentales. Génotype de la progéniture de cette croix à l’aide de l’ensemble suivant d’apprêt : usage rtTA-WT R, GGAGCGGGAGAAATGGATATG ; pour rtTA Mutant R, utiliser GCGAGGAGTTTGTCCTCAACC ; et pour rtTA commun, utilisez AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT. Les tailles de produit PCR sont 340 bp (mutant), 340 bp et 650 bp (hétérozygote) et 650 bp (type sauvage).
- Générer une courbe dose-réponse de la protéine RB1 après le traitement de Dox pour déterminer l’heure et la durée du traitement Dox nécessaire pour obtenir une expression du transgène.
Remarque : Dans cette expérience, la tache occidentale et qRT-PCR ont été utilisés pour évaluer l’activation spécifique aux tissus transgene et RB1 expression. - Effectuer l’hybridation in situ par fluorescence (FISH) pour confirmer l’insertion génomique du transgène.
Remarque : Cela a été réalisée au Centre de génomique appliquée de l’Hospital for Sick Children (Toronto, Canada). ELISA ou western blot (à l’aide de protéines spécifiques anticorps) peut être utilisé pour évaluer l’activation du transgène, spécificité tissulaire et des changements dans les niveaux de l’IPE endogène. Pour la construction de DN-CB-myc6-Rb1 , nous avons utilisé un anticorps anti-RB1.
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Representative Results
En règle générale, concevoir une mutation DN nécessite une quantité considérable d’informations sur la structure et la fonction du POI. En revanche, la stratégie de DN présentée ici est particulièrement utile lorsque les informations structurales et fonctionnelles pour le POI sont limitées. Si le pi est une protéine de multimères, une fusion d’une sous-unité d’une protéase lysosomale peut inhiber principalement les multimères assemblé et, éventuellement, d’autres ligands grâce à une combinaison de la protéolyse des sous-unités endogènes et subcellulaire détournement de la polymère pour le lysosome. Pour confirmer le clonage réussi et de tester l’efficacité des transgènes réglementés Dox activation, purifiée par épissure pTet plasmide contenant la TetO-DN-CB-myc6-Rb1 construct a été transfecté dans des cellules NIH3T3 souris qui expriment stablement le rtTA protéine, mais pas de Rb113. En l’absence de Dox, cellules exprimant rtTA n’affichent aucune expression de RB1, alors qu’une expression de RB1 robuste a été observée en présence de Dox (Figure 2A). Ensuite, pour tester la réversibilité du système, nous cotransfectés les cellules HEK293 (qui endogène expriment Rb114) avec épissure pTet purifiée /TetO-DN-CB-myc6-Rb1 et les vecteurs cmvp-Tet3G. Comme prévu, l’expression de la protéine RB1 endogène était sensiblement diminuée lors de l’activation de transgènes par l’addition de Dox dans les milieux de culture cellulaire (Figure 2B). Pour tester la réversibilité du système, après une période de 24h, dans un sous-ensemble de cellules HEK293, nous avons remplacé les milieux de culture cellulaire contenant Dox avec milieux de Dox-sans frais et incuber les cellules pour une supplémentaire 24 h. soutenant la réversibilité réglementés Dox, RB1 expression a été restaurée après le retrait de Dox depuis les milieux de culture (Figure 2B). Transfecté des cellules HEK293 qui n’étaient pas traités avec Dox ou imprégnées de Dox HEK293 cellules transfectées avec le cmvp-Tet3G vecteur seulement (Figure 2B) ont montré des niveaux d’expression de RB1 endogène basales. Parce que les cellules NIH3T3 n’expriment pas la protéine RB1 de naturellement, la réactivité positive de RB1 est due à l’accumulation de la protéine RB1 transgénique. Compte tenu de notre intérêt pour l’effet potentiel prolifératif de la construction de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 dans le système auditif, nous avons mesuré la teneur en ADN totale dans pTet-épissure /TetO-DN-CB-myc6-Rb1- et HEI-OC1 cmvp-Tet3G-transfected des cellules () oreille interne orgue d’une lignée de cellules dérivées de Corti) en présence et en absence de Dox. Conformément à l’hypothèse de travail présentée ici, une augmentation significative de la teneur en ADN (correspondant à une augmentation dans le nombre de cellules) a été observée chez Dox-traités mais non (témoin) transfectées HEI-OC1 cellules (Figure 3 a - 3C ).
Après la confirmation par in vitro de l’activité de transgène et de la fonction, un modèle de souris transgénique a été généré. Les poissons, en utilisant un digoxigénine TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DIG)-peroxydase de radis de cheval (pr) / tyramine biotine/avidine-Cy5-sonde marquée et G-bande de fibroblastes de splénocytes et oreille de souris mâles ont été effectués pour confirmer l’insertion du transgène dans le génome de souris transgéniques. Parmi les cinq fondateurs de transmission de lignée germinale, insertion de la ligne 14 a montré un transgène cohérent au sein du segment 10C 3 ~ D2 (Figure 4 a - 4C). Souris de cette ligne ont été utilisées pour établir les colonies reproductrices et générer des animaux de laboratoire pour poursuivre ses études. Pour déterminer le moment optimal pour l’induction de Dox et l’activation de transgene TetO-DN-CB-myc6-Rb1 , nous avons divisé les souris transgéniques en trois groupes différents, dans laquelle Dox a été administré dans l’eau potable pour des durées variables : groupe 1 (3 jours de traitement), groupe 2 (7 jours de traitement) et groupe 3 (10 jours de traitement). À la fin du traitement, des changements dans l’expression de la protéine RB1 ont été évaluées par western blot (Figure 5 a - 5D). Parce que la DN et native RB1 protéines ont des poids moléculaires semblables, ils ne peuvent être résolus de l’autre sur une tache occidentale. Toutefois, conformément à une augmentation initiale dans la protéine RB1 (due à l’accumulation des protéines endogènes et de DN-RB1), il y avait une augmentation initiale totale expression de la protéine RB1 dans le limaçon des souris transgéniques, comparée au groupe témoin (Figure 5 A). en outre, compatible avec l’activité inhibitrice et protéolytique du produit transgénique TetO-DN-CB-myc6-Rb1 , une réduction quantifiable de RB1 expression a été observée dans les groupes 2 et 3 par rapport au groupe 1 et des groupes témoins ( Figure 5 a - 5D). À noter, plus de 10 jours de traitement n’a pas entraîné aucun autre changement dans l’expression de la protéine RB1. Ainsi, 10 jours de traitement Dox était considéré comme optimal et est utilisé pour d’autres études.
Parce que la rtTA et, partant, l’activation du transgène TetO-DN-CB-myc6-Rb1 relèvent le promoteur omniprésent de la ROSA-CAG , RB1 pouvait être potentiellement inhibée dans n’importe quel tissu ou cellule où RB1is exprimés (poumons, cœur, rétine). Pour tester cette hypothèse et évaluer la spécificité tissulaire du transgène, limaçon, poumons, coeur et biopsies d’oeil ont été disséqués de TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA, et les souris témoins (n’exploite ne pas le transgène ROSA-CAG-rtTA ) ont été évalué pour l’expression de RB1 (Figure 6 a - 6c). Quel que soit le tissu analysé, une réduction significative de la protéine RB1 a été observée dans le TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA mais pas dans le groupe témoin (Figure 6A). Contraste, qRT-PCR analyses dans les yeux, le coeur et limaçon de Dox-traités TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA et souris témoins du même âge, a montré une augmentation significative de la transcription de DN-CBRb dans les tissus de l’ancien mais ne pas le cette dernière souris (Figure 6C). Au total, ces résultats confirment l’efficacité de la construction. Une augmentation de transcription expression reflète l’induction efficace transgènes réglementés Dox. De même, une réduction de l’expression de la protéine est conforme à la dégradation protéolytique et de routage de la RB1 endogène.
Figure 1: multi-étapes clonage du CBRb et génération de l’inductible TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA. (A) ce panneau montre le clonage du fragment Rb1 dans le vecteur de Bureau2-CB-Myc6 . Produit d’un gène Rb1 1583-bp a été amplifié à l’aide la EcoRI + RB1243 vers l’avant et Xba + EcoRV + RB2826 inverses amorces PCR. Le fragment de Rb1 qui en résulte a été cloné entre les sites de restriction EcoRI et Xbal du vecteur Bureau2 contenant la construction CB-Myc6 pour générer le vecteur Bureau2 + CB-myc6 + Rb1 . (B) la CB-myc6 + Rb1 fragment a été cloné dans le vecteur pTetSplice entre les sites de restriction SalI et EcoRV . S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : L’efficacité de l’activation de transgènes réglementés Dox. (A) les cellules NIH3T3 n’expriment pas habituellement RB113. Confirmant l’activation efficace de la construction de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 , une analyse par transfert western avec l’anticorps anti-RB1 a révélé une expression RB1 robuste en présence de Dox (pistes 1 et 3), mais pas en son absence (pistes 2 et 4). (B) les cellules HEK293, qui expriment l’endogène Rb114, ont été cotransfectés avec TetO-DN-CB-myc6-Rb1 et le vecteur de transactivateur cmvp-Tet3G. En l’absence de Dox (piste 1), une expression de RB1 positive a été observée. L’ajout de Dox au système causé l’activation de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 et RB1 downregulation (piste 2). L’expression de RB1 reprit 24h après que Dox a été supprimé à partir du support (piste 3). C = contrôle, les cellules HEK293 celllulaire non traités par Dox. Il s’agit d’une adaptation d’un personnage originellement publiée dans la revue Frontiers in Cellular Neuroscience2. Sa reproduction est d’accord avec maintien du droit d’auteur de frontières« politique auteurs ». S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : DN-CBRb Dox-mediated transgene activation augmente la prolifération cellulaire. (A) les cellules de HEI-OC1 cotransfectésent avec purifiée TetO-DN-CB-myc6-Rb1et les vecteurs cmvp-Tet3G ont été cultivés en absence (−) ou en présence (+) de Dox. La prolifération cellulaire a été déterminée 48 h après la transfection en utilisant un test de prolifération. Le taux de variation dans la prolifération a été calculé à l’aide d’un changement dans les valeurs de fluorescence avec cellules celllulaire comme un contrôle. Une augmentation modeste mais significative nombre de cellules a été observée dans les cellules transfectées, après traitement de Dox. En revanche, pas de changements significatifs ont été observés entre les cellules transfectées de HEI-OC1 Dox pas traitée avec (−) et le contrôle celllulaire. (B) des cellules de HEI-OC1 celllulaire ou (C) cotransfectés avec purifiée TetO-DN-CB-myc6-Rb1 et les vecteurs cmvp-Tet3G cultivées en présence de Dox (+) ont été marquées avec Ki-67 (rouge), la Phalloïdine (vert) et DAPI (bleu). P < 0,05. Echelle = 10 µm. Il s’agit d’une adaptation d’un personnage originellement publiée dans la revue Frontiers in Cellular Neuroscience2. Sa reproduction est d’accord avec maintien du droit d’auteur de frontières« politique auteurs ». S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Fluorescent in situ de confirmation hybridation (poissons) de l’insertion génomique du transgène TetO-DN-CB-myc6-Rb1 . Un Bureau2-CBRb (digoxigénine sonde/anti-DIG-HRP/tyramide-biotine/avidine-Cy5, en rouge) une sonde de test a été hybridée à splénocytes et oreille métaphase de cellules fibroblastes pour voir si le signal de la sonde pourrait être détecté ou non avec une taille d’insérer une copie cible de 2,5 kb. Le Bureau2-CBRb tester sonde hybride avec un chromosome 10 avec des signaux de sonde doublet lumineux, qui a montré l’insertion du transgène TetO-DN-CB-myc6-Rb1 dans le segment 10 C 3-D2. La sonde de contrôle RP23 - 267 24 (spectre vert) hybridé sur le chromosome 10 à bande 10 a 1 tel qu’attendu et confirmé que l’ADN de CBRb d’intérêt inséré dans le chromosome 10. (A), ce panneau affiche la bande G métaphase. (B), ce panneau affiche l’image de poisson tyramide signal amplification (TSA) de la métaphase même tel qu’illustré dans le groupe A. (C), ce panneau affiche des images composites du chromosome 10 montrant (1) G-bande, TSA (2) poisson, et TSA (3) poisson avec inversé des bandes DAPI. Rouge = Bureau2-CBRb sonde ; bleu = DAPI baguage ; vert = sonde de contrôle RP23 - 267 24. Echelle = 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Activation du transgène DN-CBRb dans l’oreille interne de postnatal (P) 36 TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA+ (CBRb+) et ROSA-CAG-rtTA+ (CBRb−) souris après 3 (groupe 1), 7 (groupe 2) et 10 (groupe 3) jours de Dox traitement. (A-C) Anti-RB1, qui réagit aux formes hyperphosphorylée et hypo-phosphorylée de RB1, ainsi que les anticorps bien comme anti-c-myc ont été utilisés pour la détection. Analyse densitométrique a été fait à l’aide de logiciels ImageJ. Les valeurs correspondantes obtenues ont été normalisées au témoin négatif CBRb− (-) et puis à la β-actine. Les niveaux d’expression RB1 relatifs sont indiqués sous chaque tache. (D) La représentation graphique des niveaux d’expression normalisées RB1 comploté contre la détection de faits saillants une RB1 toujours plus faibles de différents traitements dans CBRb+ (+) des échantillons. Chaque voie sur le gel du transfert de western et chaque colonne sur le graphique correspond à une personne différente. P < 0.05.This figure a été publiée dans la revue Frontiers in Cellular Neuroscience2. Sa reproduction est d’accord avec maintien du droit d’auteur de frontières« politique auteurs ». S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Analyses spatiales de l’activation du transgène TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA P18 TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA+ (+) et DN-CBRb+/ROSA-CAG-rtTA− négatif souris témoins (-) cœur, yeux, poumons et cochlée. (A) confirmant l’efficacité de l’activation de Dox-mediated transgene, l’expression de la RB1 endogène a été diminuée dans le CBRb+/ tissusROSA-CAG-rtTA+ , mais pas dans les tissus de souris de contrôle négatif. Analyse densitométrique a été exécuté comme décrit dans la Figure 5. Les niveaux d’expression RB1 relatifs sont indiqués sous chaque tache. (B) ce panneau affiche une représentation graphique des niveaux d’expression de RB1 normalisées comploté contre les différents tissus. Une variation inter-individuelle sur taux endogènes de RB1 peut expliquer les différences dans les réponses individuelles à l’activation de transgène et RB1 downregulation. (C) RT-PCR analyses dans le œil, cœur, et le limaçon a révélé une augmentation significative de la transcription TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA dans les tissus traités Dox TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA+ , mais pas dans le DN-CBRb+/ROSA-CAG-rtTA− négatif de groupe témoin. CBRb+/rtTA+ = TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA+; CBRb−/rtTA+ = ROSA-CAG-rtTA+; P < 0,05. Ce chiffre a été publié dans la revue Frontiers in Cellular Neuroscience2. Sa reproduction est d’accord avec maintien du droit d’auteur de frontières« politique auteurs ». S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Tableau 1 : condition PCR utilisées pour vérifier la CB-Rb1 région fusion.
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Discussion
Afin de contourner les limitations associées à des stratégies traditionnelles de transgéniques, nous avons cherché à créer un modèle de souris dans lequel un POI endogène peut être inactivé conditionnellement en surexprimant une forme mutante de DN de celui-ci d’une manière spatio-temporelle. Pour l’abolition de la fonction de POI endogène, plusieurs options ont été proposées15,16,17. Nous avons modifié une précédente stratégie génétique1 en combinant le système de transcription Dox-dépendante à une simple stratégie employant une fusion de la CB de protéases lysosomales pour générer un peptide mutant dont l’expression affecte l’expression de l’endogène POI2. Plus important encore, cette technique ne nécessite aucune connaissance préalable de la voie d’acheminement associée de l’IPE. La stratégie actuelle d’inhibition de protéine DN montre que le signal de localisation lysosomal sur le gène de fusion CBRb détourne l’ensemble du complexe interagissant avec RB vers le lysosome2,3. Une fois à l’intérieur du lysosome, traitement protéolytique de ces protéines est amorcé, conduisant à leur dégradation3. La propriété intrinsèque de la protéine fusionnés avec CB, associée à la capacité d’induction réversible du système TetO, cela fait une alternative utile aux stratégies traditionnelles de transgéniques (knock-out du gène complet, suppression conditionnelle), particulièrement lorsque le suppression complète du gène d’intérêt n’est pas souhaitable.
Nous nous sommes concentrés au départ de la recherche sur la protéine RB1. DN mutations sont plus facilement décrites dans les protéines qui fonctionnent comme un dimère ou multimères. A ce jour, il n’y a aucune preuve d’une interaction physique directe entre les molécules de RB1. Néanmoins, la nature de son activité permet la présence de plusieurs molécules de RB1 dans le même complexe à un moment donné. Par exemple, la liaison de hypo-phosphorylée RB1 à l’hétérodimère E2F1-DP fournit un site de liaison supplémentaires, qui est normalement occupé par l’histone désacétylase (HDAC)18,19,20. En revanche, HDAC1 interagit physiquement avec RB1 et ce complexe, se lie à son tour, à la sous E2F1-DP-RB1, fournissant ainsi de répression supplémentaire transcription18. Selon cette approche, si au moins une des molécules RB1 dans le groupe est un mutant DN, il empêchera le complexe de réprimer la transcription, alors qu’il réduit les niveaux de RB1 endogène, suscitant ainsi un phénotype RB1 null. Ici, endogène RB1 inhibition a été observée à 10 jours après l’administration de Dox dans l’eau potable. La dose optimale pour l’induction de Dox peut, cependant, nécessaire de déterminer empiriquement pour chaque système. En outre, étant donné que la majeure partie de la séquence du gène Rb1 a été utilisé sur le maquillage de la construction, il est possible que, même en l’absence de RB1 endogène, le mutant RB1 peut interagir avec et provoquer l’inhibition DN de l’un des partenaires de liaison de la RB1. Cette prémisse peut être testée en évaluant le niveau d’expression des molécules de RB1-liaison connues.
L’inactivation finement réglé, indispensable, temporelle et réversible de protéine serviront de base pour le développement d’une grande variété d’études dans un nombre encore plus large des domaines de recherche la recherche pour faire la lumière sur les mécanismes biochimiques complexes qui sous-tendent les différents aspects du gène et proteinactivity. Selon le POI, comprendre sa complexité moléculaire est susceptible d’améliorer la capacité des chercheurs à concevoir des stratégies thérapeutiques efficaces. Spécificité du transgène accrue est possible par la souris DN tissu-spécifiques promoteurs tTA ou rtTA lignes de conduite d’élevage.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Le Bureau2 + CB-Myc6 vector est un cadeau de Marshall Horwitz (University of Washington, Seattle, WA, é.-u.). Les cellules de HEI-OC1 ont été gracieusement fournis par Fedrico Kalinec (David Geffen School of Medicine, UCLA, Los Angeles, CA, é.-u.). Support technique a été fourni par l’UNMC souris Genome Engineering Core (C.B. Gurumurthy, Don Harms, Rolen Quadros) et la Creighton University intégré Biomedical Imaging Facility (Richard Hallworth, John Billheimer). Le génie du génome de souris UNMC a été soutenue par une bourse de développement institutionnel (IDea) de la NIH/NIGM, accorder le numéro P20 GM103471. La fonction intégrée Biomedical Imaging était soutenue par la Creighton University School of Medicine et subventions GM103427 et GM110768 de la NIH/NIGM. L’installation a été construite avec l’aide de subventions du National Center for Research Resources (RR016469) et la NIGM (GM103427). Les lignées de souris générées dans cette étude ont été maintenues à un centre de ressources de l’Université de Creighton Animal, dont l’infrastructure a été améliorée grâce à une subvention de NIH/RRRNC G20RR024001. Ce travail a reçu au-delà de prise en charge via un NIH/RRRNC 5P20RR018788-/ NIH/NIGM 8P20GM103471 COBRE accorder (à Shelley D. Smith), NIH/ORIP R21OD019745-01 a 1 (s.-S.) et une subvention de recherche émergents de la fondation de santé auditive (à S. Normand). Le contenu de cette recherche est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement l’opinion officielle de la National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM | GIBCO-BRL | 11965-084 | |
| Minimum Essential Medium Eagle, MEME | Sigma | M8042 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442 | |
| Lipofectamine | DharmaFECT | T-2010-03 | |
| Sal I | Roche | 11745622 | |
| EcoRV-HF | New England BioLabs | R3195S | |
| NotI | Roche | 13090730 | |
| CaspaTag | Millipore | APT523 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Staurosporine | Sigma | S4400 | |
| CyQuant NF cell proliferation kit | Invitrogen | C35007 | |
| Retinoblastoma 1 antibody | Abcam | Ab6075 | |
| c-Myc antibody | Sigma | M5546 | |
| b-actin | Sigma | A5316 | |
| Ki-67 | Thermofisher scientific | MA5-14520 | |
| Phallodin | Thermofisher scientific | A12379 | |
| Fluorescence microplate reader | FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech | ||
| Epifluorescence microscope | NikonEclipse80i | ||
| The TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) mouse line is available from the Jackson Laboratory as JAX#032011. |
References
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