Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Induserbart og reversibel dominerende-negativ (DN) Protein hemming

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58419
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Oral Biology, Creighton University School of Dentistry

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å utvikle en dominerende-negativ induserbart system, der alle protein kan betinget deaktiveres av reversibel overexpressing en dominerende-negativ mutert versjon av den.

Abstract

Dominerende-negativ (DN) protein hemming er en kraftig metode å manipulere protein funksjon og tilbyr flere fordeler over andre genomet tilnærminger. For eksempel, selv om chimeric og Grobunn-LoxP målretting strategier mye brukt, iboende begrensninger av disse strategiene (dvs. lekk promoter aktivitet, mosaikk grobunn uttrykk, etc.) har betydelig begrenset deres program. Videre er en fullstendig sletting av mange endogene gener embryonically dødelig, gjør det umulig å studere gen funksjon i postnatal liv. For å møte disse utfordringene vi har gjort betydelige endringer i en tidlig genteknologi protokoll og kombinert kort (transgene) versjon av Rb1 genet med en lysosomale protease procathepsin B (CB), til å generere en DN musemodell av Rb1 (CBRb). På grunn av tilstedeværelsen av en lysosomale protease rutes hele CB-RB1 fusion protein og dens samspill kompleks til proteasome-mediert fornedrelse. Videre kan tilstedeværelsen av et tetracycline induser (rtTA) element i transgene Konstruer en induserbart og reversibel regulering av RB1 protein. Tilstedeværelsen av en allestedsnærværende ROSA-CAG promoter i CBRb musemodell gjør det en nyttig verktøyet å utføre forbigående og reversibel Rb1 gene ablasjon og gi forskerne en ressurs for å forstå sin virksomhet i nesten en celle type hvor RB1 er uttrykt.

Introduction

De fleste tilnærminger sikte på gene og protein ablations stole på permanent prosesser, som vanligvis fører til fullstendig eliminering eller trunkering av genet, RNA sekvenser eller protein av interesse (POI). Det overordnede målet med denne metoden er å en rekombinant protein for å avskaffe funksjonen endogene, vill-type protein. Vi har revisited og fornyet en alternativ strategi1,2, som gir den midlertidige ablation en POI gjennom DN hemming. Denne metoden fungerer for både multimeric og monomerisk peptider men er best egnet for proteiner som fungerer i en multimeric samling.

Metoden består av blander den lysosomale protease CB til en undergruppe til en multimeric POI (CB fusion komplekse). Den resulterende CB fusion komplekse kan samhandle med og proteolytically fordøye endogene protein eller viderekoble hele CB-POI komplisert å lysosome være dårligere3. Dessuten, en kombinasjon av CB fusion kompleks med induserbart natur tetracycline-kontrollerte transcriptional Aktivisering (Tejo) systemet gir uttrykk induserbart og kontrollert av transgene i en reversibel mote2. Selv om det er nyttig i mange tilfeller, kan fullstendig sletting av gener eller proteiner i vivo føre dødelighet4,5,6. Likeledes, vev-spesifikke, betinget sletting av noen gener eller proteiner ved hjelp av grobunn/Lox systemet kan ikke være enkelt, som det vil til slutt føre til permanent tap av kritisk genomisk elements7. Derfor, avhengig av genet eller POI, ingen av disse metodene vil være effektiv inne skaffer nyttig modell for etterfølgende studier, spesielt gener eller proteiner funksjonelle studier i slutten postnatal og voksen mus.

For å omgå problemene knyttet til slike tilnærminger og gi bevis-av-prinsippet om effektiviteten av foreslåtte metoden, har vi valgt å teste metoden presentert her ved å generere en betinget DN versjon av Retinoblastoma 1 (RB1) protein. Flere alternativer er foreslåtte8,9,10 å avskaffe funksjonen av endogene RB1; men alle av dem møtte noen av de samme begrensningene som er beskrevet ovenfor: permanent germline sletting av RB1 er embryonically dødelig, og samsvar med sin tumor suppressor rolle, permanente RB1 betinget sletting fører til en rekke svulster11. Selv om en DN versjon av RB1 ikke synes å oppstå naturlig, et bedre alternativ tilgjengelig strategier bør tillate en timelig kontrollert inaktivering av endogene RB1 og tilbyr en alternativ mekanisme til slutt gjenopprette sine funksjonen. Grunnlaget for slik en konstruksjon ble beskrevet over to tiår siden1. Men på grunn av teknologiske begrensninger manglet det en mekanisme for å kontrollere transgene aktivering, svar og vev spesifisitet. Denne studien er først til å kombinere eleganse doxycycline (Dox)-avhengige transcriptional system med en konstruert transgene konstruere lysosomale protease CB og Rb1 proteiner. Den resulterende CBRb mus modellen gir en midlertidig regulert Dox-mediert RB1 forskrift2. Fordelen av benytter slik proteom-basert tilnærming til å studere gen funksjon er at det kan bli vedtatt for noen genet av interesse, med minimal informasjon om sin virksomhet.

Den foreslåtte DN transgene strategien gir mange fordeler over tradisjonelle tilnærminger. Først fører DN protein hemming til bare en delvis ablasjon i protein aktivitet, dermed bevare en gjenværende endogene uttrykk. Slikt resultat er svært ønskelig i situasjoner der en fullstendig eliminering av protein aktivitet fører til embryonale dødelighet, sterkt begrense en undersøkelse for å studere gen funksjon i levende mus. Andre kan tilstedeværelsen av Tejo systemet transgene aktivisering kun gjennom en antibiotika, noe som gir en effektiv og reversibel kontroll av transgene aktivitet. Dermed transgene systemet kan deaktiveres ved opphør av antibiotikumet administrasjon, og et vanlig RB1 uttrykk er tilbake på plass. Tredje kan spesifisiteten av transgene uttrykket variere avhengig av arrangøren av valg. Mens vi har valgt allestedsnærværende ROSA-CAG arrangøren for bevis-av-prinsippet, er plassere transgene under en vev-spesifikke promoter sannsynlig å begrense uønsket transgene uttrykk og lette studier på terapeutiske anvendelse av denne transgene metodikk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Generasjon av transgene CBRb musen og alle dyr omsorg og eksperimenter med studien ble godkjent av Creighton University institusjon for dyr og bruk Committee (IACUC) og fremført av sine retningslinjer.

1. transgene CB-Myc6-Rb1 konstruksjon

Merk: Kloning av CBRb i en pTet_Splice vektor ble gjort i en flertrinnsprosess (figur 1A og 1B).

  1. Utføre første stadium kloning i pCS2 + CB-Myc6 vektor.
    1. Opprette CBRb transgene Konstruer, forsterke et 1583-bp-lang Rb1 cDNA fragment (528 aminosyrer tilsvarende aminosyre regionen 369-896) av RB1 protein bruker følgende primer sett: EcoRI +RB 1243F, bruker GGGGAATTCA TTAAATTCAGCAAGTGATCAACCTTC, og XbaI + EcoRV +RB 2826R, bruke CCCTCTAGATATCTATTTGGACTCTCCTGGGAGATGTTTACTTCC.
    2. Klone fragmentet generert (1546 bp) mellom EcoR1 og XbaI begrensning områder av pCS2 + CB-Myc6 vektor som beskrevet tidligere1,12.
      Merk: Den 1012-bp lange CB-Myc6 konstruksjonen (337 aminosyrer) smeltet til Rb1 fragment resulterte i et protein av ca 865 aminosyrer (ca 108 kDa), som er litt mindre enn endogene RB1 protein (~ 110 kDa) (figur 1 En), med en CB-Myc6 kode på N-terminus og Rb1 på C-terminus.
  2. Utføre den andre scenen subcloning i pTet-Splice vektoren.
    1. Forsterke CB-RB-Myc6 fusion fragmentet og få Tet-arrangøren, forsterke kassetten, som består av CB-myc6-Rb1 med primere med EcoRV (XbaI + EcoRV + RB 2826R) og SalI områder: for SalI +CBF, Bruk CCAGTCGACAGGATGTGGTGGTCCTTGATCCTTC.
    2. Subclone fragmentet generert (2567 bp) i pTet-Splice vektor, mellom SalI og EcoRV begrensning områder, på en slik måte at det hele Tejo-DN-CB-myc6-Rb1 transgene, inkludert SV40 intron og PolyA signal, kan være isolert gjennom en enkelt fordøyelsen med NotI (figur 1B).
      Merk: NotI-fragment ble brukt til å generere transgene fond.

2. i Vitro Testing av Transgene Tejo-DN-CB-myc6-Rb1

  1. Dox-regulering: NIH3T3 cell linje
    Merk: Med mindre annet er oppgitt, er alle volumer justert for en 6-vel plate.
    1. Vokse NIH3T3 celler etter leverandørens spesifikasjoner, med det anbefalte celle kultur mediet som inneholder 10% fosterets bovin serum på 37 ° C med 10% CO2.
    2. Cotransfect cellene med pTet-Splice og pCMV-Tet3G vektorer (fra trinn 1) for 24 h. følger trinnene nevnt nedenfor for cotransfection.
      1. Bland 2-4 µL av lipid-baserte transfection reagens/brønnen og 1 mL av ufullstendig (uten serum) Dulbecco endret Eagle Medium (DMEM) i 5 minutter ved romtemperatur. For en 12 - eller 24-godt plate, bruk 250 eller 500 µL kultur medier, henholdsvis, og justere transfection reagens volumet tilsvarende.
      2. Legge til 2-3 µg av plasmider DNA/godt hva reagens-DMEM og ruge for 20 min ved romtemperatur.
      3. Legg blandingen inneholder DNA og transfection reagensen i DMEM i hver brønn. Etter 3-4 h med inkubering, Legg 1 mL av komplett (slik at det siste bindet er 2 mL/vel). Holde dele Dox lager (1 mg/mL) og legge 2 µL i hver av brønner (+ Dox). Inkuber cellene på 37 ° C med 5% CO2.
        Merk: Kontroll prøver bør bestå av cotransfected celler ikke behandles med Dox (-Dox), samt NIH3T3 celler transfekterte bare med transactivator pCMV-Tet3G vektoren og behandlet med Dox for en 24-timers periode. For pCMV-Tet3G, konsentrasjoner av 0,1 til 1 µg/mL Dox bør være tilstrekkelig til å indusere transgene uttrykket.
  2. Test Reversibilitet av Konstruer ved hjelp av HEK293 celle linjen.
    1. Teste den Reversibilitet av transgene Tejo-DN-CB-myc6-Rb1 , kultur HEK293 celler i Eagle's Minimum viktig Medium (EMEM) etter leverandørens spesifikasjoner og cotransfect med både pTet-Splice og pCMV-Tet3G vektorer for 24 h, som beskrevet ovenfor (trinn 2.1.2).
    2. For transgene inaktivering, fjerne Dox inneholder media etter 24 timer, vaske celler 2 x-3 x med fosfat bufret saltvann (PBS) og ruge dem på Dox-frie medier for en ekstra 24 h.
      Merk: På Dox-fjerning, skal transgene deaktivering og vanlige protein uttrykk gjenopptas innen 24 timer perioden.
  3. For å vurdere funksjonaliteten til den Tejo-DN-CB-myc6-Rb1 -konstruere å fremme elektronisk celle spredning, kan du utføre de funksjonelle analysene bruker en HEI-OC1 celle linje, som beskrevet nedenfor.
    1. Kultur HEI-OC1 celler i 10% DMEM under ettergivende forhold (33 ° C med 10% CO2). For celle spredning studier, telle celler ved hjelp av en celle teller og plate 10.000 HEI-OC1 celler på en 96-brønns plate i et 200 µL volum. Inkuber cellene over natten.
    2. På dagen kan du utføre en forbigående cotransfection av pTet-Splice og pCMV-Tet3G vektorer ved hjelp av en lipid-baserte transfection reagens (se trinnene 2.1.2). I en separat Vel, utføre pmR-ZsGreen1 hva at2-µg bruke lipid-baserte transfection reagensen (trinn 2.1.2) til å beregne hva hastigheten. Bruk ikke-transfekterte celler som kontroller.
    3. Oppdage tilstedeværelsen av grønne fluorescens under fluorescens mikroskop (eksitasjon = 485 nm, utslipp = 530 nm) for de transfekterte cellene 24 timer etter hva. Registrere tilstedeværelse eller fravær av grønne fluorescens og Beregn frekvensen av hva som antall GFP-positive celler (transfekterte celler) over cellene merket med DAPI (totalt celler).
      Merk: Vi beregnet en transfection rate på ~ 70%.
    4. For å indusere transgene uttrykk, Legg 1 µg/mL Dox et delsett av transfekterte celler mens du bruker andre delsettet som kontroll (-Dox). Bruke ubehandlet HEI-OC1 celler som flere kontroller.
    5. For å vurdere celle spredning, kan du bruke en celle spredning kit i henhold til produsentens protokollen.
      1. I korthet, 48 timer etter transfection, fjerner celle kultur medium og legge 100 µL av 1 x fargestoff-forpliktende løsning i hver brønn av microplate. Inkuber 1t på 37 ° C.
      2. Deretter måle fluorescens intensiteten av hvert utvalg bruker en fluorescens microplate reader (eksitasjon = 485 nm, utslipp = 530 nm).
    6. Å vurdere celle spredning med immunocytochemistry, plate HEI-OC1 cellene i et cover glass i en 12-vel plate og ruge over natten på 37 ° C.
      1. På dagen cotransfect med pTet-Splice og pCMV-Tet3G og utføre Dox behandling (+ Dox). Bruk untransfected celler som kontroller. Behandle HEI-OC1 celler for Ki-67 merking.
      2. Fastsette cellene med 4% paraformaldehyde (PFA) i PBS, pH 7.4, i 10 minutter ved romtemperatur. Vask cellene 3 x med iskald PBS og Inkuber cellene i 0.25% ikke-ioniske vaskemiddel i PBS i 10 min.
      3. Vask cellene igjen, 3 x i PBS for 5 min og blokk med 10% serum i en fuktet kammer 1t ved romtemperatur.
      4. Inkuber cellene i 500 µL Ki-67 primære antistoff (1:200 fortynning) for 3t ved romtemperatur eller over natten på 4 ° C.
      5. Vask cellene 3 x i 5 min med PBS. Etter at ruge cellene med sekundær antistoffer 1t ved romtemperatur i mørket.
      6. Fjerne sekundære antistoff løsningen og vask cellene 3 x med PBS i 5 min hver i mørket.
      7. For phalloidin merking, ruge HEI-OC1 cellene i 1:200 phalloidin i 30 min. Hvis etiketten kjerner i celler, ruge cellene med 5 µg/mL DAPI i 10 min ved romtemperatur.
        Merk: Kontroller at phalloidin fargestoff konjugert er annerledes enn den sekundære antistoff konjugert.

3. generasjon CBRb+/ROSA-CAG-rtTA+ (CBRb) transgene mus og i Vivo Testing av DN-CBRb tilnærming

  1. Ved bekreftelse av effektiv Dox regulering av transgene Tejo-DN-CB-myc6-Rb1 , rense NotI fragmentet og microinject dem i musen zygotes, som senere overføres til pseudo gravide kvinner.
    Merk: Disse prosedyrene ble utført ved University of Nebraska Medical Center (UNMC) musen genomet Engineering Core anlegget.
  2. Etter levering, genotype pups bruker en primer satt spesifikke til regionen CB-Rb1 fusion: for CBRb F, bruk 5' CTGTGGCATTGAATCAGAAATTGTGGCTGG 3, og for CBRB R, bruk 5 ' GTACTTCTGCTATATGTGGCCATTACAACC 3.
    Merk: PCR produktet observert på agarose gel er 401 bp (60-bp CB region + 341-bp Rb1 regionen (tabell 1). Ti uavhengig grunnlegger linjer ble identifisert basert på tilstedeværelsen av transgene Tejo-DN-CB-myc6-Rb1 . Om fem av disse linjene arvet avkom transgene, som bekreftet germline overføring av av transgene. En av transgene linjene ble til slutt brukt til å etablere og vedlikeholde linjen og generere forsøksdyr Tejo-DN-CB-myc6-Rb1 for videre studier.
  3. Rase voksen Tejo-DN-CB-myc6-Rb1 mus til ROSA-CAG-rtTA tetracycline induser linje (lager #006965) (eventuelt rase til en tTA induser linje) for å generere eksperimentelle DN-CBRb mus. Genotype avkom av dette kors med følgende primer sett: rtTA-WT R, bruker GGAGCGGGAGAAATGGATATG; rtTA Mutant R, bruk GCGAGGAGTTTGTCCTCAACC; og rtTA Common, bruker AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT. PCR produktet størrelsene er 340 bp (mutant), 340 bp og 650 bp (heterozygot) og 650 bp (vill-type).
  4. Generere en dose-respons kurve av RB1 protein etter Dox behandling å finne tid og lengden av Dox behandling nødvendig å lokke fram et transgene uttrykk.
    Merk: I dette eksperimentet, ble western blot og qRT PCR brukt til å vurdere vev-spesifikke transgene aktivisering og RB1 uttrykk.
  5. Utføre fluorescens i situ hybridisering (fisk) å bekrefte genomisk innsetting av transgene.
    Merk: Dette ble utført ved Centre for brukt Genomics av sykehuset for syke barn (Toronto, Canada). ELISA eller vestlige blotting (med protein-spesifikke antistoffer) kan brukes til å vurdere transgene aktivisering, vev-spesifisitet og endringer i nivåer av endogen POI. For den DN-CB-myc6-Rb1 konstruksjonen brukte vi et anti-RB1 antistoff.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vanligvis krever utforme en DN mutasjon en betydelig mengde informasjon om strukturen og funksjon av POI. Derimot er DN strategien presenteres her spesielt nyttig når strukturelle og funksjonelle informasjonen for SEVERDIGHETEN er begrenset. Hvis POI er et protein som multimeric, en blanding av én delenhet til en lysosomale protease nesten kun kan hemme den sammensatte multimer og eventuelt andre ligander gjennom en kombinasjon av proteolyse av de endogene underenheter og subcellular avledning av den multimer til lysosome. For å bekrefte vellykket kloning og teste effektiviteten av Dox regulert transgene aktivisering, renset pTet-Splice plasmider inneholder Tejo-DN-CB-myc6-Rb1 konstruksjon var transfekterte i mus NIH3T3 celler som stabilt uttrykt i rtTA protein, men ikke Rb113. I fravær av Dox vises celler uttrykke rtTA ingen RB1 uttrykk, mens en robust RB1 uttrykket ble observert i nærvær av Dox (figur 2A). Neste, for å teste Reversibilitet av systemet, vi cotransfected HEK293 celler (som endogenously express Rb114) med renset pTet-skjøte /Tejo-DN-CB-myc6-Rb1 og pCMV-Tet3G vektorer. Som forventet, var uttrykket av endogene RB1 protein betydelig hemmet på transgene aktivisering med tillegg av Dox i celle kultur media (figur 2B). For å teste Reversibilitet av systemet, etter en 24-timers periode, i et delsett av HEK293 celler, vi erstattet Dox inneholder celle kultur media med fersk Dox-frie medier og ruges celler for en ekstra 24 h. støtte Dox regulert Reversibilitet, RB1 uttrykket ble restaurert på Dox fjerning fra kultur media (figur 2B). Transfekterte HEK293 celler som ikke ble behandlet med Dox eller Dox-behandlet HEK293 celler transfekterte med pCMV-Tet3G vektoren bare (figur 2B) viste basale nivåer av endogen RB1 uttrykk. Fordi NIH3T3 celler ikke uttrykke RB1 protein naturlig, skyldes positiv RB1 reaktivitet opphopning av transgene RB1 protein. Gitt vår interesse potensielle proliferativ effekten av Tejo-DN-CB-myc6-Rb1 -konstruksjon i hørselen, vi målt DNA innholdet i pTet-skjøte /Tejo-DN-CB-myc6-Rb1- og pCMV-Tet3G-transfekterte HEI-OC1 celler () indre øret orgel Corti-avledet celle linjen) i tilstedeværelse og fravær av Dox. Samsvar med arbeidsgruppen hypotesen presenteres her, en betydelig økning i DNA innholdet (tilsvarende en økning i celle nummer) ble observert i Dox-behandlet men ikke ubehandlet (kontroll) transfekterte HEI-OC1 celler (figur 3A - 3 C ).

Etter at i vitro av transgene aktivitet og funksjonen, en transgene musemodell ble generert. FISK, bruker en Tejo-DN-CB-myc6-Rb1 digoxigenin (graver)-hest reddik peroxidase (HRP) / tyramine-biotin/avidin-Cy5-merket probe og G-striper av mannlige mus splenocytes og øret fibroblaster ble utført for å bekrefte transgene innsetting i den transgene mus genom. Blant de fem germline overføring grunnleggerne, linje 14 viste en konsekvent transgene innsettingspunktet innenfor segmentet 10C 3 ~ D2 (figur 4A - 4 C). Mus fra denne linjen ble brukt til å etablere avl koloniene og generere forsøksdyr for videre studier. For å avgjøre det optimale tidspunktet for Dox induksjon og Tejo-DN-CB-myc6-Rb1 transgene aktivisering, vi delt transgene musene i tre forskjellige grupper, der Dox ble gitt i drikkevann for variable lengder tid: gruppe 1 (3 dager behandling), gruppe 2 (7 dager behandling) og gruppe 3 (10 dager behandling). Ved ferdigstillelse av behandling, ble endringer i RB1 protein uttrykket vurdert av vestlige blotting (figur 5A - 5 D). Fordi DN og innfødte RB1 proteiner har lignende molekylvekt, kan ikke de løses fra hverandre på en western blot. Imidlertid konsekvent med en subtil i RB1 protein (på grunn av opphopning av DN-RB1 og endogene proteiner), det var en første økning i total RB1 protein uttrykk i transgene musen cochleae sammenlignet med kontrollgruppen (figur 5 A). dessuten konsekvent med hemmende og proteolytisk aktivitet av Tejo-DN-CB-myc6-Rb1 transgene produktet, målbare reduksjon i RB1 uttrykk ble observert i grupper 2 og 3 sammenlignet gruppe 1 og kontroll grupper ( Figur 5A - 5 D). Av notatet resulterte behandling lengre enn 10 dager ikke i noen ytterligere RB1 protein uttrykk. Dermed 10 dager av Dox behandling ble regnet som optimalt og brukes for ytterligere studier.

Fordi de rtTA og følgelig Tejo-DN-CB-myc6-Rb1 transgene aktivisering er under allestedsnærværende ROSA-CAG arrangøren, RB1 kan være potensielt hemmet i vev eller cellen der RB1is endogenously uttrykt (f.eks lungene, hjertet, netthinnen). For å teste dette premisset og evaluere den transgene vev spesifisitet, cochleae, lungene, hjertet og øyet biopsier ble dissekert fra TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA, og kontroll mus (ikke bærer ROSA-CAG-rtTA transgene) var vurdert for RB1 uttrykk (figur 6A - 6 C). Uansett vevet analysert, ble en betydelig reduksjon i RB1 protein observert i TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA men ikke i kontrollgruppen (figur 6en). I skarp kontrast, PCR qRT analyserer i øye, hjerte og cochleae av Dox-behandlet TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA og alder-matchet kontroll mus viste en betydelig oppregulering av DN-CBRb transkripsjon i vev av den tidligere, men ikke den sistnevnte mus (figur 6C). Til sammen bekrefter disse resultatene effektiviteten av Konstruer. En økning i transkripsjon uttrykket gjenspeiler effektiv Dox regulert transgene induksjon. Likeledes, en reduksjon i protein uttrykk er konsekvent med ruting og proteolytisk nedbrytningen av endogene RB1.

Figure 1
Figur 1: flere trinn kloning av CBRb og generering av den induserbart TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA. (A) dette panelet viser kloning av Rb1 fragment i pCS2-CB-Myc6 vektor. En 1583-bp Rb1 gene produktet var PCR forsterket med EcoRI + RB1243 frem og Xba + EcoRV + RB2826 omvendt primere. Det resulterende Rb1 fragmentet ble klonet mellom EcoRI og Xbal begrensning områder av pCS2 vektoren som inneholder den CB-Myc6 konstruksjonen for å generere pCS2 + CB-myc6 + Rb1 vektoren. (B) på CB-myc6 + Rb1 fragmenter ble klonet inn pTetSplice vektor mellom SalI og EcoRV begrensning områder. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Effektiviteten av Dox regulert transgene aktivisering. (A) NIH3T3 celler ikke vanligvis uttrykke RB113. Bekrefter effektiv aktivering av Tejo-DN-CB-myc6-Rb1 -konstruksjon, avdekket en western blot analyse med anti-RB1 antistoffer et robust RB1 uttrykk i nærvær av Dox (baner 1 og 3), men ikke i sitt fravær (baner 2 og 4). (B) HEK293 celler, som endogenously express Rb114, var cotransfected med Tejo-DN-CB-myc6-Rb1 og pCMV-Tet3G transactivator vektor. I fravær av Dox (lane 1), ble et positivt RB1 uttrykk observert. Tillegg av Dox til systemet forårsaket Tejo-DN-CB-myc6-Rb1 aktivisering og RB1 downregulation (lane 2). Det RB1 uttrykket ble gjenopptatt 24 timer etter Dox ble fjernet fra media (lane 3). C = kontroll, untransfected HEK293 celler ikke behandles med Dox. Dette er en tilpasning fra en figur opprinnelig publisert i tidsskriftet grenser i mobilnettet nevrovitenskap2. Dens reproduksjon enig med grenser'politikk på forfattere' opphavsrett oppbevaring. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Figure 3
Figur 3 : Dox-mediert DN-CBRb transgene aktivisering øker celle spredning. (A) HEI-OC1 celler cotransfected med renset Tejo-DN-CB-myc6-Rb1og pCMV-Tet3G vektorer ble kultivert i fravær (−) eller tilstedeværelse (+) av Dox. Celle spredning identifiserte 48 timer etter hva bruker en spredning analysen. Prosentvis endring i spredning ble beregnet med en endring i fluorescens verdier med untransfected celler som en kontroll. En liten men betydelig økning i celle nummer ble observert i de transfekterte cellene, etter Dox behandling. Derimot ingen vesentlige endringer ble observert mellom transfekterte HEI-OC1 celler ikke behandles med (−) Dox og kontrollen untransfected. (B) HEI-OC1 celler untransfected eller (C) cotransfected med renset Tejo-DN-CB-myc6-Rb1 og pCMV-Tet3G vektorer kulturperler på tilstedeværelse (+) av Dox ble merket med Ki-67 (rød), Phalloidin (grønn) og DAPI (blå). P < 0,05. Skala bar = 10 µm. Dette er en tilpasning fra en figur opprinnelig publisert i tidsskriftet grenser i mobilnettet nevrovitenskap2. Dens reproduksjon enig med grenser'politikk på forfattere' opphavsrett oppbevaring. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Fluorescerende i situ hybridisering (fisk) bekreftelse av genomisk innsetting av transgene Tejo-DN-CB-myc6-Rb1 . En pCS2-CBRb (digoxigenin sonde/anti-DIG-HRP/tyramide-biotin/avidin-Cy5, i rødt) test sonde ble hybridiserte splenocytes og øret fibroblast celle metaphase å se hvis sonde signalet kunne registreres eller ikke med en en-Kopieringsmålet sett inn størrelsen på 2,5 kb. PCS2-CBRb test sonde hybridiserte til ett Kromosom 10 med lyse, doublet sonde signaler som viste innsetting av Tejo-DN-CB-myc6-Rb1 -transgene innen segmentet 10 C 3-D2. RP23 - 267G 24 (spektrum grønn) kontroll sonden hybridiserte til Kromosom 10 på bandet 10A1 som bekreftet at CBRb DNA av interesse inn Kromosom 10. (A) dette panelet viser G-bandet metaphase. (B) dette panelet viser tyramide signal forsterkning (TSA) fisk bildet fra det samme metaphase som vist i panelet A. (C) dette panelet viser sammensatte bilder av Kromosom 10 viser (1) G-striper, (2) TSA fisk, og (3) TSA fisk med invertert DAPI striper. Rød = pCS2-CBRb probe; blå = DAPI striper; grønn = RP23 - 267G 24 kontroll sonde. Skala bar = 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : DN-CBRb transgene aktivering i det indre øret av postnatal (P) 36 TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA+ (CBRb+) og ROSA-CAG-rtTA+ (CBRb−) mus etter 3 (gruppe 1), 7 (group 2), og 10 (gruppe 3) dager av Dox behandling. (A-C) Anti-RB1, som reagerer med både hyperphosphorylated og hypophosphorylated former for RB1, så vel som anti-c-myc antistoffer ble brukt for påvisning. Densitometric analyse ble gjort ved hjelp av ImageJ programvare. De tilsvarende verdiene hentes var normalisert til kontrollen negative CBRb− (-) og deretter til β-utgangen. Relativ RB1 uttrykk nivåer vises under hver blot. (D) Den grafiske representasjonen av normaliserte RB1 uttrykk nivåer plottet mot ulike behandlinger høydepunkter en konsekvent nedre RB1 påvisning i CBRb+ (+) prøver. Hver kjørefelt på western blot gel og hver kolonne på grafikken svarer til en annen person. P < 0.05.This figur ble opprinnelig publisert i tidsskriftet grenser i mobilnettet nevrovitenskap2. Dens reproduksjon enig med grenser'politikk på forfattere' opphavsrett oppbevaring. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 : Romlige analyser av TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA transgene aktivisering i P18 TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA+ (+) og DN-CBRb+/ROSA-CAG-rtTA− negativ kontroll (-) mus hjerte, øye, lungene og sneglehuset. (A) bekrefter effektiviteten av Dox-mediert transgene aktivisering, uttrykk for den endogene RB1 var downregulated i CBRb+/ROSA-CAG-rtTA+ vev, men ikke i negativ kontroll mus vev. Densitometric analyse ble gjennomført som beskrevet i figur 5. Relativ RB1 uttrykk nivåer vises under hver blot. (B) dette panelet viser en grafisk visning av normaliserte RB1 uttrykk nivåer plottet mot ulike vev. En interindividuelle variant på RB1 endogene kan forklare forskjeller i individuelle svar transgene aktivisering og RB1 downregulation. (C) RT PCR analyserer i øye, hjerte, og cochleae viste en betydelig oppregulering av TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA transkripsjon i Dox-behandlet TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA+ vev, men ikke i DN-CBRb+/ROSA-CAG-rtTA− negativ kontrollgruppe. CBRb+/rtTA+ = TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA.+; CBRb−/rtTA+ = ROSA-CAG-rtTA+; P < 0,05. Dette tallet ble opprinnelig publisert i tidsskriftet grenser i mobilnettet nevrovitenskap2. Dens reproduksjon enig med grenser'politikk på forfattere' opphavsrett oppbevaring. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Table 1
Tabell 1: PCR stand brukt for kontroll av CB-Rb1 fusion regionen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For å omgå begrensningene knyttet til tradisjonelle transgene strategier, forsøkte vi å generere en musemodell der en endogen POI kan betinget deaktiveres av overexpressing en DN mutant form for det på en spatiotemporal måte. For å avskaffe funksjonen av endogene severdigheter, er flere alternativer foreslått15,16,17. Vi har endret en tidligere genetisk strategi1 ved å kombinere Dox-avhengige transcriptional systemet til en enkelt strategi ansettelse sammensmeltingen av lysosomale protease CB å generere en mutant peptid som uttrykk påvirker uttrykk for den endogene POI2. Viktigst, krever teknikken ingen forkunnskaper veien knyttet til SEVERDIGHETEN. Den nåværende strategien til DN protein hemming viser at lysosomale lokalisering signalet på CBRb fusion genet viderekobling hele RB-samspill komplekset mot lysosome2,3. En gang inne lysosome, proteolytisk behandling av disse proteinene er startet, fører til deres fornedrelse3. Egenskapen iboende av CB-smeltet protein, knyttet til reversibel inducibility av Tejo systemet, gjør dette et nyttig alternativ til tradisjonelle transgene strategier (f.eks komplett genet knockout, betinget sletting), særlig når det fullstendig sletting av genet av interesse er ikke ønskelig.

Vi fokuserte først forskning på RB1 protein. DN mutasjoner er lettest beskrives i proteiner som fungerer som en dimer eller multimers. Hittil er det ingen bevis for en direkte fysisk interaksjon mellom RB1 molekyler. Likevel, den iboende naturen sin aktivitet kan for tilstedeværelsen av flere RB1 molekyler i samme kompleks på et gitt tidspunkt. Binding av hypophosphorylated RB1 til E2F1-DP heterodimer inneholder for eksempel en ekstra binding området, som er normalt okkupert av histone deacetylase (HDAC)18,19,20. På den annen side, HDAC1 samhandler fysisk med RB1 og dette komplekset, i sin tur binder til E2F1-DP-RB1 heterotrimer, noe som gir ekstra transkripsjon undertrykkelse18. Ifølge denne hvis minst én av RB1 molekyler i gruppen er en DN mutant, hindrer det komplekset repressing transkripsjon, mens den reduserer nivået av endogene RB1, dermed fremlokkende en RB1 null fenotypen. Her ble endogene RB1 hemming observert 10 dager etter administrasjon av Dox i drikkevann. Optimale dosen for Dox induksjon kan, men må bestemmes empirisk for hvert system. Videre, siden de fleste av Rb1 genet sekvensen ble brukt på konstruere makeup, er det mulig at selv i fravær av endogene RB1, mutant RB1 kan samhandle med og framprovosere DN hemming av noen av de RB1 binding partnere. Dette premisset kan testes ved å vurdere hvilket uttrykk kjent RB1-binding molekyler.

Sårt tiltrengte, fint regulert timelige og reversibel protein inaktivering gir grunnlaget for utviklingen av en rekke studier i et enda større antall forskningsfelt søke for å belyse komplekse biokjemiske mekanismene bak ulike aspekter av gene og proteinactivity. Avhengig av SEVERDIGHETENE, forstå sin molekylære kompleksitet er sannsynlig å forbedre forskernes mulighet til å utforme vellykket strategier. Økt transgene spesifisitet kan oppnås av avl DN musen til vev-spesifikke arrangører kjøring tTA eller rtTA linjer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

PCS2 + CB-Myc6 vektor var en gave fra Marshall Horwitz (University of Washington, Seattle, WA, USA). HEI-OC1 cellene fotograferingen av Fedrico Kalinec (David Geffen School of Medicine, UCLA, Los Angeles, CA, USA). Kundestøtte ble levert av UNMC musen genomet Engineering kjernen (C.B. Gurumurthy, Don Harms, Rolen Quadros) og Creighton University integrert biomedisinsk bildebehandling anlegget (Richard Hallworth, John Billheimer). I UNMC musen genomet Engineering ble støttet av en institusjonell utvikling pris (idé) fra NIH/NIGMS, gi nummer P20 GM103471. Integrert biomedisinsk bildebehandling anlegget ble støttet av Creighton University School of Medicine og gir GM103427 og GM110768 fra NIH/NIGMS. Anlegget ble bygget med støtte fra tilskudd fra National Center for forskning ressurser (RR016469) og NIGMS (GM103427). Musen linjene generert i denne studien ble opprettholdt på Creighton Universitys dyr ressurs anlegget, som infrastruktur ble forbedret gjennom et stipend ved NIH/NCRR G20RR024001. Dette arbeidet fikk forbi støtte gjennom en NIH/NCRR 5P20RR018788 - NIH/NIGMS 8P20GM103471 COBRE gi (til Shelley D. Smith), NIH/ORIP R21OD019745-01A1 (S.M.R.-S.) og en nye forskningsstipend fra Hearing Health Foundation (til S. Tarang). Innholdet i denne forskningen er ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synet til National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM GIBCO-BRL 11965-084
Minimum Essential Medium Eagle, MEME  Sigma  M8042
Fetal bovine serum Sigma  F2442 
Lipofectamine  DharmaFECT T-2010-03
Sal I Roche 11745622
EcoRV-HF New England BioLabs R3195S
NotI Roche 13090730
CaspaTag  Millipore APT523
DAPI Sigma  D9542
Staurosporine Sigma  S4400
CyQuant NF cell proliferation kit  Invitrogen C35007
Retinoblastoma 1 antibody Abcam Ab6075
c-Myc antibody Sigma  M5546
b-actin Sigma  A5316
Ki-67  Thermofisher scientific MA5-14520
Phallodin Thermofisher scientific A12379
Fluorescence microplate reader FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech
Epifluorescence microscope  NikonEclipse80i
The TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) mouse line is available from the Jackson Laboratory as JAX#032011. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, F. Q., et al. Preferential MyoD homodimer formation demonstrated by a general method of dominant negative mutation employing fusion with a lysosomal protease. Journal of Cell Biology. 135 (4), 1043-1057 (1996).
  2. Tarang, S., et al. Generation of a retinoblastoma (rb)1-inducible dominant-negative (DN) mouse model. Frontiers Cellular Neuroscience. 9 (52), (2015).
  3. Kominami, E., et al. The selective role of cathepsins B and D in the lysosomal degradation of endogenous and exogenous proteins. FEBS Letters. 287 (1-2), 189-192 (1991).
  4. Cortellino, S., et al. Defective ciliogenesis, embryonic lethality and severe impairment of the sonic hedgehog pathway caused by inactivation of the mouse complex A intraflagellar transport gene Ift122/Wdr10, partially overlapping with the DNA repair gene Med1/Mbd4. Developmental Biology. 325 (1), 225-237 (2009).
  5. Ferreira, C., et al. Early embryonic lethality of H ferritin gene deletion in mice. Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3021-3024 (2000).
  6. Lee, E. Y., et al. Mice deficient for rb are nonviable and show defects in neurogenesis and haematopoiesis. Nature. 359 (6393), 288-294 (1992).
  7. Turlo, K. A., et al. When cre-mediated recombination in mice does not result in protein loss. Genetics. 186 (3), 959-967 (2010).
  8. Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).
  9. Zhang, J., et al. The first knockout mouse model of retinoblastoma. Cell Cycle. 3 (7), 952-959 (2004).
  10. Zhao, H., et al. Deletions of retinoblastoma 1 (Rb1) and its repressing target S phase kinase-associated protein 2 (Skp2) are synthetic lethal in mouse embryogenesis. Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10201-10209 (2016).
  11. Yamasaki, L., et al. Loss of E2F-1 reduces tumorigenesis and extends the lifespan of Rb1(+/-) mice. Nature Genetics. 18 (4), 360-364 (1998).
  12. Li, F. Q., et al. Selection of a dominant negative retinoblastoma protein (RB) inhibiting satellite myoblast differentiation implies an indirect interaction between MyoD and RB. Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5129-5139 (2000).
  13. Pitkanen, K., et al. Expression of the human retinoblastoma gene product in mouse fibroblasts: Effects on cell proliferation and susceptibility to transformation. Experimental Cell Research. 207 (1), 99-106 (1993).
  14. Chano, T., et al. Neuromuscular abundance of RB1CC1 contributes to the non-proliferating enlarged cell phenotype through both RB1 maintenance and TSC1 degradation. International Journal of Molecular Medicine. 18 (3), 425-432 (2006).
  15. Kole, R., et al. RNA therapeutics: Beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (2), 125-140 (2012).
  16. Yamamoto, A., et al. The ons and offs of inducible transgenic technology: A review. Neurobiology of Disease. 8 (6), 923-932 (2001).
  17. Houdebine, L. M., et al. Transgenic animal models in biomedical research. Methods in Molecular Biology. 360, 163-202 (2007).
  18. Brehm, A., et al. Retinoblastoma protein recruits histone deacetylase to repress transcription. Nature. 391 (6667), 597-601 (1998).
  19. Lu, Z., et al. E2F-HDAC complexes negatively regulate the tumor suppressor gene ARHI in breast cancer. Oncogene. 25 (2), 230-239 (2006).
  20. Magnaghi-Jaulin, L., et al. Retinoblastoma protein represses transcription by recruiting a histone deacetylase. Nature. 391 (6667), 601-605 (1998).

Tags

Genetikk problemet 143 dominerende-negativ retinoblastoma preprocathepsin (CB) reversibel induserbart transgene
Induserbart og reversibel dominerende-negativ (DN) Protein hemming
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tarang, S., Pyakurel, U., Doi, S. M. … More

Tarang, S., Pyakurel, U., Doi, S. M. S. R., Weston, M. D., Rocha-Sanchez, S. M. Inducible and Reversible Dominant-negative (DN) Protein Inhibition. J. Vis. Exp. (143), e58419, doi:10.3791/58419 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter