Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine Dominant-negativen induzierbaren System zu entwickeln, in der kein Protein bedingt inaktiviert durch reversibel überexprimiert eine Dominant-negativen mutierte Version davon.
Abstract
Dominant-Negative (DN) Protein Hemmung ist eine leistungsfähige Methode, Proteinfunktion zu manipulieren und bietet mehrere Vorteile gegenüber anderen Genom-basierte Ansätze. Zum Beispiel obwohl Chimären und Cre-LoxP gezielte Strategien sind am meisten benutzt, die immanente Grenzen dieser Strategien (z. B. undichte Promotoraktivität, Mosaik Cre Ausdruck usw.) erheblich eingeschränkt haben ihre Anwendung. Darüber hinaus ist eine vollständige Löschung von vielen endogenen Genen Hochkultur tödlich, macht es unmöglich, die Genfunktion in postnatale Leben zu studieren. Um diesen Herausforderungen zu begegnen, haben wir erhebliche Änderungen an einem frühen Gentechnik-Protokoll und kombiniert eine Kurzversion (transgene) das Rb1-gen mit einer lysosomalen Protease procathepsin B (CB), einem DN-Maus-Modell von Rb1 generieren (CBRb). Aufgrund des Vorhandenseins von lysosomalen Protease werden die gesamten CB-RB1-Fusionsprotein und seinen interagierenden Komplex für Proteasom-vermittelten Abbau weitergeleitet. Darüber hinaus ermöglicht das Vorhandensein von ein Tetracyclin-Induktor (RtTA) Element in der transgenen Konstrukt eine induzierbare und reversibel Regelung des das RB1-Protein. Das Vorhandensein eines allgegenwärtigen ROSA-CAG-Promotors im Mausmodell CBRb macht es ein nützliches Werkzeug, um vorübergehende und reversible Rb1-gen-Ablation durchführen und liefern Forscher eine Ressource für das Verständnis ihrer Tätigkeit in nahezu jedem Zelltyp wo RB1 zum Ausdruck.
Introduction
Die meisten Ansätze mit dem Ziel der Gene und Proteine Ablationen setzen auf permanente Prozesse, die in der Regel zur vollständigen Beseitigung oder Kürzung des Gens, RNA-Sequenzen oder Protein von Interesse (POI) führen. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist ein rekombinantes Protein zur Abschaffung der endogenen, Wildtyp Protein-Funktion zu konstruieren. Wir haben neu aufgelegt und überarbeitet eine alternative Strategie1,2, die für die temporäre Ablation eines POI durch DN Hemmung ermöglicht. Diese Methode funktioniert für Multimeric und Monomeren Peptide aber eignet sich am besten für Proteine, die in einer Assembly Multimeric funktionieren.
Die Methode besteht darin, der Verschmelzung der lysosomalen Protease CB an eine Untereinheit von einem Multimeric POI (CB Fusion Komplex). Die resultierende komplexe CB-Fusion kann interagieren mit und proteolytisch das körpereigene Protein zu verdauen oder umleiten den Gesamtkomplex der CB-POI zu den Lysosomen abgebaut3sein. Darüber hinaus ermöglicht eine Kombination aus der komplexen CB-Fusion mit der induzierbaren Natur des Systems der Tetracyclin-gesteuerte transkriptionelle Aktivierung (TetO) einen induzierbaren und kontrollierte Expression des Transgens in einem reversiblen Mode2. Obwohl in vielen Fällen nützlich, führt die vollständige Löschung von Genen oder Proteinen in-vivo Letalität4,5,6. Ebenso gewebespezifischen, bedingte Löschung einiger Gene oder Proteine mit dem Cre/Lox-System einfach, möglicherweise nicht da es letztlich zu den dauerhaften Verlust von kritischen genomische Elemente7führt. Daher, je nach gen oder POI, keiner dieser Ansätze werden wirksam bei der Bereitstellung eines nützlichen Modells für nachfolgende Studien, besonders Gene oder Proteine funktionellen Studien in den späten postnatale und Erwachsenen Mäusen.
Zur Umgehung der Probleme im Zusammenhang mit solchen Ansätzen und Proof of Principle über die Wirksamkeit des vorgeschlagenen Verfahrens, möchten wir hier durch die Erzeugung einer bedingten DN-Version des Proteins Retinoblastom 1 (RB1) vorgestellte Methode zu testen. Mehrere Möglichkeiten wurden vorgeschlagenen8,9,10 , die Funktion des endogenen RB1 abzuschaffen; jedoch alle den gleichen Einschränkungen oben diskutierten konfrontiert: permanente Keimbahn Löschung von RB1 ist Hochkultur tödlich, und mit seinen Tumorsuppressor Rolle, permanente RB1 bedingte Löschung führt zu einer Vielzahl von Tumoren11. Obwohl eine DN-Version von RB1 nicht natürlich vorkommen scheint, sollte eine bessere Alternative zu den derzeit verfügbaren Strategien erlauben eine zeitlich gesteuerte Inaktivierung von endogenen RB1 und bieten einen alternativen Mechanismus schließlich wiederherstellen ihrer Funktion. Die Grundlage für ein solches Konstrukt wurde vor über zwei Jahrzehnten beschrieben1. Allerdings fehlte es aufgrund von technischen Einschränkungen, einen Mechanismus zur Kontrolle Transgen Aktivierung, Reaktion und Gewebespezifität. Diese Studie ist die erste verbinden die Eleganz der Doxycyclin (Dox)-abhängige transkriptionelle System mit ein veränderter transgenen Konstrukt der lysosomalen Protease CB und Rb1 Proteine. Die daraus resultierende CBRb-Maus-Modell ermöglicht eine vorübergehend geregelten Dox-vermittelten RB1 Verordnung2. Der Vorteil der Verwendung eines Proteom-basierten Ansatzes Genfunktion zu studieren ist, dass es für jedes Gen von Interesse, mit minimalen Informationen über seine Tätigkeit angenommen werden kann.
Die vorgeschlagene DN-Transgen-Strategie bietet viele Vorteile gegenüber herkömmlichen Ansätzen. Erstens führt DN Protein Hemmung zu nur ein teilweiser Ablation Proteinaktivität, um ein passives endogenen Ausdruck. Ein solches Ergebnis ist höchst wünschenswert, in Situationen, wo eine vollständige Beseitigung der Proteinaktivität zu embryonalen Tödlichkeit führt, stark begrenzen jeder Untersuchung um Genfunktion in einer live Maus zu untersuchen. Zweitens ermöglicht die Präsenz des Systems der TetO Transgen Aktivierung nur in Anwesenheit eines Antibiotikums, die für eine effiziente und reversible Kontrolle der Transgen-Aktivität ermöglicht. So durch Beendigung der Antibiotika-Administration, die transgenen System kann deaktiviert werden, und ein normaler RB1 Ausdruck ist wieder an Ihrem Platz. Drittens kann der Veranstalter der Wahl die Spezifität des Transgens Ausdrucks abhängig. Während wir die allgegenwärtigen ROSA-CAG-Promoter für Proof of Principle gewählt haben, dürfte Platzierung des Transgens unter gewebespezifischen Promoter, Studien über die therapeutische Anwendung von diesem Transgen zu unerwünschten Transgene Ausdruck zu beschränken Methodik.
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Protocol
Generation der transgenen CBRb Maus und alle Tierpflege Experimente im Zusammenhang mit der Studie wurden genehmigt von der Creighton Universität institutionelle Tier Pflege und Nutzung Committee (IACUC) und durch ihre Richtlinien durchgeführt.
(1) transgenen CB-Myc6-Rb1 Konstrukt
Hinweis: Das Klonen von CBRb in einen Vektor pTet_Splice erfolgte in mehreren Schritten (Abb. 1A und 1 b).
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Führen Sie die erste Stufe Klonen in der pCS2 + CB-Myc6 Vektor.
- CBRb Transgen Konstrukt zu schaffen, zu verstärken 1583-bp lange Rb1 cDNA Fragment (528 Aminosäuren entsprechend der Aminosäure Region 369 – 896) des RB1 Proteins mit Hilfe des folgenden Primers festgelegt: für EcoRI +RB 1243F, verwenden GGGGAATTCA TTAAATTCAGCAAGTGATCAACCTTC, und verwenden Sie für XbaI + EcoRV +RB 2826R, CCCTCTAGATATCTATTTGGACTCTCCTGGGAGATGTTTACTTCC.
- Klon des Fragments (1546-bp) zwischen EcoR1 und XbaI Restriktionsschnittstellen des pCS2 + CB-Myc6 Vektor als zuvor beschriebenen1,12erzeugt.
Hinweis: 1012-bp-langen CB-Myc6 Konstrukt (337 Aminosäuren) auf das Rb1 -Fragment fusioniert resultierte in einem Protein ca. 865 Aminosäuren (etwa 108 kDa), die etwas kleiner als die endogene RB1-Protein (~ 110 kDa) ist (Abbildung 1 Ein), mit einem CB-Myc6 Tag am N-Terminus und Rb1 am C-Terminus.
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Führen Sie die zweite Stufe subcloning in den pTet-Spleiß-Vektor.
- Die CB-RB-Myc6-Fusion-Fragment zu verstärken und die Tet-Förderer zu gewinnen, verstärken die Kassette, bestehend aus der CB-myc6-Rb1 mit Primer, enthält die EcoRV (XbaI + EcoRV + RB 2826R) und SalI Websites: für SalI +CBF Verwenden Sie CCAGTCGACAGGATGTGGTGGTCCTTGATCCTTC.
- Subclone das Fragment erzeugt (2567 bp) in den pTet-Spleiß-Vektor zwischen SalI und EcoRV Restriktionsschnittstellen, so eine Art und Weise, die das gesamte TetO-DN-CB-myc6-Rb1 Transgen, einschließlich der SV40-Intron und der PolyA signalisieren, können durch einen einzigen Verdauung mit NotI (Abbildung 1B) isoliert werden.
Hinweis: Das NotI-Fragment wurde verwendet, um die transgenen Geldgeber zu generieren.
(2) in vitro-Tests des Transgens TetO-DN-CB-myc6-Rb1
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DOX-Verordnung: NIH3T3 Zelllinie
Hinweis: Sofern nicht anders angegeben, sind alle Volumes für eine 6-Well-Platte angepasst worden.- Wachsen Sie NIH3T3 Zellen nach Vorgaben des Herstellers, unter Verwendung der empfohlenen Zellkulturmedien, enthält 10 % fötalen Rinderserum bei 37 ° C mit 10 % CO2.
- Cotransfect die Zellen mit pTet-Spleiß und pCMV-Tet3G Vektoren (aus Schritt 1) für 24 h die Schritte unten zum Cotransfection erwähnt.
- Mischen Sie 2 – 4 µL der Lipid-basierte Transfection Reagens/Brunnen und 1 mL der unvollständig (ohne Serum) Dulbecco geändert Eagle Medium (DMEM) für 5 min bei Raumtemperatur. Für ein 12 oder 24-Well-Platte 250 oder 500 µL Kulturmedien, bzw. verwenden, und die Lautstärke Transfection Reagens entsprechend.
- Die Transfektion Reagenz-DMEM 2 – 3 µg von Plasmid DNA/Well hinzufügen und 20 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Fügen Sie die Mischung mit DNA und die Transfection Reagens in DMEM in jede Vertiefung. Fügen Sie nach 3 – 4 h Inkubation 1 mL der komplette Medien (so dass der letzte Band 2 mL/gut ist). Halten Sie Aliquote Dox Aktie (1 mg/mL) und fügen Sie 2 µL in jedem der Brunnen (+ Dox hinzu). Inkubation der Zellen bei 37 ° C mit 5 % CO2.
Hinweis: Kontrollproben sollte bestehen aus cotransfected Zellen, die nicht mit Dox behandelt (-Dox), sowie NIH3T3 Zellen nur mit der Transaktivator pCMV-Tet3G Vektor transfiziert und 24 h lang mit Dox behandelt. Für pCMV-Tet3G, Konzentrationen von 0,1 – 1 µg/mL Dox sollte ausreichen, um die Expression des Transgens zu induzieren.
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Testen Sie die Reversibilität des Konstrukts mit HEK293-Zelllinie.
- Test der Reversibilität des Transgens TetO-DN-CB-myc6-Rb1 Kultur HEK293 Zellen in Adlers Minimum wesentliches Medium (EMEM) nach Vorgaben des Herstellers und cotransfect mit pTet-Spleiß und pCMV-Tet3G Vektoren für 24 h, wie beschrieben oben (Schritt 2.1.2).
- Entfernen Sie für die Transgen-Inaktivierung das Dox-haltigen Medium nach 24 h, waschen Sie die Zellen 2 x-3 x mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und inkubieren sie im Dox-freie Medien für weitere 24 h.
Hinweis: Bei Dox-entfernen sollte das Transgen Inaktivierung und regelmäßige Proteinexpression innerhalb dieser 24-Stunden-Frist wieder aufgenommen werden.
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Um die Funktionalität des Konstrukts TetO-DN-CB-myc6-Rb1 in Förderung der ungeplante Zellproliferation zu beurteilen, führt die funktionelle Untersuchungen mit einer HEI-OC1 Zelllinie wie unten beschrieben.
- HEI-OC1 Zellkulturen in 10 % DMEM unter freizügigen Bedingungen (33 ° C mit 10 % CO2). Zählen Sie für Zell-Proliferation Studien die Zellen mit einer Zelle-Theke und Platte 10.000 HEI-OC1 Zellen auf einer 96-Well-Platte in einem Volumen von 200 µL. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht.
- Am folgenden Tag, führen Sie eine transiente Cotransfection pTet-Spleiß und pCMV-Tet3G Vektoren mit einem Lipid-basierte Transfection Reagens (siehe Schritte 2.1.2). Führen Sie in einem separaten gut PmR-ZsGreen1 Transfektion at2-µg mit Lipid-basierte Transfection Reagens (Schritte 2.1.2) zum Berechnen der Transfektion Rate. Verwenden Sie nicht transfizierten Zellen als Steuerelemente.
- Das Vorhandensein von grün fluoreszieren unter dem Fluoreszenzmikroskop (Erregung = 485 nm, Emission = 530 nm) für den transfizierten Zellen 24 h nach Transfektion. Zeichnen Sie das Vorhandensein oder Fehlen der grüne Fluoreszenz und berechnen Sie die Rate der Transfektion als die Gesamtzahl der GFP-positiven Zellen (transfizierten Zellen) über die Zellen mit DAPI (total Zellen) gekennzeichnet.
Hinweis: Eine Transfektion Rate von ~ 70 % geschätzt. - Um Transgene Ausdruck zu induzieren, hinzufügen 1 µg/mL Dox auf eine Teilmenge von transfizierten Zellen während der Verwendung der anderen Teilmenge als Kontrolle (-Dox). Verwenden Sie unbehandelte HEI-OC1 Zellen als zusätzliche Steuerelemente.
- Zur Beurteilung der Zellproliferation verwenden Sie eine Zelle Verbreitung Kit laut Protokoll des Herstellers.
- Kurz gesagt, 48 h nach Transfektion, entfernen das Zellkulturmedium und 100 µL 1 x Farbstoff-verbindliche Lösung in jede Vertiefung der Mikrotestplatte. 1 h bei 37 ° c inkubieren
- Danach messen der Fluoreszenzintensität jeder Probe mit einem Fluoreszenz Mikrotestplatte Reader (Erregung = 485 nm, Emission = 530 nm).
- Um Zellproliferation mit Immunocytochemistry weiter zu bewerten, die HEI-OC1 Zellen auf einem Deckglas in einem 12-Well-Platte-Platte und über Nacht bei 37 ° c inkubieren
- Am nächsten Tag mit dem pTet-Spleiß und pCMV-Tet3G cotransfect und führen Sie die Dox Behandlung (+ Dox). Verwenden Sie untransfected Zellen als Steuerelemente. Am Prozess HEI-OC1 Zellen für die Kennzeichnung von Ki-67.
- Befestigen Sie die Zellen mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) mit PBS-Puffer, pH 7,4, für 10 min bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Zellen 3 X mit eiskaltem PBS und die Zellen in 0,25 % nicht-ionische Reinigungsmittel mit PBS-Puffer für 10 min inkubieren.
- Waschen Sie die Zellen wieder, 3 X mit PBS-Puffer für 5 min und Block mit 10 % Serum in eine feuchte Kammer für 1 h bei Raumtemperatur.
- Die Zellen in 500 µL der Ki-67 Primärantikörper (Verdünnung 1: 200) für 3 h bei Raumtemperatur inkubieren oder über Nacht bei 4 ° C.
- Waschen Sie die Zellen 3 X 5 min. mit PBS. Danach Inkubation der Zellen mit dem sekundären Antikörper für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln.
- Die sekundäre Antikörper-Lösung entfernen und Waschen der Zellen 3 X mit PBS für 5 min in der Dunkelheit.
- Brüten Sie für Phalloidin etikettieren die HEI-OC1 Zellen in 1: 200 Phalloidin für 30 min. Um den Kernen der Zellen zu beschriften, inkubieren Sie die Zellen mit 5 µg/mL DAPI für 10 min bei Raumtemperatur.
Hinweis: Sicherstellen Sie, dass Phalloidin Farbstoff Konjugat Sekundärantikörpers konjugiert unterscheidet.
3. Generation der CBRb+/ROSA-CAG-rtTA+ (CBRb) transgenen Mäusen und In Vivo Tests des DN-CBRb Ansatzes
- Nach Bestätigung der wirksamen Dox-Regulierung des Transgens TetO-DN-CB-myc6-Rb1 reinigen das NotI-Fragment und microinject sie in Maus Zygoten, die später in Pseudo-trächtige Weibchen übertragen werden.
Hinweis: Diese Verfahren wurden an der University of Nebraska Medical Center (UNMC) Maus Genom Engineering Core Facility durchgeführt. - Nach der Geburt die Welpen mit einer Grundierung der CB-Rb1 Fusion Region bestimmten soll Genotyp: für CBRb F, verwenden Sie 3 von 5' CTGTGGCATTGAATCAGAAATTGTGGCTGG ' und für CBRB R, 3 ' 5 ' GTACTTCTGCTATATGTGGCCATTACAACC.
Hinweis: Die PCR-Produkt-Größe auf Agarosegel beobachtet ist 401 bp (60-bp CB Region + 341-bp Rb1 Region (Tabelle 1). Zehn unabhängige Gründer Linien wurden identifiziert, abhängig vom Vorhandensein des Transgens TetO-DN-CB-myc6-Rb1 . In fünf dieser Linien vererbt Nachkommen das Transgen, das die Keimbahn-Übertragung des Transgens bestätigt. Letztlich diente eines transgenen Linien schaffen und pflegen die Linie und Versuchstieren TetO-DN-CB-myc6-Rb1 für weitere Studien zu generieren. - Züchten Sie Erwachsener TetO-DN-CB-myc6-Rb1 Mäuse auf die ROSA-CAG-RtTA Tetracyclin-Induktor Linie (Lager #006965) (Alternativ Zucht zu einer tTA Induktor Linie) um experimentelle DN-CBRb Mäuse zu erzeugen. Genotyp Nachkommen dieses Kreuz mit der folgenden Grundierung: verwenden Sie für RtTA-WT R, GGAGCGGGAGAAATGGATATG; Verwenden Sie für RtTA Mutant R GCGAGGAGTTTGTCCTCAACC; und für gemeinsame RtTA, AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT. Die PCR-Produkt-Größen sind 340 bp (Mutanten), 340 bp und 650 bp (heterozygot) und 650 bp (Wildtyp).
- Erstellen einer Dosis-Wirkungs-Kurve des RB1 Proteins nach der Dox Behandlung zu bestimmen, die Zeit und Dauer der Dox Behandlung notwendig, einen Transgene Ausdruck zu entlocken.
Hinweis: In diesem Experiment wurden western-Blot und qRT-PCR zur gewebespezifischen Transgene Aktivierung und RB1 Ausdruck zu bewerten. - Führen Sie durch Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (FISH), die genomische Einfügung des Transgens zu bestätigen.
Hinweis: Dies wurde im Zentrum für angewandte Genomik des Spitals für kranke Kinder (Toronto, Kanada) durchgeführt. ELISA oder western Blot (mit Protein-spezifischen Antikörper) lässt sich die Transgen-Aktivierung, Gewebespezifität und Änderungen in den Ebenen des endogenen POI zu beurteilen. Für das DN-CB-myc6-Rb1 -Konstrukt haben wir einen Anti-RB1-Antikörper verwendet.
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Representative Results
Entwerfen einer DN Mutation erfordert in der Regel, eine beträchtliche Menge von Informationen über die Struktur und Funktion des POI. Im Gegensatz dazu ist die DN-Strategie hier vorgestellten besonders nützlich, wenn die strukturelle und funktionelle Informationen für die POI begrenzt ist. Wenn der POI ein Multimeric Protein ist, eine Verschmelzung von einer Untereinheit zu einer lysosomalen Protease kann dominant hemmen die montierten Multimer und unter Umständen andere Liganden durch eine Kombination der Proteolyse der endogenen Untereinheiten und subzelluläre Abzweigung von der Multimer zu den Lysosomen. Um zu bestätigen, erfolgreiche Klonen und testen Sie die Effektivität der Dox-regulierten Transgen Aktivierung, gereinigten pTet-Spleiß-Plasmid enthält TetO-DN-CB-myc6-Rb1 war in Mauszellen NIH3T3 Konstrukt transfiziert, die stabil die RtTA ausgedrückt Protein, aber nicht Rb113. Bei fehlender Dox angezeigt Zellen mit dem Ausdruck RtTA kein RB1 Ausdruck, während ein robuste RB1 Ausdruck im Beisein von Dox (Abb. 2A) beobachtet wurde. Weiter, um die Reversibilität des Systems zu testen, cotransfected wir HEK293 Zellen (die endogen Rb114express) mit gereinigtem pTet-Spleiß /TetO-DN-CB-myc6-Rb1 und den pCMV-Tet3G Vektoren. Wie erwartet, war der Ausdruck des endogenen RB1 Proteins deutlich auf Transgen-Aktivierung durch die Zugabe von Dox in Zellkulturmedien (Abbildung 2B) gehemmt. Um die Reversibilität des Systems zu testen, nach 24 h lang in eine Teilmenge der HEK293 Zellen, wir Dox-haltigen Zellkulturmedien mit frischen Dox-freie Medien ersetzt und die Zellen für weitere 24 h unterstützt die Dox-regulierten Reversibilität, RB1 inkubiert Ausdruck wurde nach dem Dox entfernen von Nährmedien (Abbildung 2B) restauriert. Transfizierten HEK293 Zellen, die nicht mit Dox behandelt wurden oder Dox behandelt HEK293 Zellen mit der pCMV-Tet3G Vektor nur (Abbildung 2B) zeigte basalen Ebenen des endogenen RB1 Ausdrucks transfiziert. Da Zellen NIH3T3 RB1 Protein nicht natürlich ausdrücken, ist die positive RB1 Reaktivität aufgrund der Ansammlung von transgenen RB1-Protein. Da unser Interesse an die potenziellen proliferative Wirkung des Konstrukts TetO-DN-CB-myc6-Rb1 im auditorischen System, wir der gesamten DNA-Gehalt in pTet-Spleiß gemessen /TetO-DN-CB-myc6-Rb1- und HEI-OC1 pCMV-Tet3G-transfizierten Zellen () Innenohr Organ von Corti abgeleitet Zelllinie) in an- und Abwesenheit von Dox. In Übereinstimmung mit der hier vorgestellten Arbeitshypothese, ein deutlichen Anstieg der DNA-Gehalt (entsprechend zu einer Zunahme der Zellzahl) verzeichneten Dox behandelt aber nicht unbehandelt (Kontrolle) transfizierten Zellen HEI-OC1 (Abb. 3A - 3 C ).
Nach der in-vitro-Bestätigung des Transgens Aktivität und Funktion wurde einem transgenen Mausmodell generiert. Fisch, mit einer TetO-DN-CB-myc6-Rb1 Digoxigenin (DIG)-Pferd Rettich Peroxidase (HRP) / Tyramin-Biotin/Avidin-Cy5-markierten Sonde und G-banding der männlichen Mäuse Splenocyten und Ohr Fibroblasten wurden durchgeführt, um die Transgen-Einfügung in bestätigen die transgene Mäuse Genom. Unter den fünf Germline Übertragung Gründern, Zeile 14 zeigte eine konsequente Transgen Eingliederung in segment 10C 3 ~ D2 (Abbildung 4A - 4 C). Mäuse aus dieser Linie wurden verwendet, um die Brutkolonien zu etablieren und Versuchstiere für weitere Studien zu generieren. Um den optimalen Zeitpunkt für die Dox Induktion und TetO-DN-CB-myc6-Rb1 Transgen Aktivierung zu bestimmen, wir die transgenen Mäusen in drei verschiedene Gruppen, wobei Dox im Trinkwasser für Variable Zeiträume verabreicht wurde aufgeteilt: Gruppe 1 (3 Tage der Therapie), Gruppe 2 (7 Tage der Behandlung) und Gruppe 3 (10 Tage Behandlung). Nach Abschluss der Behandlung wurden Veränderungen in der RB1-Protein-Expression durch western Blot (Abbildung 5A - 5D) bewertet. Weil die DN und native RB1 Proteine ähnliche Molekulargewichte haben, können nicht sie auf ein western-Blot voneinander gelöst werden. Jedoch mit einem anfänglichen Anstieg in RB1 Protein (aufgrund der Ansammlung von DN-RB1 und endogenen Proteinen), gab es ein anfänglichen Anstieg Gesamt RB1-Protein-Expression in den transgenen Maus Cochleae im Vergleich zu der Kontrollgruppe (Abbildung 5 ( A). Darüber hinaus im Einklang mit der hemmenden und proteolytische Aktivität des Messguts TetO-DN-CB-myc6-Rb1 Transgen, eine messbare Reduzierung RB1 Ausdruck wurde beobachtet in den Gruppen 2 und 3 im Vergleich zu Gruppe 1 und Kontrollgruppen ( Abbildung 5A - 5D). Der Hinweis ergaben Behandlung länger als 10 Tage keine weitere Änderung RB1-Protein-Expression. So, 10 Tage der Dox Behandlung galt als optimale und für weitere Studien.
Weil die RtTA und infolgedessen TetO-DN-CB-myc6-Rb1 Transgen Aktivierung unter der allgegenwärtigen ROSA-CAG -Veranstalter stehen, könnte RB1 möglicherweise gehemmt werden, in jedem Gewebe oder Zellen in der RB1is endogen ausgedrückt (z. B. Lunge, Herz, Netzhaut). Um dieser Prämisse zu testen und bewerten das Transgen Gewebespezifität, Cochleae, Lunge, Herz und Auge Biopsien wurden aus TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTAseziert und Kontroll-Mäusen (nicht tragend das ROSA-CAG-RtTA Transgen) wurden für RB1 Ausdruck (Abbildung 6A - 6 C) bewertet. Unabhängig davon das Gewebe analysiert wurde eine signifikante Reduktion RB1 Protein in TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA aber nicht in der Kontrollgruppe(Abbildung 6)beobachtet. In scharfem Kontrast, qRT-PCR analysiert im Auge, Herz und Cochleae Dox behandelt TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA und Alter abgestimmt Kontroll-Mäusen zeigten eine signifikante Hochregulierung der DN-CBRb Abschrift in den Geweben des ehemaligen aber nicht die Diese Mäuse (Abbildung 6C). Insgesamt bestätigen diese Ergebnisse die Effizienz des Konstrukts. Eine Zunahme der Niederschrift Ausdruck spiegelt die effektive Dox-regulierten Transgen-Induktion. Ebenso ist ein Rückgang der Proteinexpression konsistent mit dem routing und proteolytischen Abbau der endogenen RB1.
Abbildung 1: Multi-Step Klonen von CBRb und Generierung von der induzierbaren TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA. (A) dieses Panel zeigt das Klonen von Rb1 -Fragment in den pCS2-CB-Myc6 -Vektor. Ein Genprodukt 1583-bp Rb1 war PCR verstärkt mit EcoRI + RB1243 nach vorn und reverse Primer Xba + EcoRV + RB2826 . Das daraus resultierende Rb1 -Fragment wurde zwischen EcoRI und Xbal Restriktionsschnittstellen des pCS2 Vektors mit der CB-Myc6 Konstrukt zum Generieren des pCS2 + CB-myc6 + Rb1 Vektors geklont. (B) der CB-myc6 + Rb1 Fragment wurde in den pTetSplice -Vektor zwischen SalI und EcoRV Restriktionsschnittstellen geklont. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Wirksamkeit der Dox-regulierten Transgen Aktivierung. (A) NIH3T3 Zellen in der Regel nicht ausdrücklich RB113. Bestätigen die effiziente Aktivierung des Konstrukts TetO-DN-CB-myc6-Rb1 , offenbart eine western-Blot-Analyse mit dem Anti-RB1-Antikörper einen robuste RB1 Ausdruck im Beisein von Dox (Bahnen 1 und 3), aber nicht in seiner Abwesenheit (Bahnen 2 und 4). (B) HEK293 Zellen, die endogen Rb114ausdrücken, wurden mit TetO-DN-CB-myc6-Rb1 und pCMV-Tet3G Transaktivator Vektor cotransfected. In Ermangelung von Dox (Spur 1) wurde ein positive RB1 Ausdruck beobachtet. Die Zugabe von Dox zum System verursacht die TetO-DN-CB-myc6-Rb1 Aktivierung und RB1 Downregulation (Spur 2). RB1-Ausdruck war 24 h fortgesetzt, nachdem Dox aus den Medien (Bahn 3) entfernt wurde. C = Control, untransfected HEK293 Zellen nicht mit Dox behandelt. Dies ist eine Adaption von einer Figur ursprünglich veröffentlicht in der Zeitschrift Frontiers in Cellular Neuroscience2. Seine Reproduktion stimmt mit Grenzen"Politik auf Autoren" copyright Retention. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Dox-vermittelten DN-CBRb Transgen Aktivierung erhöht die Zellproliferation. (A) HEI-OC1 Zellen cotransfected mit gereinigtem TetO-DN-CB-myc6-Rb1und pCMV-Tet3G-Vektoren in der (−) oder Abwesenheit (+) der Dox kultiviert wurden. Zellproliferation wurde 48 h nach der Transfektion mit einer Verbreitung-Assay bestimmt. Die prozentuale Veränderung Verbreitung wurde mit eine Änderung im Fluoreszenz-Werte mit untransfected Zellen als Steuerelement berechnet. Ein bescheidene aber signifikanten Anstieg der Anzahl von Zellen wurde in den transfizierten Zellen nach Dox Behandlung beobachtet. Im Gegensatz dazu wurden keine wesentlichen Änderungen zwischen transfizierten Zellen HEI-OC1 beobachtet nicht behandelten mit (−) Dox und die untransfected Kontrolle. (B) HEI-OC1 Zellen untransfected oder (C) cotransfected mit gereinigtem TetO-DN-CB-myc6-Rb1 und kultiviert in der Gegenwart (+) von Dox pCMV-Tet3G Vektoren wurden mit Ki-67 (rot), Phalloidin (grün) und DAPI (blau) gekennzeichnet. P < 0,05. Maßstabsleiste = 10 µm. Dies ist eine Adaption von einer Figur ursprünglich veröffentlicht in der Zeitschrift Frontiers in Cellular Neuroscience2. Seine Reproduktion stimmt mit Grenzen"Politik auf Autoren" copyright Retention. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (FISH) Bestätigung der genomischen Einfügung des Transgens TetO-DN-CB-myc6-Rb1 . Ein pCS2-CBRb (Digoxigenin Sonde/anti-DIG-HRP/Tyramide-Biotin/Avidin-Cy5, in rot) Prüfspitze wurde Splenocyten und Ohr Fibroblasten Zelle Metaphase zu sehen, ob das Signal Sonde nachgewiesen werden konnte oder nicht mit einer eins-Kopie einfügen Zielgröße von 2,5 kb hybridisiert. Die pCS2-CBRb testen Sonde hybridisiert mit einem Chromosom 10 mit hellen, Wams Sonde Signale, die die Einfügung des Transgens im Segment 10 C 3-D2 TetO-DN-CB-myc6-Rb1 zeigte. Die RP23 - 267 24 (Spektrum grün) Kontrolle Sonde hybridisiert, Chromosom 10 am Band 10A1 wie erwartet und bestätigte, dass die CBRb DNA des Interesses in Chromosom 10 eingefügt. (A) dieses Panel zeigt die G-Band Metaphase. (B) dieses Panel zeigt das Tyramide Signal Verstärkung (TSA) Fisch-Bild aus der gleichen Metaphase wie in zentrale Agezeigt. (C) dieses Panel zeigt zusammengesetzte Bilder von Chromosom 10 zeigen (1) G-banding, TSA (2) Fische, und (3) TSA Fisch mit invertierten DAPI Streifenbildung. Rot = pCS2 CBRb Sonde; Blau = DAPI Streifenbildung; Grün = RP23 - 267 24 Kontrolle Sonde. Maßstabsleiste = 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 : DN-CBRb Transgen Aktivierung im Innenohr postnatale (P) 36 TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA+ (CBRb+) und ROSA-CAG-RtTA+ (CBRb−) Mäuse nach 3 (Gruppe 1), 7 (Gruppe 2) und 10 (Gruppe 3) Tage von Dox Behandlung. (A-C) Anti-RB1, das mit hyperphosphoryliertem und Hypophosphorylated Formen von RB1, reagiert, wie auch als Anti-c-Myc Antikörper für die Erkennung verwendet wurden. Densitometrische Analyse erfolgte mit ImageJ-Software. Die entsprechenden Werte wurden auf die Negativkontrolle CBRb normalisiert− (-) und dann nach β-Aktin. Die relative RB1 Ausdruck Niveaus sind unter jeder Fleck dargestellt. (D) Die grafische Darstellung der normalisierten RB1 Ausdruck Ebenen aufgetragen gegen die verschiedenen Behandlungen Highlights ein durchweg niedriger RB1 Erkennung in CBRb+ (+) Proben. Eine andere Person entsprechen jeder Spur auf der western-Blot-Gel und jede Spalte auf die Grafik. P < 0.05.This Figur erschien in der Zeitschrift Frontiers in Cellular Neuroscience2. Seine Reproduktion stimmt mit Grenzen"Politik auf Autoren" copyright Retention. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6 : Räumliche Analysen der TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA Transgen Aktivierung in P18 TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA+ (+) und DN-CBRb+/ROSA-CAG-RtTA− negativ Kontrollmäusen (-) Herz, Augen, Lungen und Cochlea. (A) die Effizienz des Transgens Dox-vermittelte Aktivierung bestätigt, die Expression des endogenen RB1 war herunterreguliert in CBRb+/ROSA-CAG-RtTA+ Gewebe, aber nicht in die negative Kontrolle Mäuse Gewebe. Densitometrische Analyse wurde durchgeführt, wie in Abbildung 5beschrieben. Die relative RB1 Ausdruck Niveaus sind unter jeder Fleck dargestellt. (B) dieses Panel zeigt eine grafische Darstellung der normalisierten RB1 Ausdruck Ebenen aufgetragen gegen die verschiedenen Geweben. Eine interindividuelle Variation auf endogene RB1 Ebenen kann Unterschiede in den einzelnen Antworten auf Transgen Aktivierung und RB1 Herabregulation erklären. (C) RT-PCR analysiert im Auge, Herz, und Cochleae ergab eine signifikante Hochregulierung der TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA Abschrift im Dox behandelt TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA+ Gewebe, aber nicht in der DN-CBRb+/ROSA-CAG-RtTA− negative Kontrollgruppe. CBRb+/rtTA+ = TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA+; CBRb−/rtTA+ = ROSA-CAG-RtTA+; P < 0,05. Diese Zahl wurde in der Zeitschrift Frontiers in Cellular Neuroscience2veröffentlicht. Seine Reproduktion stimmt mit Grenzen"Politik auf Autoren" copyright Retention. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Tabelle 1: PCR-Bedingung verwendet für die Prüfung der CB-Rb1 Fusion Region.
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Discussion
Um die Grenzen verbunden mit traditionellen transgene Strategien zu umgehen, haben wir versucht, ein Mausmodell zu generieren, in denen eine endogene POI bedingt inaktiviert durch ein DN mutierte Form des es in gewissem Sinne raumzeitlichen überexprimiert. Um die Funktion des endogenen POIs abschaffen zu können, wurden mehrere Optionen vorgeschlagenen15,16,17. Durch die Kombination der Dox-abhängige transkriptionellen Systems, eine einfache Strategie beschäftigt eine Fusion des lysosomalen Protease CB um ein mutiertes Peptid zu erzeugen, deren Ausdruck den Ausdruck betrifft, haben wir einen früheren genetischen Strategie1 modifiziert die endogenen POI-2. Am wichtigsten ist, erfordert diese Technik keine Vorkenntnisse des Weges zur Integration der POI zugeordnet. Die aktuelle Strategie DN Protein Hemmung zeigt, dass das lysosomale Lokalisierung-Signal auf die CBRb Fusionsgen RB-Interaktion Gesamtkomplex in Richtung Lysosomen2,3lenkt. Einmal wird in Lysosomen, proteolytische Verarbeitung dieser Proteine eingeleitet, was zu deren Abbau3. Die intrinsische Eigenschaft des Proteins CB verschmolzen, verbunden mit der reversiblen Inducibility des Systems der TetO, macht dies eine sinnvolle Alternative zu herkömmlichen transgene Strategien (z. B. komplette gen Knockout, bedingte Löschung), besonders wenn die vollständige Löschung des Gens von Interesse ist nicht wünschenswert.
Zunächst haben wir die Forschung auf das RB1-Protein gerichtet. DN-Mutationen sind am leichtesten in Proteine, die als Dimer oder Multimere Funktion beschrieben. Bisher gibt es keine Beweise für eine direkte körperliche Interaktion zwischen RB1 Moleküle. Dennoch kann die angeborene Natur ihrer Tätigkeit auf das Vorhandensein von mehreren RB1-Moleküle in der gleichen Anlage zu einem bestimmten Zeitpunkt. Zum Beispiel bietet die Bindung des Hypophosphorylated RB1 auf der E2F1-DP-Heterodimer eine zusätzliche Bindungsstelle, die normalerweise von Histon Deacetylase (HDAC)18,19,20besetzt ist. Auf der anderen Seite HDAC1 körperlich interagiert mit RB1 und dieser Komplex bindet wiederum an die E2F1-DP-RB1 Heterotrimer, wodurch zusätzliche Transkription Repression18. Gemäß diesem Ansatz wenn mindestens eines der RB1-Moleküle in der Gruppe eine Mutante DN ist wird es verhindert den Komplex Transkription, zu unterdrücken, während es das Niveau der endogenen RB1 verringert, damit ein RB1-Null-Phänotyp zu entlocken. Hier wurde endogenen RB1 Hemmung 10 Tage nach der Verabreichung von Dox im Trinkwasser festgestellt. Die optimale Dosis für Dox Induktion müssen jedoch für jedes System empirisch ermittelt werden. Darüber, da die meisten die Rb1 -gen-Sequenz wurde auf das Konstrukt Make-up verwendet, ist es möglich, dass auch in Abwesenheit des endogenen RB1 Mutant RB1 interagieren mit und die DN-Hemmung aller das RB1 Bindungspartner zu entlocken kann. Dieser Prämisse kann durch Beurteilung des bekannten RB1-Bindung Moleküle Ausdruck getestet werden.
Dringend benötigte, fein geregelte zeitliche und reversible Protein Inaktivierung liefern die Grundlage für die Entwicklung von einer Vielzahl von Studien in einer noch größeren Zahl von Forschungsgebieten suchen, um Aufschluss über die komplexen biochemischen Mechanismen die verschiedenen Aspekte der gen- und Proteinactivity. Abhängig von der POI dürfte seine molekularen Komplexität verstehen Forscher aufnahmebereiter, erfolgreiche therapeutische Strategien zu entwerfen. Erhöhte Transgen Spezifität kann erreicht werden durch die Züchtung der DN-Maus gewebespezifische Promotoren fahren entweder tTA oder RtTA Linien.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die pCS2 + CB-Myc6 Vektor war ein Geschenk von Marshall Horwitz (University of Washington, Seattle, WA, USA). Die HEI-OC1 Zellen wurden freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Fedrico Kalinec (David Geffen School of Medicine, UCLA, Los Angeles, CA, USA). Technischer Support sorgte die UNMC Maus Genom Engineering Core (c.b. Gurumurthy, Don Harms, Rolen Quadros) und der Creighton Universität integrierte Biomedical Imaging Facility (Richard Hallworth, John Billheimer). Gewähren Sie durch eine institutionelle Development Award (IDea) von der NIH/NIGMS UNMC Maus Genom Engineering unterstützt wurde, Nummer P20 GM103471. Die integrierte biomedizinische Bildgebung Anlage wurde von der Creighton University School of Medicine und Stipendien, GM103427 und GM110768 von der NIH/NIGMS unterstützt. Die Anlage wurde mit Unterstützung durch Zuschüsse aus dem National Center for Research Resources (RR016469) gebaut und die NIGMS (GM103427). Die Mauslinien erzeugt in dieser Studie wurden auf Creighton University Animal Ressource Facility, gehalten dessen Infrastruktur durch einen Zuschuss von NIH/NCRR G20RR024001 verbessert wurde. Diese Arbeit vorbei an Unterstützung durch ein NIH/NCRR 5P20RR018788-/ NIH/NIGMS 8P20GM103471 COBRE gewähren (Shelley D. Smith), NIH/ORIP R21OD019745-01A1 (S.M.R.-S.) und einer aufstrebenden Forschungsstipendium aus der Anhörung Health Foundation (zu S. Tarang) erhalten. Der Inhalt dieser Forschung ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM | GIBCO-BRL | 11965-084 | |
| Minimum Essential Medium Eagle, MEME | Sigma | M8042 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442 | |
| Lipofectamine | DharmaFECT | T-2010-03 | |
| Sal I | Roche | 11745622 | |
| EcoRV-HF | New England BioLabs | R3195S | |
| NotI | Roche | 13090730 | |
| CaspaTag | Millipore | APT523 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Staurosporine | Sigma | S4400 | |
| CyQuant NF cell proliferation kit | Invitrogen | C35007 | |
| Retinoblastoma 1 antibody | Abcam | Ab6075 | |
| c-Myc antibody | Sigma | M5546 | |
| b-actin | Sigma | A5316 | |
| Ki-67 | Thermofisher scientific | MA5-14520 | |
| Phallodin | Thermofisher scientific | A12379 | |
| Fluorescence microplate reader | FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech | ||
| Epifluorescence microscope | NikonEclipse80i | ||
| The TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) mouse line is available from the Jackson Laboratory as JAX#032011. |
References
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