Summary
Qui presentiamo un protocollo per lo sviluppo di un sistema inducibile dominante-negativo, in cui tutta la proteina può essere inattivata in modo condizionale reversibilmente overexpressing una versione mutante dominante-negativo di esso.
Abstract
Inibizione della proteina di dominante-negativo (DN) è un metodo potente per manipolare la funzione della proteina e offre parecchi vantaggi sopra altri approcci basati sul genoma. Ad esempio, sebbene chimerici e Cre-LoxP strategie di targeting sono stati ampiamente utilizzate, le limitazioni intrinseche di queste strategie (cioè, l'attività del promotore che perde, espressione di Cre mosaico, ecc.) sono significativamente limitati loro applicazione. Inoltre, un'omissione completa di molti geni endogeni è embrionalmente letale, rendendo impossibile per studiare la funzione del gene nella vita postnatale. Per affrontare queste sfide, abbiamo apportato modifiche significative a un protocollo iniziale di ingegneria genetica e combinato una versione breve (transgenica) del gene Rb1 con una proteasi lisosomica procathepsin B (CB), per generare un modello murino di DN di Rb1 (CBRb). A causa della presenza di una proteasi lisosomiale, la proteina di fusione CB-RB1 intera e il suo complesso interagente vengono instradati per degradazione proteasome-mediata. Inoltre, la presenza di un elemento di induttore (rtTA) tetraciclina nel costrutto transgenico consente una regolazione viscoelastica e reversibile della proteina RB1. La presenza di un promotore di ROSA-CAG onnipresente nel modello del topo CBRb lo rende uno strumento utile per eseguire l'ablazione gene Rb1 transitorio e reversibile e fornire ai ricercatori una risorsa per comprendere la sua attività in praticamente qualsiasi tipo di cellula dove RB1 è espresso.
Introduction
Maggior parte degli approcci puntando le ablazioni di gene e la proteina si basano su processi permanenti, che generalmente conducono alla completa eliminazione o troncamento del gene, sequenze di RNA o proteine di interesse (PDI). L'obiettivo generale di questo metodo è quello di progettare una proteina ricombinante per abolire la funzione della proteina endogena, selvaggio-tipo. Abbiamo rivisitato e rinnovato una strategia alternativa1,2, che permette per l'ablazione temporanea di un PDI tramite inibizione di DN. Questo metodo funziona per multimerici e peptidi monomerici ma è più adatto per proteine che funzionano in un assembly multimerica.
Il metodo consiste di fondere la proteasi lisosomica CB per una subunità di un multimerico PDI (fusione di CB complessi). La risultante fusione CB complessa possa interagire con e proteoliticamente digerire la proteina endogena o deviare l'intero complesso di CB-POI per i lisosomi per essere degradati3. Inoltre, una combinazione di fusione CB complessa con la natura viscoelastica del sistema controllato tetraciclina attivazione trascrizionale (TetO) permette un'espressione inducibile e controllata del transgene in un modo reversibile2. Anche se utile in molte circostanze, l'eliminazione completa dei geni o proteine in vivo può provocare mortalità4,5,6. Allo stesso modo, tessuto-specifici, condizionale cancellazione di alcuni geni o proteine utilizzando il sistema Cre/Lox potrebbe non essere semplice, come, in definitiva, porterà alla perdita permanente di elementi critici genomico7. Pertanto, a seconda del gene o POI, nessuno di questi approcci sarà efficace nel fornire un utile modello per studi successivi, particolarmente dei geni o proteine studi funzionali in topi ritardo postnatali e adulti.
Per aggirare i problemi connessi con questo tipo di approccio e di fornire prova di principio sull'efficacia del metodo proposto, abbiamo scelto di testare il metodo presentato qui generando una versione di DN condizionale della proteina 1 di Retinoblastoma (RB1). Diverse opzioni sono state proposte8,9,10 per abolire la funzione di RB1 endogeno; Tuttavia, tutti loro ha affrontato alcune delle stesse limitazioni discusse sopra: l'eliminazione permanente di germline di RB1 è embrionalmente letale, e coerente con il suo ruolo di soppressore del tumore, permanente eliminazione condizionale RB1 porta a una varietà di tumori11. Anche se una versione di DN di RB1 non sembra verificarsi naturalmente, un'alternativa migliore alle strategie attualmente disponibili dovrebbe consentire un'inattivazione temporaneamente controllata di RB1 endogeno e fornire un meccanismo alternativo per ripristinare alla fine suo funzione. La base per tale costrutto è stato descritto più di due decenni fa1. Tuttavia, a causa di limiti tecnologici, mancava un meccanismo di attivazione del controllo del transgene, risposta e specificità tissutale. Questo studio è il primo a combinare l'eleganza di doxiciclina (Dox)-sistema trascrizionale dipendente con un costrutto transgenico ingegnerizzato di proteine di proteasi lisosomica CB e Rb1 . Il modello di mouse CBRb risultante permette per un temporaneamente regolamentato RB1 Dox-mediata regola2. Il vantaggio dell'utilizzo di tali un approccio basato sul proteoma per studiare la funzione del gene è che possa essere adottata per ogni gene di interesse, con informazioni minime sulla sua attività.
La strategia proposta del transgene DN offre molti vantaggi rispetto ai metodi tradizionali. In primo luogo, l'inibizione della proteina di DN conduce a solo un'ablazione parziale attività proteica, preservando in tal modo un'espressione endogena residua. Tale risultato è altamente desiderabile in situazioni dove un'eliminazione completa dell'attività della proteina conduce alla mortalità embrionale, limitando notevolmente qualsiasi indagine per studiare la funzione del gene in un mouse dal vivo. In secondo luogo, la presenza del sistema TetO consente l'attivazione di transgene solo in presenza di un antibiotico, che consente un controllo efficace e reversibile dell'attività del transgene. Così, cessando la somministrazione di antibiotici, il sistema transgenico può essere disattivato, e una normale espressione di RB1 è tornato a posto. In terzo luogo, la specificità dell'espressione del transgene può variare secondo il promotore della scelta. Mentre abbiamo scelto il promotore di ROSA-CAG onnipresente per prova-de-principio, ponendo il transgene sotto un promotore tessuto-specifico rischia di limitare l'espressione del transgene indesiderati e facilitare gli studi sull'applicazione terapeutica di questo transgene metodologia.
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Protocol
Generazione di esperimenti associati con lo studio e cura degli animali il topo transgenico CBRb e tutti sono stati approvati dalla Creighton University istituzionale animale cura ed uso Committee (IACUC) ed eseguita dai loro orientamenti.
1. transgenici CB-Myc6-Rb1 costrutto
Nota: La clonazione del CBRb in un vettore di pTet_Splice è stato fatto in un processo a più fasi (Figura 1A e 1B).
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Eseguire la prima fase di clonazione nel pCS2 + CB-Myc6 vettoriale.
- Per creare il CBRb transgene costrutto, amplificare un frammento di cDNA di Rb1 1583-bp-lungo (528 aminoacidi corrispondente alla regione dell'amminoacido 369 – 896) della proteina RB1 utilizzando il primer seguente set: per EcoRI +RB 1243F, utilizzare GGGGAATTCA TTAAATTCAGCAAGTGATCAACCTTCe per XbaI + EcoRV +RB 2826R, utilizzare CCCTCTAGATATCTATTTGGACTCTCCTGGGAGATGTTTACTTCC.
- Clone del frammento generato (1546 bp) tra i siti di restrizione EcoR1 e XbaI del pCS2 + CB-Myc6 vettoriale come descritto in precedenza1,12.
Nota: Il costrutto di CB-Myc6 1012-bp-lungo (337 aminoacidi) fuso per il frammento di Rb1 è provocato da una proteina di circa 865 aminoacidi (circa 108 kDa), che è leggermente più piccola della proteina endogena di RB1 (~ 110 kDa) (Figura 1 Un), con un tag di6 CB-Myc all'estremità N-terminale e Rb1 al C-terminale.
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Eseguire la seconda fase subcloning nel vettore pTet-Splice.
- Per amplificare il frammento di fusione CB-RB-Myc6 e di ottenere il Tet-promotore, amplificare la cassetta, composto da CB-myc6-Rb1 utilizzando primers contenenti il EcoRV (XbaI + EcoRV + RB 2826R) e SalI siti: per SalI +CBF, utilizzare CCAGTCGACAGGATGTGGTGGTCCTTGATCCTTC.
- Subclone il frammento generato (2567 bp) nel vettore pTet-Splice, tra i siti di restrizione di SalI ed EcoRV , in tale maniera che il transgene TetO-DN-CB-myc6-Rb1 intero, compreso l'introne SV40 e il PolyA segnale, possono essere isolati tramite una singola digestione con NotI (Figura 1B).
Nota: Il frammento di NotI è stato utilizzato per generare i finanziatori transgenici.
2. in Vitro test del Transgene TetO-DN-CB-myc6-Rb1
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DOX-regolazione: Linea di cellule NIH3T3
Nota: Se non diversamente specificato, tutti i volumi sono stati regolati per una piastra a 6 pozzetti.- Crescere le cellule NIH3T3 seguendo le specifiche del fornitore, mediante il supporto di cultura cellulare consigliato contenente 10% siero bovino fetale a 37 ° C con 10% CO2.
- Cotransfect le cellule con pTet-Splice e vettori pCMV-Tet3G (dal passaggio 1) per 24 h. seguono i passaggi indicati sotto per cotransfection.
- Mescolare 2 – 4 µ l del reagente/pozzo trasfezione basata sui lipidi e 1 mL di Dulbecco incompleta (senza siero) per volta Eagle Medium (DMEM) per 5 min a temperatura ambiente. Per un piatto di 12 o 24 pozzetti, utilizzare rispettivamente 250 o 500 µ l di terreno di coltura e regolare il volume di reagente di transfezione di conseguenza.
- Aggiungere il reagente di transfezione-DMEM µ g 2 – 3 del plasmide DNA/pozzetto e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere il mix contenente DNA e il reagente di transfezione in DMEM in ciascun pozzetto. Dopo 3 – 4 h di incubazione, aggiungere 1 mL di completa per i media (in modo che il volume finale è di 2 mL/pozzetto). Mantenere le aliquote di Dox stock (1 mg/mL) e aggiungere 2 µ l in ciascuno dei pozzi (+ Dox). Incubare le cellule a 37 ° C con 5% CO2.
Nota: Campioni di controllo dovrebbero consistere di cotransfected cellule non trattate con Dox (-Dox), come pure le cellule NIH3T3 transfected solo con il vettore di transactivator pCMV-Tet3G e trattati con Dox per un periodo di 24 ore. Per pCMV-Tet3G, concentrazioni di 0,1 – 1 µ g/mL Dox dovrebbe essere sufficiente per indurre l'espressione del transgene.
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Testare la reversibilità del costrutto utilizzando la linea di cellule HEK293.
- Per testare la reversibilità del transgene TetO-DN-CB-myc6-Rb1 , cellule HEK293 dell'Aquila minimo essenziale medio (EMEM) seguendo le specifiche del fornitore e cotransfect con vettori sia pTet-Splice e pCMV-Tet3G per 24 h, come descritto sopra (punto 2.1.2).
- Per l'inattivazione del transgene, rimuovere i supporti contenenti Dox dopo 24 h, lavare le cellule 2 x-3 x con tamponato fosfato salino (PBS) ed incubare loro nei media Dox-liberi per altre 24 h.
Nota: Al Dox-rimozione, l'inattivazione del transgene e l'espressione della proteina normale deve essere ripreso entro tale periodo di 24 ore.
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Per valutare la funzionalità del costrutto TetO-DN-CB-myc6-Rb1 nel promuovere la proliferazione delle cellule non programmata, eseguire le analisi funzionali utilizzando una linea cellulare di HEI-OC1, come descritto di seguito.
- Cellule di HEI-OC1 cultura nel 10% DMEM sotto permissiva condizioni (33 ° C con 10% CO2). Per gli studi di proliferazione cellulare, contare le celle utilizzando un contatore di cellule e le cellule di HEI-OC1 piastra 10.000 su una piastra a 96 pozzetti in un volume di 200 µ l. Incubare le cellule durante la notte.
- Il giorno seguente, eseguire un cotransfection transitoria di vettori pTet-Splice e pCMV-Tet3G utilizzando un reagente di transfezione basata sui lipidi (vedere i passaggi 2.1.2). In un pozzo separato, eseguire pmR-ZsGreen1 transfezione at2-µ g utilizzando il reagente di transfezione basata sui lipidi (passaggi 2.1.2) per calcolare il tasso di transfezione. Utilizzare cellule trasfettate con non come controlli.
- Rilevare la presenza di fluorescenza verde sotto un microscopio a fluorescenza (eccitazione = 485 nm, emissione = 530 nm) per il transfettate cellule 24 h dopo la trasfezione. Registrare la presenza o l'assenza di fluorescenza verde e calcolare il tasso di transfezione come il numero totale di cellule GFP-positive (cellule trasfettate) sopra le cellule identificate con DAPI (cellule totali).
Nota: Abbiamo stimato un tasso di transfezione di ~ 70%. - Per indurre l'espressione del transgene, aggiungere 1 µ g/mL Dox a un subset di cellule trasfettate utilizzando il sottoinsieme di altri come controllo (-Dox). Utilizzare le cellule non trattate di HEI-OC1 come controlli aggiuntivi.
- Per valutare la proliferazione delle cellule, utilizzare un kit di proliferazione delle cellule secondo il protocollo del produttore.
- In breve, 48 ore dopo la trasfezione, rimuovere il terreno di coltura cellulare e aggiungere 100 µ l di soluzione colorante-associazione 1x in ciascun pozzetto della micropiastra. Incubare per 1 h a 37 ° C.
- Da allora in poi, misurare l'intensità della fluorescenza di ciascun campione utilizzando un lettore di micropiastre di fluorescenza (eccitazione = 485 nm, emissione = 530 nm).
- Per valutare ulteriormente la proliferazione delle cellule mediante immunocitochimica, piastra le cellule di HEI-OC1 un vetro di copertura in un piatto di 12-pozzetti e incubare per una notte a 37 ° C.
- Il giorno seguente, cotransfect con la pTet-Splice e pCMV-Tet3G ed eseguire il trattamento di Dox (+ Dox). Utilizzare cellule untransfected come controlli. Cellule di HEI-OC1 processo per d'etichettatura Ki-67.
- Fissare le cellule con paraformaldeide al 4% (PFA) in PBS, pH 7.4, per 10 min a temperatura ambiente. Lavare le cellule 3 x con PBS ghiacciata e incubare le cellule a 0,25% detergente non ionico in PBS per 10 min.
- Lavare le cellule ancora una volta, 3 x in PBS per 5 min e blocco utilizzando il 10% di siero in una camera umidificata per 1 h a temperatura ambiente.
- Incubare le cellule in 500 µ l di anticorpo primario Ki-67 (diluizione 1: 200) per 3 ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4 ° C.
- Lavare le cellule 3 x per 5 minuti con PBS. Dopo di che, incubare le cellule con l'anticorpo secondario per 1 h a temperatura ambiente al buio.
- Rimuovere la soluzione di anticorpo secondario e lavare le cellule 3 x con PBS per 5 minuti ciascuno, al buio.
- Per l'etichettatura falloidina, incubare le cellule HEI-OC1 falloidina 1: 200 per 30 min. Per etichettare i nuclei delle cellule, incubare le cellule con 5 µ g/mL DAPI per 10 min a temperatura ambiente.
Nota: Assicurarsi che il coniugato di tintura falloidina è diverso l'anticorpo secondario coniugato.
3. generazione del CBRb+/ROSA-CAG-rtTA+ (CBRb) topi transgenici e nei test di Vivo dell'approccio DN-CBRb
- Al momento della conferma del regolamento Dox efficace del transgene TetO-DN-CB-myc6-Rb1 , purificare il frammento di NotI e li microinject in zigoti del mouse, che sono successivamente trasferite in pseudo-gravide.
Nota: Queste procedure sono state effettuate presso l'University of Nebraska Medical Center (UNMC) Mouse Genome ingegneria Core impianto. - Dopo la consegna, genotipo i cuccioli utilizzando un primer impostare specifici per la regione di fusione CB-Rb1 : per CBRb F, 5' CTGTGGCATTGAATCAGAAATTGTGGCTGG 3 ′ e per R CBRB, uso 3 ′ 5 ′ GTACTTCTGCTATATGTGGCCATTACAACC.
Nota: Il formato del prodotto PCR osservata su gel di agarosio è 401 bp (regione CB 60-bp + 341-bp Rb1 region (tabella 1). Sono stati identificati dieci linee di fondatore indipendente, basata sulla presenza del transgene TetO-DN-CB-myc6-Rb1 . In cinque di queste linee, progenie ha ereditato il transgene, che ha confermato la trasmissione nella linea germinale del transgene. Una delle linee transgeniche è stato infine utilizzata per stabilire e mantenere la linea e generare animali da esperimento TetO-DN-CB-myc6-Rb1 per ulteriori studi. - Per generare topi DN-CBRb sperimentali della razza topi adulti TetO-DN-CB-myc6-Rb1 alla linea ROSA-CAG-rtTA tetraciclina induttore (Stock #006965) (in alternativa, razza di una linea di induttore tTA). Genotipo la prole di questa croce utilizzando il seguente set di primer: per R rtTA-WT, utilizzare GGAGCGGGAGAAATGGATATG; per rtTA mutante R, utilizzare GCGAGGAGTTTGTCCTCAACC; e per rtTA comune, utilizzare AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT. Le dimensioni del prodotto PCR sono 340 bp (mutante), 340 bp e 650 bp (eterozigoti) e 650 bp (selvaggio-tipo).
- Generare una curva dose-risposta della proteina RB1 dopo il trattamento di Dox per determinare il tempo e la lunghezza del trattamento Dox necessario per suscitare un'espressione del transgene.
Nota: In questo esperimento, western blot e qRT-PCR sono stati usati per valutare il transgene tessuto-specifica attivazione e RB1 espressione. - Eseguire ibridazione in situ di fluorescenza (pesce) per confermare l'inserimento genomica del transgene.
Nota: Questo è stato effettuato presso il centro di genomica applicata dell'ospedale for Sick Children (Toronto, Canada). ELISA o western blotting (usando anticorpo proteina-specifico) può essere utilizzato per valutare l'attivazione del transgene, tessuto-specificità e cambiamenti nei livelli del PDI endogeno. Per il costrutto di DN-CB-myc6-Rb1 , abbiamo utilizzato un anticorpo anti-RB1.
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Representative Results
In genere, una mutazione di DN la progettazione richiede una notevole quantità di informazioni sulla struttura e funzione del PDI. Al contrario, la strategia di DN presentata qui è particolarmente utile quando le informazioni strutturali e funzionali per il PDI sono limitate. Se il PDI è una proteina multimerica, una fusione di una subunità di una proteasi lisosomica dominante può inibire il multimer assemblato e, potenzialmente, altri ligandi attraverso una combinazione di proteolisi delle subunità endogeno e subcellulare diversione della multimer per il lisosoma. Per confermare la clonazione riuscita e testare l'efficacia del transgene Dox-ha regolato l'attivazione, plasmide purificato pTet-Splice contenente il TetO-DN-CB-myc6-Rb1 costrutto è stato transfected nelle cellule NIH3T3 topo che esprime stabilmente il rtTA la proteina, ma non Rb113. In assenza di Dox, le cellule che esprimono rtTA non visualizzata alcuna espressione di RB1, mentre un'espressione di RB1 robusta è stata osservata in presenza di Dox (Figura 2A). Successivamente, per verificare la reversibilità del sistema, abbiamo cotransfected cellule HEK293 (che esprimono in modo endogeno Rb114) con purificato pTet-Splice /TetO-DN-CB-myc6-Rb1 e i vettori di pCMV-Tet3G. Come previsto, l'espressione della proteina endogena RB1 è stato inibito significativamente il transgene attivazione mediante l'aggiunta di Dox in terreni di coltura delle cellule (Figura 2B). Per verificare la reversibilità del sistema, dopo un periodo di 24 ore, in un sottogruppo di cellule HEK293, abbiamo sostituito i terreni di coltura cellulare Dox-contenente con fresco privo di Dox media e incubato le cellule per un'ulteriore 24h. sostenere la reversibilità Dox-regolata, RB1 espressione è stata ristabilita dopo l'espianto di Dox dal terreno di coltura (Figura 2B). Transfected le cellule HEK293 che non sono state trattate con Dox o cellule HEK293 Dox-trattati transfected con il pCMV-Tet3G solo vettoriale (Figura 2B) ha mostrato i livelli basali di espressione endogena di RB1. Perché le cellule NIH3T3 non esprimono naturalmente proteina RB1, la reattività positiva di RB1 è dovuta all'accumulo della proteina transgenica RB1. Dato il nostro interesse per il potenziale effetto proliferativo del costrutto TetO-DN-CB-myc6-Rb1 del sistema uditivo, abbiamo misurato il contenuto di DNA totale in pTet-Splice /TetO-DN-CB-myc6-Rb1- e HEI-OC1 pCMV-Tet3G-transfettate cellule ( organo dell'orecchio interno di una linea cellulare derivata da Corti) in presenza ed assenza di Dox. Coerente con l'ipotesi di lavoro qui presentato, un significativo aumento del contenuto di DNA (corrispondente ad un aumento nel numero delle cellule) è stato osservato in Dox-trattati ma non non trattato (controllo) transfettate cellule HEI-OC1 (Figura 3A - 3 C ).
In seguito la conferma in vitro dell'attività del transgene e funzione, è stato generato un modello di topo transgenico. PESCE, utilizzando un TetO-DN-CB-myc6-Rb1 digossigenina (DIG)-perossidasi di cavallo rafano (HRP) / tiramina-biotina/avidina-Cy5-labeled sonda e G-fascia di fibroblasti di topo maschio splenocytes e orecchio sono stati effettuati per confermare l'inserimento del transgene nella genoma di topi transgenici. Tra i cinque fondatori di trasmissione germinale, inserimento di linea 14 ha mostrata un transgene coerenza all'interno del segmento 10C 3 ~ D2 (fig. 4A - 4C). Topi da questa linea sono stati usati per stabilire le colonie di nidificazione e generare animali da esperimento per ulteriori studi. Per determinare il momento ottimale per l'induzione di Dox e TetO-DN-CB-myc6-Rb1 transgene attivazione, abbiamo diviso i topi transgenici in tre gruppi differenti, in cui è stato somministrato Dox in acqua potabile per lunghezze variabili di tempo: gruppo 1 (3 giorni di trattamento), gruppo 2 (7 giorni di trattamento) e gruppo 3 (10 giorni di trattamento). Al termine del trattamento, cambiamenti nell'espressione della proteina RB1 sono stati valutati da western blotting (Figura 5A - 5D). Perché il DN e proteine native RB1 hanno pesi molecolari simili, non può essere risolto da altro su un western blot. Tuttavia, coerente con un aumento iniziale in proteina RB1 (dovuta all'accumulo di proteine endogene e DN-RB1), c'era un aumento iniziale nell'espressione della proteina totale RB1 nelle coclee di topo transgenico rispetto al gruppo di controllo (Figura 5 A). Inoltre, coerente con l'attività inibitoria e proteolitica del prodotto transgene TetO-DN-CB-myc6-Rb1 , una riduzione quantificabile RB1 espressione è stata osservata nei gruppi 2 e 3 rispetto ai gruppi di controllo e 1 del gruppo ( Figura 5A - 5D). Della nota, più di 10 giorni di trattamento non ha provocato alcun ulteriore cambiamento nell'espressione della proteina RB1. Così, 10 giorni di trattamento di Dox è stata considerata ottimale e usati per ulteriori studi.
Poiché la rtTA e, di conseguenza, l'attivazione del transgene TetO-DN-CB-myc6-Rb1 sono sotto il promotore di ROSA-CAG onnipresente, RB1 potrebbe essere potenzialmente inibita in qualsiasi tessuto o cellula dove il RB1is si è espresso in modo endogeno (ad es., polmoni, cuore, retina). Per testare questa premessa e valutare la specificità tissutale del transgene, coclee, polmoni, cuore e biopsie di occhio sono state sezionate da TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA, e i topi di controllo (non riporto il transgene ROSA-CAG-rtTA ) erano valutate per l'espressione di RB1 (Figura 6A - 6C). Indipendentemente dal fatto il tessuto analizzato, una significativa riduzione della proteina RB1 è stata osservata in TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA , ma non nel gruppo di controllo (Figura 6A). In netto contrasto, qRT-PCR analizza nell'occhio, cuore e coclee di Dox-trattati TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA e topi di controllo di pari età hanno mostrato un upregulation significativo della trascrizione DN-CBRb nei tessuti del precedente, ma non il quest'ultimi topi (Figura 6C). Complessivamente, questi risultati confermano l'efficienza del costrutto. Un aumento nell'espressione di trascrizione riflette l'induzione efficace transgene Dox-regolata. Allo stesso modo, una riduzione di espressione della proteina è coerenza con la degradazione proteolitica e routing di RB1 endogeno.
Figura 1: multi-step clonazione del CBRb e generazione del viscoelastico TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA. (A) questo pannello mostra la clonazione del frammento Rb1 nel vettore pCS2-CB-Myc6 . Un prodotto del gene Rb1 1583-bp era PCR amplificato usando il EcoRI + RB1243 in avanti ed iniettori d'inversione Xba + EcoRV + RB2826 . Il frammento di Rb1 risultante è stato clonato tra i siti di restrizione EcoRI e Xbal del vettore pCS2 contenente il costrutto di CB-Myc6 per generare il vettore pCS2 + CB-myc6 + Rb1 . (B) il CB-myc6 + Rb1 frammento è stato clonato nel vettore pTetSplice tra i siti di restrizione di SalI ed EcoRV . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Efficacia dell'attivazione del transgene Dox-regolata. (A) cellule NIH3T3 non esprimono solitamente RB113. Confermando l'attivazione efficiente del costrutto TetO-DN-CB-myc6-Rb1 , un'analisi di western blot con l'anticorpo anti-RB1 ha rivelato un'espressione RB1 robusta in presenza di Dox (corsie 1 e 3), ma non in sua assenza (corsie 2 e 4). (B) cellule HEK293, che esprimono in modo endogeno Rb114, erano cotransfected con TetO-DN-CB-myc6-Rb1 e il vettore di transactivator pCMV-Tet3G. In assenza di Dox (lane 1), è stata osservata un'espressione positiva di RB1. L'aggiunta di Dox al sistema ha causato l'attivazione di TetO-DN-CB-myc6-Rb1 e RB1 downregulation (lane 2). L'espressione di RB1 è stato ripreso 24 h dopo Dox è stato rimosso dal supporto (corsia 3). C = controllo, cellule HEK293 untransfected non trattate con Dox. Si tratta di un adattamento da una figura originariamente pubblicato sulla rivista frontiere in neuroscienza cellulare2. Sua riproduzione concorda con ritenzione di copyright 'politica sugli autori' frontiere. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : DN-CBRb Dox-mediata del transgene attivazione aumenta la proliferazione delle cellule. (A) cellule di HEI-OC1 cotransfected con purificato TetO-DN-CB-myc6-Rb1e i vettori di pCMV-Tet3G sono stati coltivati in assenza (−) o in presenza (+) di Dox. Proliferazione delle cellule è stata determinata 48 ore dopo la trasfezione usando un'analisi di proliferazione. La variazione percentuale di proliferazione è stata calcolata utilizzando un cambiamento nei valori di fluorescenza con cellule untransfected come un controllo. Un modesto ma significativo aumento nel numero delle cellule è stato osservato in cellule transfected, dopo il trattamento di Dox. Al contrario, nessun cambiamento significativo sono stato osservato tra cellule trasfettate HEI-OC1 Dox non trattati con (−) e il controllo untransfected. (B) HEI-OC1 cellule untransfected o (C) cotransfected con purificato TetO-DN-CB-myc6-Rb1 e i vettori di pCMV-Tet3G coltivati in presenza (+) di Dox sono stati etichettati con Ki-67 (rosso), falloidina (verde) e DAPI (blu). P < 0.05. Barra della scala = 10 µm. Si tratta di un adattamento da una figura originariamente pubblicato sulla rivista frontiere in neuroscienza cellulare2. Sua riproduzione concorda con ritenzione di copyright 'politica sugli autori' frontiere. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Conferma fluorescente in situ di ibridazione (pesce) dell'inserzione genomica del transgene TetO-DN-CB-myc6-Rb1 . Un pCS2-CBRb (digossigenina sonda/anti-DIG-HRP/microarray-biotina/avidina-Cy5, in rosso) sonda di prova è stato ibridato alla metafase di cellula del fibroblasto splenocytes e orecchio per vedere se il segnale della sonda potrebbe essere rilevato o non con un inserto uno-copia destinazione di 2,5 kb. Il pCS2-CBRb test sonda ibridata di un cromosoma 10 con segnali di sonda doppietto brillante, che ha mostrato l'inserimento del transgene TetO-DN-CB-myc6-Rb1 entro il segmento 10 C 3-D2. La sonda di controllo RP23 - 267 24 (spettro verde) ibridato al cromosoma 10 a banda 10A1 come previsto e confermato che il DNA del CBRb di interesse inserito nel cromosoma 10. (A), questo pannello mostra la G-band metafase. (B), questo pannello mostra l'immagine di pesce tyramide segnale amplificazione (TSA) dalla metafase stessa come mostrato nel pannello A. (C), questo pannello Mostra immagini composite del cromosoma 10 risultati (1) G-fascia, pesce (2) TSA, e pesce (3) TSA con invertito DAPI banding. Rosso = sonda pCS2-CBRb; blu = DAPI banding; verde = sonda di controllo RP23 - 267 24. Barra della scala = 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : DN-CBRb transgene attivazione nell'orecchio interno di postnatale (P) 36 TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA+ (CBRb+) e ROSA-CAG-rtTA+ (CBRb−) topi dopo 3 (gruppo 1), 7 (gruppo 2) e 10 (gruppo 3) giorni di Dox trattamento. (A-C) Anti-RB1, che reagisce con forme di RB1, hyperphosphorylated sia hypophosphorylated come bene come anti-c-myc anticorpi sono stati utilizzati per il rilevamento. L'analisi densitometrica è stato fatto utilizzando il software ImageJ. I corrispondenti valori ottenuti sono stati normalizzati al controllo negativo CBRb− (-) e poi per la β-actina. I livelli di espressione di RB1 relativi sono mostrati sotto ogni macchia. (D) La rappresentazione grafica dei livelli di espressione di RB1 normalizzati tramato contro la rilevazione evidenzia un RB1 costantemente inferiore di diversi trattamenti in CBRb+ (+) campioni. Ogni corsia sul gel macchia occidentale e ogni colonna sul grafico corrispondono a una diversa. P < 0.05.This figura è stato originariamente pubblicata sulla rivista frontiere in neuroscienza cellulare2. Sua riproduzione concorda con ritenzione di copyright 'politica sugli autori' frontiere. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 : Analisi spaziali dell'attivazione del transgene TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA P18 TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA+ (+) e DN-CBRb+/ROSA-CAG-rtTA− negativo topi di controllo (-) cuore, occhi, polmoni e coclea. (A) conferma l'efficienza del transgene Dox-ha mediato l'attivazione, l'espressione di RB1 endogeno downregulated nel CBRb+/ROSA-CAG-rtTA+ tessuti ma non in tessuti di topi di controllo negativo. L'analisi densitometrica è stato effettuato come descritto nella Figura 5. I livelli di espressione di RB1 relativi sono mostrati sotto ogni macchia. (B) questo pannello mostra una rappresentazione grafica dei livelli di espressione di RB1 normalizzati tramato contro i tessuti differenti. Una variazione interindividuale su livelli endogeni di RB1 può spiegare le differenze nelle risposte individuali per l'attivazione del transgene e RB1 downregulation. (C) RT-PCR analizza nell'occhio, cuore, e coclee ha rivelato un upregulation significativo della trascrizione TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA nei tessuti trattati con Dox TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA+ , ma non nel DN-CBRb+/ROSA-CAG-rtTA− negativo il gruppo di controllo. /RtTA CBRb++ = TetO-DN-CB-myc6-Rb1/ROSA-CAG-rtTA+; CBRb−/rtTA+ = ROSA-CAG-rtTA+; P < 0.05. Questa figura è stato originariamente pubblicata sulla rivista frontiere in neuroscienza cellulare2. Sua riproduzione concorda con ritenzione di copyright 'politica sugli autori' frontiere. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: condizione di PCR utilizzata per il controllo del CB-Rb1 regione fusione.
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Discussion
Per aggirare le limitazioni associate tradizionali strategie transgeniche, abbiamo cercato di generare un modello di topo in cui un PDI endogeno può essere inattivato in modo condizionale overexpressing una forma mutante di DN di esso in maniera spatiotemporal. Per abolire la funzione di PDI endogeni, diverse opzioni sono state proposte15,16,17. Abbiamo modificato un precedente strategia genetica1 combinando il sistema trascrizionale di Dox-dipendente ad una semplice strategia che impiegano una fusione della proteasi lisosomica CB per generare un peptide mutante cui espressione colpisce l'espressione di L'endogeno POI2. La cosa più importante, questa tecnica richiede alcuna conoscenza preliminare del pathway associati con il PDI. L'attuale strategia all'inibizione della proteina DN dimostra che il segnale di localizzazione lisosomiale sul gene di fusione del CBRb devia l'intero complesso RB-interazione verso lisosoma2,3. Una volta all'interno del lisosoma, processamento proteolitico di queste proteine viene avviata, che conduce alla loro degradazione3. La proprietà intrinseca della proteina fusi con CB, connessa con la 270ms reversibile del sistema TetO, rende questa una valida alternativa alle tradizionali strategie transgeniche (ad es., knockout del gene completo, eliminazione condizionale), specialmente quando la completa delezione del gene di interesse non è auspicabile.
Ci siamo concentrati inizialmente la ricerca sulla proteina RB1. Mutazioni di DN sono più facilmente descritte in proteine che funzionano come un dimero o multimeri. Ad oggi, non esiste alcuna evidenza di una diretta interazione fisica tra molecole di RB1. Tuttavia, la natura intrinseca della sua attività consente la presenza di molecole di RB1 multiple nello stesso complesso in un dato momento. Ad esempio, l'associazione di hypophosphorylated RB1 per l'eterodimero E2F1-DP fornisce un sito di legame supplementare, che è normalmente occupato da istone deacetilasi (HDAC)18,19,20. D'altra parte, HDAC1 interagisce fisicamente con RB1 e questo complesso, a sua volta, si lega per l'eterotrimerica E2F1-DP-RB1, fornendo così ulteriori trascrizione repressione18. Secondo questo approccio, se almeno una delle molecole RB1 nel gruppo è un mutante di DN, impedirà il complesso dal reprimere la trascrizione, mentre riduce i livelli di RB1 endogeno, suscitando così un fenotipo RB1-null. Qui, endogeno RB1 inibizione è stata osservata 10 giorni dopo la somministrazione di Dox in acqua potabile. La dose ottimale per l'induzione di Dox può, tuttavia, bisogno di essere determinata empiricamente per ogni sistema. Inoltre, poiché la maggior parte della sequenza del gene Rb1 è stato usato sul costrutto trucco, è possibile che anche in assenza di RB1 endogeno, il mutante RB1 può interagire con e suscitare l'inibizione di DN di uno qualsiasi dei partner di legame di RB1. Questa premessa può essere testata da valutare il livello di espressione di molecole conosciute RB1-associazione.
Inattivazione di proteine indispensabili, finemente regolato temporale e reversibile fornirà la base per lo sviluppo di una vasta gamma di studi in un numero ancora più ampio di campi di ricerca ricerca per far luce sui complessi meccanismi biochimici che sono alla base i vari aspetti del gene e proteinactivity. A seconda del PDI, capire la sua complessità molecolare è probabile migliorare la capacità dei ricercatori di progettare strategie di successo terapeutiche. Transgene maggiore specificità può essere ottenuta in allevamento il mouse DN per promotori tessuto-specifici o tTA o rtTA linee di guida.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Il pCS2 + CB-Myc6 vettore era un regalo da Marshall Horwitz (Università di Washington, Seattle, WA, USA). Le cellule di HEI-OC1 sono state gentilmente concesse da Fedrico Kalinec (David Geffen School of Medicine, UCLA, Los Angeles, CA, USA). Supporto tecnico è stato fornito dal genoma di Mouse UNMC Core Engineering (C.B. Gurumurthy, Don Harms, Rolen Quadros) e la Creighton University Integrated Biomedical Imaging Facility (Richard Hallworth, John Billheimer). La UNMC Mouse Genome ingegneria è stata sostenuta da un premio per lo sviluppo istituzionale (IDea) da NIH/NIGMS, concedere numero P20 GM103471. L'Integrated Facility di Imaging biomedico è stato sostenuto dalla Creighton University School di medicina e sovvenzioni, GM103427 e GM110768 da NIH/NIGMS. L'impianto è stato costruito con il sostegno di sovvenzioni dal centro nazionale per le risorse di ricerca (RR016469) e NIGMS (GM103427). Le linee del mouse generate in questo studio sono state mantenute a animale Resource Facility di Creighton University, cui infrastruttura è stata migliorata attraverso una sovvenzione di NIH/NCRR G20RR024001. Questo lavoro ha ricevuto oltre supporto attraverso un NIH/NCRR 5P20RR018788-/ NIH/NIGMS 8P20GM103471 COBRE concedere (a Shelley D. Smith), NIH/IP R21OD019745-01A1 (S.M.R.-S.) e un emergente research grant della Fondazione di salute dell'udito (a S. Marco). Il contenuto di questa ricerca è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM | GIBCO-BRL | 11965-084 | |
| Minimum Essential Medium Eagle, MEME | Sigma | M8042 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442 | |
| Lipofectamine | DharmaFECT | T-2010-03 | |
| Sal I | Roche | 11745622 | |
| EcoRV-HF | New England BioLabs | R3195S | |
| NotI | Roche | 13090730 | |
| CaspaTag | Millipore | APT523 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Staurosporine | Sigma | S4400 | |
| CyQuant NF cell proliferation kit | Invitrogen | C35007 | |
| Retinoblastoma 1 antibody | Abcam | Ab6075 | |
| c-Myc antibody | Sigma | M5546 | |
| b-actin | Sigma | A5316 | |
| Ki-67 | Thermofisher scientific | MA5-14520 | |
| Phallodin | Thermofisher scientific | A12379 | |
| Fluorescence microplate reader | FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech | ||
| Epifluorescence microscope | NikonEclipse80i | ||
| The TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) mouse line is available from the Jackson Laboratory as JAX#032011. |
References
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