Summary
이 문서는 Bemisia tabaci 루프 중재 등온 증폭 (램프) 기술 기반에 대 한 빠른 식별 분석 결과 대 한 프로토콜을 보고 합니다. 프로토콜은 최소한의 실험실 훈련이 필요 하 고 따라서, 항구, 공항 등 식물 수입에 대 한 항목의 지점에서 현장 구현 될 수 있습니다.
Abstract
Whitefly Bemisia tabaci (Gennadius)은 전 세계 많은 나라에서 야채 및 작물의 생산에 영향을 미치는 상당한 중요성의 침입 해충 이다. 심한 수율 손실 발생 먹이 의해 직접, 그리고 더 중요 한 것은, 또한 100 개 이상의 유해 식물 병원 성 바이러스의 전송에 의해 합니다. 다른 침략 적인 유해물에 관해서는 증가 국제 무역의 기본 범위를 넘어 지역 B. tabaci 의 분산을 촉진 한다. 항구 등 입국 지점에서 제품을 수입 하는 식물의 검사 그리고 공항, 따라서 중요 한 예방 수단으로 볼 수 있습니다. 그러나, 해충 침입에 대 한 방어의 마지막 줄이만 의심 스러운 곤충 표본에 대 한 신속한 신원 확인 방법을 쉽게 사용할 수 있는 경우 효과적입니다. 레 귤 레이트 된 B. tabaci 와 격리 상태 없이 가까운 친척 사이 형태학 차별화는 비-학자, 루프 중재 등온 증폭 (에 따라 빠른 분자 식별 분석 결과 대 한 어려운 있기 때문에 램프) 기술 개발 되었습니다. 이 게시는 소설 분석 결과 설명 빠른 DNA 추출, 램프 반응의 1 시간 이내 B. tabaci 표본을 식별을 허용 하는 읽기의 해석의 상세한 프로토콜을 보고 합니다. 특정 B. tabaci 의 검출을 위한 기존 프로토콜에 비해 biotypes, 개발된 방법 전체를 대상으로 한 분석 결과에 복잡 한 B. tabaci 종. 또한 분석 결과 현장 직접 항목의 지점에서 최소한의 실험실 훈련 식물 건강 사찰단에 의해 적용 될 설계 되었습니다. 실험실 및 현장 조건에서 수행 하는 철저 한 유효성 검사 함을 보여 줍니다 보고 램프 분석 결과의 관리를 개선 하는 신속 하 고 신뢰할 수 있는 식별 도구 B. tabaci.
Introduction
Whitefly Bemisia tabaci (Gennadius) 관상 식물, 야채, 곡물 콩, 면1,2등 많은 경제적으로 중요 한 작물의 수확량에 영향을 미치는 침입 곤충 해충 이다. 직접 체 관 부-수 유를 통해 피해, 옆에 homopteran 종 harms 하지 식물 직접 수많은 식물 병원 성 바이러스1 의 전송에 의해 뿐만 아니라 많은 양의 과일, 잎의 표면에 단 물 배설 , 3 , 4. 미토 콘 드리 아 유전자 시 토 크롬 c 산화 효소 1 (예쁜)의 DNA 시퀀스를 비교 하는 최근 유전 학문 밝혔다 B. tabaci 는 종 이상 34 morphocryptic 종3,4의 복잡 한. 이 복잡 한, 중동과 아시아 작은 영역에서 발생 하는 biotype B로 biotype Q 지중해 지역에서 발생에서 두 명의 매우 침략과 손상 멤버는 국제 거래를 통해 세계적으로 분산 되어 있다 공장 제품, 장식물1,,56의 수송에 의해 특히 활동. 전세계 해충 상태로 인해 자연과 자연 자원 (IUCN)의 보존을 위한 국제 연합 B. tabaci 는 "세계의 100 가장 나쁜 침략 적인 외국 종"의 한으로 나열 하 고 복잡 한 종의 구성원에 의해 조정된 유기 체는 많은 국가1,,34.
유럽 연합 (EU)에서 B. tabaci 에 나열 됩니다 공장 건강 지침 2000/29/EC 별관 1AI 비 EU 국가 및 EU 내에서 보급에서 누구의 소개는 격리 유기 체 금지4. 격리 미생물의 확산에 대 한 필수 예방 측정은 공항 및 항구7,8등 (침실) 항목의 지점에서 공장 출하 검사. 경우는 국가 식물 보호 기관 (NPPO) 담당에서 거부 또는 감염된 선적9의 (를 포함 하 여 파괴) 처리 하 여 조치를 취합니다 격리 생명체가 발견 된다. 그러나, 종종 수입 검사 임원 해충 종 글로벌 무역9와 관련 된의 광대 한 범위를 정확 하 게 식별 하는 분류학 전문 지식이 필요가 없습니다. 특히 고유 형태학 키 없이 미 숙 생활 단계 (예: 계란과 애벌레)의 식별 불가능 사실상 비 학자8,,910. 따라서, 최소한의 지연으로 격리 조치의 구현 수 있도록, 대체, 신속한 현장 식별 분석 실험9에 대 한 필요가 있다.
후보 메서드는 루프 중재 등온선 DNA 확대 (램프) 기술 최근 식물 병원 균11,,1213의 식별을 위한 적합 한 기술 될 표시 되었습니다입니다. 램프는 매우 구체적인 메서드를 사용 하 여 적어도 2 개의 뇌관 쌍 6 가지 DNA 대상 시퀀스14인식 때문입니다. Bst DNA 중 합 효소의 DNA 가닥 변위 활동으로 인해 램프 반응이 등온 조건14에서 수행 됩니다. 따라서, 기존의 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 달리-기반된 분석 거기 열 cycler13,14필요 하지 않습니다. PCR 기반 분석에 또 다른 이점은 DNA 정화 단계13에 대 한 필요성을 우회 하는 DNA 추출에서 잠재적인 억제제에 대 한 자사의 탄력성 이다. 프로토콜의 속도와 단순, 램프도 휴대용, 배터리 구동 실시간 탐지 장치8,15를 사용 하 여 현장 조건 하에서 수행할 수 있습니다.
램프 분석 결과 B. tabaci8에 대 한 신속한 현장 식별 방법에 대 한 수요에 부응하 여 설계 되었습니다. 지배적인 목표는 제한 된 실험실 훈련 식물 건강 계수 검사에 의해 수행 될 수 있는 프로토콜을 개발 했다. 중점, 속도 단순 프로토콜의 최적화에 따라서 설정 됩니다. B. tabaci의 하나 또는 여러 개의 biotypes의 식별에 대 한 기존의 진단 테스트 일반적으로 개발 되었습니다 동안 소설 램프 분석 결과 전체 커버 B. tabaci 종 복잡 한8,16,17 ,18. 복잡 한의 발음된 유전 내-taxon 다양성의 문제는 다른 뇌관 세트와 타락 한 프라이 머8의 응용 프로그램의 조합을 사용 하 여 해결 되었다. B. tabaci 램프 분석 결과 소설 뇌관 미토 콘 드리 아 예쁜 유전자8의 3' 끝에 조각 대상 같은 방식으로 설계 되었습니다. 이 유전자는 적합 한 대상 선물 동물 진단 분석 실험 지역 항구 때문에 대 한 차별 하는 동안 특정 종에 대 한 진단 감도 보장 하기 위해 충분히 보존 사이 충분히 밀접 한 관계가 있 유기 체19, 20. 또한, 예쁜 유전자는 자주 사용 인구 유전 학문에 유전자 표식으로 DNA barcoding 분석, 은행 및 굵게21와 같은 오픈 소스 데이터베이스에서 수많은 DNA 시퀀스 항목 결과로 서명 순서 ,22. B. tabaci에서 공개적으로 사용 가능한 예쁜 시퀀스, 옆에 예쁜 밀접 한 관련이 종에서 시퀀스 (Aleurocanthus 종 [N = 2], Aleurochiton aceris, Aleurodicus dugesii, Bemisia 종 [N = 3], Neomaskellia andropogonis, Tetraleurodes acaciae및 이 종 [N = 4])이이 연구의 뇌관 디자인에 포함 되었고 진단 민감도 특이성 철에8 을 평가 하는 데 사용 .
방법, 속도의 정확성 때문 (< 1 h) 및 프로토콜의 단순 분석 결과 스위스 포8가져오기 제어 절차의 일부로 구현 되는 경우 현장 응용 프로그램에 적합 하도록 표시 되었습니다.
Protocol
1입니다. 준비
- Aliquots 알칼리 DNA 추출 솔루션의 준비.
- 분자 학년 물 보충 600 µ M 수산화 칼륨 (KOH)를 사용 하 여 알칼리 DNA 추출 솔루션의 재고 생산 2 µ m 크 레 졸 레드.
주의: 코 물에 녹아 있는 강력한 기반 이다. 유출, 및 피부와 눈 접촉을 피하십시오. - 0.5 mL microcentrifuge 튜브로 알칼리 성 DNA 추출 솔루션 (단계 1.1.1에서에서 준비)의 30 µ L를 분배 및 4 ° c.에 aliquots 저장
참고: aliquoted DNA 추출 솔루션을 사용 하 여 1 년 이내.
- 분자 학년 물 보충 600 µ M 수산화 칼륨 (KOH)를 사용 하 여 알칼리 DNA 추출 솔루션의 재고 생산 2 µ m 크 레 졸 레드.
- B. tabaci 긍정적인 증폭 제어 (PAC)를 준비.
- 램프 대상 DNA 파편의 PCR amplicons를 생성 합니다.
참고: 일반적인 PCR 원칙 및 관행에 소개 로렌스23에 의해 주어진 다.- 합성 하거나 뇌관 C1-J-2195 (5'-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3') TL2-N-3014 (5'-TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA-3)는 미토 콘 드리 아 유전자 예쁜24,25의 단편을 증폭 하 고.
- PCR 반응 표 1에 설명 된 대로 설정 합니다. DNA 추출 물을 사용 하 여 (단계 2.1 참조) 참조 B. tabaci 견본 DNA 템플렛으로의.
참고: 필요한 경우, 제조업체의 지침에 따라 상업 키트를 사용 하 여 PAC에 대 한 B. tabaci DNA 추출 가능 하다. - 다음과 같은 조건을 사용 하 여 열 cycler 프로그램: 95 ° C에서 15 분 40의 45 주기 s 95 ° C, 15에서 45 ° C, 60 이상 램프에서 s s 60 ° c, 72 ° C에서 2 분 72 ° C에서 7 분 4 ° c.에서 개최
- 제조 업체의 프로토콜에 따라 상업 PCR 청소 키트를 사용 하 여 PCR 증폭 제품을 청소 하 고 분자 학년 물에 최종 제품을 elute.
- DNA intercalating 염료와 상용 키트를 사용 하 여 제조업체의 지침에 따라 PCR 증폭 제품의 DNA 농도 측정 하 여 분자 학년 1의 농도를 물으로 희석 ng / µ L. 저장 희석된 PCR 증폭 -20 ° c.에 PAC 재고 솔루션으로 제품
참고: PAC 재고 솔루션을 사용 하 여 1 년 이내. - PAC 재고 솔루션 (준비 단계 1.2.1.5) 0.6 µ M 코를 보충 하 고 분자 학년 5 x 10-3 기의 농도를 물으로 희석 / µ L. 4 ° c.에 제품을 저장
참고: 준비에 사용 B. tabaci 램프의 준비를 위한 5 h 내 PAC를 사용 하 여 다음 단계에서 설명 하는 키트.
- 램프 대상 DNA 파편의 PCR amplicons를 생성 합니다.
-
준비 준비--사용 B. tabaci 램프 키트 (20 단위에 대 한 프로토콜)
- 두 개의 4-튜브 램프 스트립으로 8 튜브 램프 스트립을 잘라 사용이 위.
- 그림 1에 표시 된 스키마에 따라 4-튜브 램프 스트립의 튜브 라벨.
- B. tabaci 램프 반응 mastermix (80 반응에 대 한 프로토콜)을 준비 합니다.
- 1195.1 µ L 준비-사용 GspSSD 등온선 마스터 믹스 (deoxynucleotides, 이중 가닥 바인딩 DNA 바인딩 염료, 황산 마그네슘, pyrophosphatase, GspSSD 중 합 효소 포함)의 추가 및 B. tabaci 램프 뇌관 혼합 2 mL의 717.4 µ L microcentrifuge 튜브입니다. 짧게 소용돌이 및 펄스 원심 분리기입니다.
- B. tabaci 램프 반응 mastermix (단계 1.3.3.1에서에서 준비)의 22.5 µ L 4-튜브 램프 스트립 (1.3.1에서 준비 단계) 및 펄스 원심 분리기의 각 관으로 분배.
- B. tabaci 램프 PAC (단계 1.2 준비) 신속 하 게 소용돌이 및 펄스 원심. 그런 다음, 각 4 튜브 램프 스트립 (그림 1)의 "팩"으로 표시 하는 튜브에 2.5 µ L를 추가 합니다.
- 닫기 뚜껑 및 상점 준비에 사용 B. tabaci 램프 키트-20 ° c.에 단위
참고: 1 년 이내에 그들을 사용 합니다.
2. 현장 램프 분석
- DNA 추출
- 살 균 이쑤시개를 사용 하 여 곤충 표본 30 µ L의 DNA 추출 솔루션 (단계 1.1.2에서에서 준비)를 포함 하는 0.5 mL microcentrifuge 튜브로 전송.
참고: 곤충 추출 솔루션에 몰입 하는 것을 확인 합니다. - Thermomixer (300 rpm)에서 95 ° C에서 5 분에 대 한 샘플을 품 어. 짧게 소용돌이 및 펄스 원심 분리기입니다.
- 살 균 이쑤시개를 사용 하 여 곤충 표본 30 µ L의 DNA 추출 솔루션 (단계 1.1.2에서에서 준비)를 포함 하는 0.5 mL microcentrifuge 튜브로 전송.
-
B. tabaci 램프 분석 결과
- 재개를 준비--사용 B. tabaci 램프 키트 1.3 단계에서 준비. 소용돌이 신속 하 고 펄스 원심 분리기.
참고: 각 키트 중 가능한 두 명의 서로 다른 표본 테스트 하거나 중복에서 한 견본의 DNA 추출 분석 하는 그것. - 샘플 DNA 추출 (단계 2.1에서에서 준비) "S1" 그리고 "S2"의 준비에 사용 B. tabaci 램프 키트 (그림 1) 튜브의 2.5 µ L를 추가 합니다.
- 음의 증폭 제어 (그림 1)에 대 한 "NAC" 분류 관으로의 순수 알칼리 DNA 추출 솔루션 (섹션 1.1에서에서 준비) 2.5 µ L를 추가 합니다.
- 소용돌이 준비--사용 B. tabaci 램프 키트 신속 하 고 원심 분리기를 펄스.
- 삽입 준비--사용 B. tabaci 램프 램프 분석 장치 (실시간 형광 측정) 또는 실시간 PCR 플랫폼으로 장비 하 고 60 분 65 ° c 등온선 DNA 확대 분석을 수행 합니다.
- 이후 냉각 단계 98 ° C까지가 열 하 여 DNA 증폭 제품의 녹는 온도 측정 (램프 속도 0.05 ° C/s) 75 ° c, 실시간으로 형광을 측정 하는 동안.
- 재개를 준비--사용 B. tabaci 램프 키트 1.3 단계에서 준비. 소용돌이 신속 하 고 펄스 원심 분리기.
- 램프 분석 결과 읽기
- 다음과 같이 수동으로 램프 큰지를 확인 합니다.
- DNA 확대 샘플 및 PAC에 대 한 측정 했다, 아무 DNA 확대는 NAC에 대 한 측정 되었다 증폭 제품의 어 닐 링 온도 85.5 80.0 ° C 사이 했다, 고려와 램프 결과 긍정적인 (그림 2).
- (즉, 레이블 s 1과 S2 튜브) 샘플에 대 한 DNA 증폭 없습니다 하지만 PAC와 NAC로 램프 결과 고려에 대 한 부정 (그림 2).
- 경우에 샘플에 대 한 DNA 증폭 측정 했다 하지만 해당 증폭 제품의 어 닐 링 온도 범위 80.0 \u2012 85.5 ° C 밖에 있었다 PAC 준 아무 DNA 증폭 및/또는 NAC 준 DNA 증폭, 고려로 램프 결과 부당한 (그림 2)입니다.
- 필요에 따라 램프 유효성 검사 응용 프로그램 (추가 파일 1)를 사용 하 여 램프 큰지를 확인 합니다.
- 대상 종 정의 하 고 테스트 샘플의 수를 정의 합니다. "보고서 생성" 버튼을 클릭 합니다.
- 읽어 전송 (DNA 증폭 예/아니요, 어 닐 링 온도 증폭 제품, 결과의 PAC와 NAC) 현장 램프 분석 장치 또는 유효성 검사 응용 프로그램의 해당 입력된 필드에 실시간 PCR 플랫폼에서. 유효성 검사의 결과 즉시 데이터를 입력 한 후 표시 됩니다.
- 다음과 같이 수동으로 램프 큰지를 확인 합니다.
Representative Results
B. tabaci 램프 분석 결과의 유효성 검사 중 일반 스위스 가져오기 제어 프로세스 동안 도청 곤충 표본 분석된8을 했다. 표본 (카나리아 제도, 도미니카 공화국, 이스라엘, 말레이시아, 모로코, 싱가포르, 태국 및 베트남) 8 개의 다른 국가에서 유래 B. tabaci 유럽 침실8에서 발견의 유전적 다양성을 반영 하 고. 모든 램프 결과 DNA barcoding8교차 검증 했다.
총 80 표본 램프에 의해 분석에서 75 표본 (93.8%) 올바르게 B. tabaci (true-확실성)로 확인 된, 2 명의 표본 (2.5%) 제대로 되지 않는 B. tabaci (true-제외), 그리고 3 명의 표본 (3.8%)로 확인 된 B. tabaci (false 네거티브) (표 2) 아닌 것으로 잘못 확인 되었다8. 올바른 부정적인 결과 두 이 살충제 표본, 공장 제품8 B. tabaci 침실에서와 혼동 될 위험이 높은 비 레 귤 레이트 된 종에서에서 유래. 이러한 결과 바탕으로, 진단 정확도의 다음 측정 계산 했다: 테스트 특이성 (true 음수가 속도), 100%; 감도 (true 양성 속도) 96.2%; 테스트 테스트 효율성 (정확한 테스트 결과의 백분율), 96.3% (표 2)8. 분석 감도 (탐지 한계)를 평가할 때는 B. tabaci 램프 분석 결과 성공적으로 3 개의 기술 복제 (표 3)에 걸쳐 100 fg / µ L 희석 샘플 DNA 증폭.
분석의 하위 집합 (N = 13) 준비에 사용 B. tabaci 램프 키트8를 사용 하 여 식물 건강 사찰단에 의해 스위스 포 취리히 공항에서 현장 조건 하에서 수행 되었다. 때 크로스-참조 실험실에서 검증, 현장 테스트에서 모든 결과 정확 하 게 발견 했다 (테스트 효율 = 100%)8. 현장 램프 시험 성능 평가, 포지티브 (긍정적인 결과 사용할 수 있었습니다 때까지 시간) 평균 시간이 이었다 38.4 ± 10.3 분 (평균 ± 표준 편차)8. 대표적인 DNA 증폭 플롯과 현장 조건 하에서 수행 하는 B. tabaci 램프 분석에서 해당 어 닐 링 파생 그림 3A , B에표시 됩니다. 이 예제에서는 예제 1과 2 올바르게 B. tabaci (그림 3A) 약 30 분 후 DNA 증폭 예상된 어 닐 링 온도 약 82 ° C (그림 3B)에서 함께 표시로 확인 되었다.
그림 1: 프로토콜에 설명 하는 준비--사용 B. tabaci 램프 키트의 실험 설정의 시각화. S1, 샘플 1; S2, 샘플 2; PAC, 긍정적인 증폭 제어; NAC, 부정적인 증폭 제어 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 램프 읽어 유효성 검사 스키마. PAC: 긍정적인 증폭 제어; NAC: 부정적인 증폭 제어 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: (B)의 B. tabaci 램프 분석 DNA 증폭 플롯 (A) 및 어 닐 링 파생 현장 조건 하에서 수행. 형광은 상대 강도 단위에서 측정 했다. 녹색 선, 샘플 1; 오렌지 라인, 샘플 2; 블루 라인, 부정적인 증폭 제어 (NAC); 레드 라인, 긍정적인 증폭 제어 (PAC). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 구성 요소 | 재고 하자마자 | 최종 반응 하자마자 | 반응 당 볼륨 |
| Taq 중 합 효소 마스터 믹스 | 2 x | 1 x | 10 Μ L |
| 뇌관 C1-J-2195 | 20 Μ M | 0.4 Μ M | 0.4 Μ L |
| 뇌관 TL2-N-3014 | 20 Μ M | 0.4 Μ M | 0.4 Μ L |
| 분자 학년 물 | - | - | 8.2 Μ L |
| DNA 템플렛 | - | - | 1 Μ L |
표 1: 대 한 PCR 반응 mastermix의 준비는 B. tabaci 긍정적인 증폭 제어. 구성 요소 고 농도 한 PCR 반응을 설정 하는 데 필요한. 최종 반응 볼륨은 20 µ L. 뇌관 시퀀스 1.2.1.1에 표시 됩니다.
| N | NTP | NFP | N테네시 | NFN | 센 (%) | SPE (%) | EFF (%) |
| 80 | 75 | 0 | 2 | 3 | 96.2 | 100 | 96.3 |
B. 의 표 2: 결과 tabaci 램프 분석 결과 유효성 검사. N, 수의 분석; NTP, 진정한 긍정 결과; 수 NFP, 거짓 양성 결과; 수 N테네시, 사실 네거티브 결과; 수 NFN, false 네거티브 결과; 수 센, 진단 감도; SPE, 진단 특이성, EFF, 효율성을 테스트.
| CDNA (fg / µ l) | N홍보 |
TP (최소) (평균 ± SD) |
TA (° C) (평균 ± SD) |
| 1 x 105 | 3 | 33.5 ± 2.9 | 81.3 ± 0.1 |
| 1 x 104 | 3 | 30.7 ± 1.1 | 81 ± 0.0 |
| 1 x 103 | 3 | 40.4 ± 3.9 | 81.1 ± 0.1 |
| 1 x 102 | 3 | 50.7 ± 1.6 | 81.1 ± 0.1 |
| 1 x 101 | 0 | - | - |
| 1 x 100 | 0 | - | - |
표 3: 분석 감도 (탐지 한계)의 B. tabaci 램프 시험. 각 희석 triplicates에서 시험 되었다. CDNA, DNA 농도 반응; 당 N홍보, 긍정적인 수 복제; TP, 시간까지 긍정적인 결과 사용할 수 있습니다. TA, 어 닐 링 온도; SD, 표준 편차
Discussion
시간 지연 없이 잠재적으로 유해한 유기 체를 정확 하 게 식별 하는 기능 해충 종9,,1026의 관리에 대 한 중요 한 측면을 나타냅니다. 게다가 식물 수입 제품에 대 한 급속 한 되 고, 이상적인 해충 식별 방법 침실8,26현장 수행 간단 해야한다. 이 종이 보고 B. tabaci, 유럽 국경 (https://ec.europa.eu/food/sites/food/files/plant/docs/ph_biosec_europhyt에서 자주 차단 격리 곤충 생물의 급속 한 식별에 대 한 새로운 램프 분석 결과의 프로토콜 _annual 보고서 _2016.pdf)입니다.
진단 검사의 개발 뒤에 있는 근거 최소한의 실험실 훈련 식물 건강 사찰단에 의해 공장 가져오기 제어 절차 동안 실행 될 수 있는 따라 하기 쉬운 프로토콜을 설계 했다. 신속 하 고 가능한 간단 테스트 현장 수 있도록, 프로토콜 준비-사용 장비의 준비와 램프 분석 결과의 실제 성능을 두 부분으로 나누어져 있습니다. DNA 추출 및 램프 분석 결과 하나만 pipetting 단계 현장 공장 보건 관리자가 수행할 수 있도록 외부 실험실에서 첫 번째 부분을 수행할 수 있습니다.
비록 하나의 단계 pipetting 적은 양의 액체 수 있습니다 거의 없거나 전혀 없는 실험실 경험을 가진 사용자에 대 한 도전. 이 문제를 해결 하려면 연산자 시각적으로 DNA의 작은 금액 (즉, 2.5 µ L) 각각 튜브에 제대로 전송 됩니다 확인 수 있도록 염료 (크 레 졸 레드) 추출 솔루션에 추가 됩니다. 프로토콜의 다른 중요 한 단순화로 램프 읽기 (보충 파일 1)의 신뢰할 수 있는 해석을 용이 하 게 유효성 검사 응용 프로그램입니다.
소설 B. tabaci 램프 분석 결과 곤충 표본 스위스8의 일반 가져오기 제어 프로세스 차단 테스트 하 여 실험실 및 현장 조건에 따라 유효성이 검사 되었습니다. 총에서 3 개의 대륙, 아프리카, 유라시아, 북아메리카에서 80 표본 램프에 의해 분석 되었다. 80 표본만 세 (3.8%) 잘못 식별된 (false 네거티브)8했다. 때 false 네거티브 표본 뇌관 대상 DNA 순서 분석, 그들은 지금까지 하지 않은 설명된8새로운 B. tabaci haplotypes 했다 발견 했다. 이러한 결과 바탕으로, B. tabaci 램프 뇌관 세트 수정 하 고 성공적으로 다시 검증8되었습니다.
램프를 포함 하 여, DNA 증폭 기반 방법의 한 가지 주요 한계는 그들은 단지 미리 정의 된 대상 DNA 시퀀스8,27확인. 뇌관 대상 시퀀스에 유전 변이의 포괄적인 지식을 따라서 진단 정확도8,27를 위해 결정적 이다. 그러나, 이러한 정보는 매우 제한 된, 새로 해충 종8신흥의 경우 특히 자주. 비록 드문, 대상 시퀀스에 돌연변이 의해 발생 하는 false 네거티브 결과 예상된8있다. 현재 B. tabaci 램프 분석 결과 경우이 문제에 대 한 솔루션 DNA 바코드 기반 기술, 포 취리히 공항8에서이 진단 테스트의 구현 과정에서 실현 전략으로 조합 이다. 여기, 모든 램프 부정적인 결과 다시8외부 실험실 DNA barcoding에 의해 분석 되었다. 경우에 아직 설명 소설 해충 haplotype 발생 램프 뇌관 barcoding 프로세스8에서 생성 된 DNA 시퀀스를 사용 하 여 수정할 수 있습니다. 따라서,이 2 단계 과정8보장 최대 진단 정확도 부정적인 램프 결과 경우 속도의 결과 손실을 보상 됩니다.
현재 램프 분석 결과 POE에 대 한 설정 비용 약 USD 25, 000입니다. 램프 테스트 식물 해충 (예를 들어, Erwinia amylovora, Flavescence dorée, Guignardia citricarpa)에 대 한 개발의 증가 함께 이러한 일회성 투자 나타납니다 정당화13,15, 그러나 28. 프로토콜 수 잠재적으로 수정할 더욱 이러한 비용을 줄이기 위해. 예를 들어 DNA 추출 온도 믹서는 여기에 사용 되는 95 ° C에 단계 수 대체 될 덜 비싼 물 목욕 하거나 직접 실시간으로 램프 장치에서에서이 단계를 수행 하 여. 또한, 소용돌이에 혼합 단계는 수동으로 튜브, 터치 하 여 아마 대체 될 수 있었다 그리고 DNA 전송 단계에서는 pipettor 살 균 접종 루프에 의해 대체 될 수 있습니다.
B. tabaci 및 해충의 급속 한 식별에 대 한 향후 개선 일반적 침실에서 DNA barcoding 분석을 수행할 수 있도록 현장 시퀀싱의 구현 될 수 있습니다. 이러한 구현 위한 유망한 후보 시스템 nanopore 시퀀싱 기술 이다. 실제로, 기술은 최근 되었습니다 성공적으로 구현 했습니다 우림8,,2930의 생물 다양성을 평가 하기 위해 현장 DNA barcoding 노력. 방문 DNA barcoding 식별 시스템 완전히 대상된 진단 검사의 개발 및 그들의 유효성 검사에 대 한 필요성을 대체할 수 있습니다. 또한 농약 저항 유전자8해충 특성에 대 한 추가 정보를 수집 하는 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 소설 시퀀싱 기술을 일상적으로 구현 될 것입니다 때까지 B. tabaci 램프 분석 결과 빠른을 나타냅니다 (< 1 h) 및 정확한 식별 방법.
Disclosures
저자 마이클 안 드레 우 시 약을 생산 하 고이 문서에서 사용 되는 계기 OptiGene 제한의 주주 이다. 다른 저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 감사 아네트 Grendelmeier, 해파리 Drenovac, Cornelia Studer, 다니엘 프라이, 엘리자베스 호라산에라자비, Markus Oggenfuss, Seraina Vonzun, 그리고 스벤 Moeller B. tabaci 램프 분석 결과의 유효성 검사에 참여.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B. tabaci LAMP primer mix | OptiGene Ltd. | on request | For preparation of read-to-use B. tabaci LAMP kit |
| Centrifuge MiniSpin | Eppendorf AG | 5452000010 | For several centrifugation steps |
| Cresol red (red dye) | Sigma-Aldrich Corp. | 114472 | Component of DNA extraction solution |
| Eppendorf ThermoMixer | Eppendorf AG | 5382000015 | For DNA extraction |
| Genie II (on-site LAMP analysis device) | OptiGene Ltd. | Genie® II | For LAMP analysis |
| Genie Strips (8-tube LAMP strips) | OptiGene Ltd. | OP-0008-50 | For preparation of read-to-use B. tabaci LAMP kit |
| HotStarTaq Master Mix | Qiagen AG | 203443 | For generation of positive amplification control |
| Labcycler (Thermocycler) | SensoQuest GmbH, distributed by Witec AG |
011-103 | For DNA extraction |
| GspSSD Lyse n' Lamp Isothermal Mastermix | OptiGene Ltd. | ISO-001LNL | For preparation of read-to-use B. tabaci LAMP kit |
| Mini centrifuge Labnet Prism | Labnet International Inc. | C1801 | For several centrifugation steps |
| NucleoFast 96 PCR | Marcherey-Nagel GmbH | 743500.4 | For clean-up of positive amplification control |
| Potassium hydroxide solution | Sigma-Aldrich Corp. | 319376 | Component of DNA extraction solution |
| Qbit Fluorometer 3 | Thermo Fisher Scientific Corp. | Q33226 | For measuring DNA conentration of positive control |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | For clean-up of positive amplification control |
| Safe-Lock Tubes 0.5 mL (microcentrifuge tube) | Eppendorf AG | 0030 121.023 | For DNA extraction |
| Safe-Lock Tubes 2.0 mL (microcentrifuge tube) | Eppendorf AG | 0030 120.094 | For preparation of read-to-use B. tabaci LAMP kit |
| Wood Toothpicks | VWR International LLC | 470226-594 | For DNA extraction |
| Vortex-Genie 2 (Vortex) | Scientific Industries Inc. | SI-0236 | For several mixing steps |
References
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