Summary
Dette papiret rapporterer protokollen for en rask identifikasjon analysen for Bemisia tabaci basert på loop-mediert isotermiske forsterkning (lampe)-teknologi. Protokollen krever minimal laboratorium trening og kan derfor bli gjennomført på stedet ved innførselsstedene for plante import som havner og flyplasser.
Abstract
Whitefly Bemisia tabaci (brakte) er en invasiv pest av betydelig viktighet, påvirker produksjonen av vegetabilske og dekorativ avlinger i mange land rundt om i verden. Alvorlig gir tap er forårsaket av direkte mate, og enda viktigere, også av mer enn 100 skadelige anlegget patogene virus. As for other invasive pests, increased international trade facilitates the dispersal of B. tabaci to areas beyond its native range. Inspeksjoner av anlegget importere produkter på innførselsstedene som havner og flyplasser er derfor sett på som en viktig forebyggende tiltak. Denne siste linje av forsvar mot pest invasjoner er imidlertid bare hvis rask metodene for mistenkelig insekt prøver er lett tilgjengelig. Fordi morfologiske differensiering mellom regulert B. tabaci og nære slektninger uten karantene status er vanskelig for ikke-taxonomists, en rask molekylær identifikasjon analysen basert på loop-mediert isotermiske forsterkning ( LAMPE) teknologi har blitt utviklet. Denne publikasjonen rapporterer detaljert protokollen av romanen analysen som beskriver rask DNA utvinning, oppsett av lampe reaksjonen og tolkning av sine lese-ut, som kan identifisere B. tabaci prøver innen én time. Sammenlignet med eksisterende protokoller for påvisning av bestemte B. tabaci biotypes, utviklet metoden mål hele B. tabaci Art i ett analysen. Videre er analysen utformet for å brukes på stedet ved å plante helse inspektører med minimal laboratorium trening på innførselsstedene. Grundig validering utført under laboratorium og stedets forhold viser at rapportert lampe analysen er en rask og pålitelig legitimasjonen verktøyet, forbedre forvaltning av B. tabaci.
Introduction
Whitefly Bemisia tabaci (brakte) er en invasiv insekt pest påvirker avkastningen av mange økonomisk viktigste avlingene prydplanter, grønnsaker, korn belgfrukter og bomull1,2. Foruten skader gjennom direkte phloem-fôring, skader homopteran artene planter indirekte utskillelse av store mengder honeydew på overflater av løv og frukt og overføring av mange anlegg patogene virus1 , 3 , 4. genetiske studier sammenligne DNA-sekvenser av mitokondrie genet cytochrome c oksidase 1 (COI) avslørte at B. tabaci er et kompleks av minst 34 morphocryptic arter3,4. To svært invasiv og skadelige medlemmer i dette komplekset, biotype B opprinnelse fra Midtøsten og asiatiske mindre regionen, samt biotype Q stammer fra middelhavsregionen, har blitt spredt globalt gjennom internasjonale trading aktiviteter med plante-produkter, spesielt av transport ornamentals1,5,6. Verdensomspennende pest status, International Union for Conservation of Nature og Natural Resources (IUCN) oppført B. tabaci som en av de "verdens 100 worst invassjonsarter" og medlemmer av Art er regulert organismer av mange land1,3,4.
I den europeiske Union (EU), er B. tabaci oppført i 1AI plante helse direktivet 2000/29/EC vedlegg som en karantene organisme som introduksjon fra land utenfor EU og dens formidling i EU er forbudt4. En viktig forebyggende tiltak mot spredning av karantene organismer er inspeksjon av anlegget forsendelsene ved innførselsstedene (POEs) som flyplasser og havner7,8. I tilfelle er en karantene organisme funnet, den nasjonale anlegget beskyttelse organisasjon (NPPO) ansvarlig anlegger avvise eller behandling (inkludert ødeleggelse) av infested forsendelsen9. Offiserer inspisere importen ofte har imidlertid ikke taksonomisk kompetanse til å nøyaktig identifisere det store utvalget av pest arter knyttet til global handel9. Spesielt identifikasjon av umodne livsstadier (f.eks egg og larver) uten distinkte morfologiske nøkler er nesten umulig for ikke-taxonomists8,9,10. Derfor vil aktivere gjennomføringen av karantene tiltak med minimal forsinkelse, er det behov for alternative, rask på stedet identifikasjon analyser9.
En kandidat er loop-mediert isotermiske DNA amplifikasjon (LAMP) teknologien som nylig har blitt vist å være en passende teknologi for identifikasjon av anlegget patogener11,12,13. LAMPEN er svært spesifikke fordi metoden bruker minst to primer par gjenkjenne seks forskjellige DNA målet sekvenser14. På grunn av DNA strand forskyvning aktiviteten til Bst DNA polymerase utføres lampe reaksjoner under isotermiske forhold14. Derfor, i motsetning til konvensjonelle polymerasekjedereaksjons (PCR)-baserte analyser det er ikke behov for en termisk cycler13,14. En annen fordel over PCR-baserte analyser er dens elastisitet mot potensielle hemmere i DNA utdrag, omgå behovet for en DNA rensing trinn13. Protokollen hastighet og enkelhet, kan lampe selv utføres under stedets forhold med en bærbar, batteridrevet sanntids deteksjon enheten8,15.
En lampe analysen ble utviklet som svar på behovet for en rask på stedet metode B. tabaci8. Det overordnede målet var å utvikle en protokoll som kan utføres av plante helse inspektører med begrenset laboratoriet trening. Fokuserer var derfor angi om optimalisering hastighet og enkelhet av protokollen. Mens eksisterende diagnosetester generelt er utviklet for identifikasjon av en eller flere biotypes av B. tabaci, romanen lampe analysen dekker hele B. tabaci arter kompleks8,16,17 ,18. Problemet med uttales genetisk innen-gruppe (biologi) mangfoldet av komplekset ble løst ved hjelp av kombinasjoner av ulike primer sett og anvendelse av degenerert primere8. Romanen B. tabaci lampe analysen er utformet slik at primerne målet et fragment på 3 slutten av mitokondrie COI genet8. Dette genet presenterer et egnet mål for dyr diagnose søk fordi det havner regioner bevart nok til å sikre diagnostiske følsomhet for en bestemt arter, mens diskriminerende nok mellom nærstående organismer19, 20. videre COI genet brukes ofte som en genetisk markør i befolkningen genetiske studier og som en signatur sekvens DNA barcoding analyser, noe som resulterer i mange DNA sekvens oppføringer i åpen kildekode-databaser som GenBank og fet21 ,22. Foruten de offentlig tilgjengelige COI sekvensene fra B. tabaci, COI sekvenser fra nært beslektede arter (Aleurocanthus spp. [N = 2], Aleurochiton aceris, Aleurodicus dugesii, Bemisia spp. [N = 3], Neomaskellia andropogonis, Tetraleurodes acaciaeog Trialeurodes spp. [N = 4]) ble inkludert i primer utformingen av denne studien og brukes til å vurdere diagnostiske sensitivitet og spesifisitet i sili8 .
På grunn av nøyaktigheten av metoden hastigheten (< 1 h) og enkelhet av protokollen, analysen har vist å være på stedet anvendes når implementert som en del av kontroll Importprosedyren på sveitsiske POE8.
Protocol
1. forberedelser
- Forbereder dele DNA utvinning lut.
- Produsere et lager av alkalisk DNA utvinning løsning med molekylær klasse vann med 600 µM kaliumhydroksid (KOH) og 2 µM Cresol Red.
FORSIKTIG: KOH er en sterk base oppløst i vann. Unngå søl, og hud og øyekontakt. - Dispensere 30 µL av alkalisk DNA utvinning løsning (forberedt i trinn 1.1.1) i 0,5 mL microcentrifuge rør og lagre dele på 4 ° C.
Merk: Bruk aliquoted DNA utvinning løsningen innen 1 år.
- Produsere et lager av alkalisk DNA utvinning løsning med molekylær klasse vann med 600 µM kaliumhydroksid (KOH) og 2 µM Cresol Red.
- Forbereder B. tabaci positiv forsterkning kontroll (PAC).
- Generere PCR amplicons av lampe målet DNA fragment.
Merk: En introduksjon til generelle PCR prinsipper og praksis er gitt av Lorenz23.- Syntetisere eller skaffe deg primere C1-J-2195 (5'-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3 ") og TL2-N-3014 (5'-TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA-3) forsterke et fragment av mitokondrie COI genet24,25.
- Definere PCR reaksjonen som beskrevet i tabell 1. Bruke DNA ekstrakt (se trinn 2.1) av en referanse B. tabaci som DNA mal.
Merk: Hvis det er mulig å trekke B. tabaci DNA for PAC bruker en kommersiell kit i henhold til produsentens instruksjoner. - Programmet en termisk cycler bruker følgende: 15 minutter til 95 ° c. 45 sykluser av 40 s på 95 ° C, 15 s ved 45 ° C, gradvis over 60 s til 60 ° C, 2 min ved 72 ° C; 7 min ved 72 ° C; Hold på 4 ° C.
- Rengjør PCR forsterkning produktet bruker en kommersiell PCR oppryddingen kit i henhold til produsentens protokollen og elute det endelige produktet i molekylær klasse vann.
- Bruk en kommersiell kit med DNA-intercalating fargestoff å måle DNA konsentrasjonen av PCR forsterkning produktet etter produsentens instruksjoner og fortynn med molekylær klasse vann til en konsentrasjon av 1 ng / µL. Store utvannet PCR forsterkning produktet som PAC lagerløsning på 20 ° C.
Merk: Bruk PAC lagerløsning innen 1 år. - Supplere PAC lager løsningen (forberedt i trinn 1.2.1.5) med 0.6 µM KOH og fortynn med molekylær klasse vann til en konsentrasjon av 5 x 10-3 ng / µL. Store produktet på 4 ° C.
Merk: Bruk PAC innen 5 h for utarbeidelse av klar-å-bruk B. tabaci lampe kits som beskrevet i neste trinn.
- Generere PCR amplicons av lampe målet DNA fragment.
-
Forbereder klar til bruk B. tabaci lampe kit (protokoll for 20 enheter)
- Bruk saks til å klippe 8-tube lampe strimler i to 4-rør lampe strimler.
- Etiketten rørene av 4-rør lampe strimler i henhold til ordningen som vist i figur 1.
- Forberede B. tabaci lampe reaksjon mastermix (protokollen for 80 reaksjoner).
- Legge til 1195.1 µL av klar-å-bruke GspSSD isotermiske master mix (inneholder GspSSD utvalg, pyrophosphatase, Magnesiumsulfat, deoxynucleotides, dobbel tråd bindende DNA bindende fargestoff) og 717.4 µL av B. tabaci lampe primer blanding til en 2 mL microcentrifuge tube. Kort vortex og puls sentrifuge.
- Dispensere 22,5 µL av B. tabaci lampe reaksjon mastermix (forberedt i trinn 1.3.3.1) i hver tube 4-rør lampe strimler (forberedt i trinn 1.3.1) og puls sentrifuge.
- Vortex B. tabaci lampe PAC (forberedt i trinn 1.2) raskt og puls sentrifuge. Legg deretter til 2,5 µL inn i røret merket med "PAC" hver 4-rør lampe Strip (figur 1).
- Lukk lokkene og lager av klar-å-bruke B. tabaci lampe kit enheter på 20 ° C.
Merk: Bruke dem innen 1 år.
2. på stedet lampe analyse
- DNA utvinning
- Bruke sterilt tannpirkere for å overføre de insekt prøvene i 0,5 mL microcentrifuge rør som inneholder 30 µL av DNA utvinning løsning (forberedt i trinn 1.1.2).
Merk: Kontroller at insekter er nedsenket i utvinning løsningen. - Inkuber prøvene i 5 min på 95 ° C i en thermomixer (300 rpm). Kort vortex og puls sentrifuge.
- Bruke sterilt tannpirkere for å overføre de insekt prøvene i 0,5 mL microcentrifuge rør som inneholder 30 µL av DNA utvinning løsning (forberedt i trinn 1.1.2).
-
B. tabaci lampe analysen
- Tøvær en klar-å-bruke B. tabaci lampe kit utarbeidet i trinn 1.3. Vortex raskt og puls sentrifuge.
Merk: Med hvert sett er det mulig å teste to forskjellige prøver eller å analysere DNA ekstrakt av en prøve i duplikat. - Legge til 2,5 µL av prøven DNA ekstrakt (forberedt i trinn 2.1) inn i rørene merket "S1" og "S2" av klar-å-bruk B. tabaci lampe kit (figur 1).
- Legge til 2,5 µL av ren alkalisk DNA utvinning løsning (forberedt i del 1.1) inn i røret merket "NAC" for kontrollen negativ forsterkning (figur 1).
- Vortex av klar-å-bruke B. tabaci lampe kit raskt og puls sentrifuge.
- Sett inn den klare til bruken B. tabaci lampe kits i lampe analyse enheten (med sanntid fluorescens måling) eller en sanntid PCR-plattform og utføre en isotermiske DNA amplifikasjon analyse på 65 ° C for 60 min.
- Måle de smeltingen temperaturene DNA amplifikasjon produkter ved å varme opp til 98 ° C med en påfølgende kjøling trinn (rampen rate på 0,05 ° C/s) til 75 ° C, mens å måle fluorescens i sanntid.
- Tøvær en klar-å-bruke B. tabaci lampe kit utarbeidet i trinn 1.3. Vortex raskt og puls sentrifuge.
- LAMPE analysen skrivebeskyttet ut
- Validere lampe skrivebeskyttet ut manuelt slik.
- Hvis DNA amplifications ble målt for prøven og PAC, ingen DNA amplifikasjon ble målt for NAC og forsterkning produktene annealing temperaturen var mellom 80,0 og 85.5 ° C, vurdere lampe resultatene som POSITIVE (figur 2).
- Hvis det ikke er noen DNA amplifikasjon for prøvene (dvs. rør med S1 og S2) men PAC og NAC vurdere lampe resultatet som NEGATIVE (figur 2).
- Hvis DNA amplifikasjon ble målt for prøvene, men annealing temperaturen tilsvarende forsterkning produkter var utenfor rekkevidde 80,0 \u2012 85.5 ° C, og/eller PAC ga ingen DNA amplifikasjon og/eller NAC ga en DNA amplifikasjon, vurdere lampe resultatet som Ugyldig (figur 2).
- Du kan også validere lampe skrivebeskyttet ut ved hjelp av lampe validering programmet (ekstra fil 1).
- Definer antall testet prøver definerer målet artene. Klikk på "Generer rapport" -knappen.
- Overføre den lese-out (DNA amplifikasjon Ja/Nei, annealing temperatur forsterkning produkt, resultatene av PAC og NAC) fra stedets lampe analyse enhet eller sanntid PCR-plattformen til tilsvarende input felt av programmet validering. Resultatet av valideringen vises umiddelbart etter inn dataene.
- Validere lampe skrivebeskyttet ut manuelt slik.
Representative Results
Under validering av B. tabaci lampe analysen ble insekt prøver fanget i vanlig sveitsiske kontroll importprosessen analysert8. De stammer fra åtte forskjellige land (Kanariøyene, den dominikanske republikk, Israel, Malaysia, Marokko, Singapore, Thailand og Vietnam), og reflekterer genetisk mangfold av B. tabaci på europeiske POEs8. Alle LAMP resultatene var kors-godkjent av DNA barcoding8.
Fra totalt 80 prøver analysert av lampen, 75 prøver (93.8%) ble riktig identifisert som B. tabaci (sann-positiver), to eksemplarer (2,5%) ble riktig identifisert som ikke B. tabaci (sann-negativer) og tre eksemplarer (3.8%) ble feilaktig identifisert som ikke B. tabaci (USANN-negativer) (tabell 2)8. Rette-negativ resultatene fra to Trialeurodes vaporariorum prøver, ikke regulert Art høy risiko forveksles med B. tabaci på POEs for anlegg produkter8. Basert på disse resultatene, følgende målinger av diagnostisk nøyaktighet ble beregnet: teste spesifisitet (sann-negativ rate), 100%. teste følsomhet (sann-positiv rate), 96.2%. teste effektiviteten (prosent riktig testresultater), 96.3% (tabell 2)8. Når vurdere analytisk følsomheten (deteksjonsgrense), forsterket B. tabaci lampe analysen vellykket eksempel DNA utvannet til 100 fg/µL over tre tekniske replikat (tabell 3).
Et delsett av analyser (N = 13) ble utført under stedets forhold på Swiss POE Zurich Airport av plante helse inspektører ved hjelp av klar-å-bruke B. tabaci lampe kits8. Når cross-godkjent i referanse laboratoriet, alle resultatene fra stedets testing ble funnet for å være riktig (teste effektivitet = 100%)8. Vurdere stedets lampe analysen ytelsen, var gjennomsnittlig tid til positive (tid til en positive resultater var tilgjengelig) 38,4 ± 10.3 min (gjennomsnittlig ± standardavvik)8. En representant DNA amplifikasjon plot og den tilsvarende annealing deriverte av en B. tabaci lampe analyse utført under stedets forhold er vist i figur 3A og B. I dette eksemplet en og to ble riktig identifisert som B. tabaci angitt av DNA amplifikasjon etter ca 30 min (figur 3A) sammen med den forventede annealing temperaturen rundt 82 ° c (figur 3B).
Figur 1: visualisering av det eksperimentelle oppsettet av en klar-å-bruke B. tabaci lampe kit beskrevet i protokollen. S1, prøve 1; S2, eksempel 2; PAC, positiv forsterkning kontroll; NAC, negativ forsterkning kontroll. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: lampe skrivebeskyttet ut validering skjema. PAC: positiv forsterkning kontroll; NAC: negativ forsterkning kontroll. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: DNA amplifikasjon plot (A) og avspenning derivat (B) av en B. tabaci lampe analyse utført under stedets forhold. Fluorescens ble målt i relative intensiteten enheter. Grønn linje, prøve 1; Orange linje, eksempel 2; blå linje, negativ forsterkning kontroll (NAC); rød linje, positiv forsterkning kontroll (PAC). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Komponent | Lager conc. | Siste reaksjon conc. | Volum per reaksjon |
| Taq Polymerase Master Mix | 2 x | 1 x | 10 ΜL |
| Primer C1-J-2195 | 20 ΜM | 0,4 ΜM | 0,4 ΜL |
| Primer TL2-N-3014 | 20 ΜM | 0,4 ΜM | 0,4 ΜL |
| Molekylær Grade vann | - | - | 8.2 ΜL |
| DNA mal | - | - | 1 ΜL |
Tabell 1: Forberedelse av PCR reaksjon mastermix for den B. tabaci positiv forsterkning kontroll. Komponenter og konsentrasjoner nødvendig å sette opp en PCR reaksjon. Den endelige reaksjon er 20 µL Primer sekvenser vises i 1.2.1.1.
| N | NTP | NFP | NTN | NFN | SEN (%) | SPE (%) | EFF (%) |
| 80 | 75 | 0 | 2 | 3 | 96.2 | 100 | 96.3 |
Tabell 2: Resultatene av B. tabaci LAMPE analysen validering. N, antall analyser; NTP, antall sann-positive resultater; NFP, antall falske positive resultater; NTN, antall sann-negative resultater; NFN, antall falske-negative resultater; SEN, diagnostiske følsomhet; SPE, diagnostiske spesifisitet, EFF, teste effektiviteten.
| CDNA (fg/µL) | NPR |
TP (min) (mener ± SD) |
TA (° C) (mener ± SD) |
| 1 x 105 | 3 | 33,5 ± 2.9 | 81.3 ± 0,1 |
| 1 x 104 | 3 | 30.7 ± 1.1 | 81 ± 0,0 |
| 1 x 103 | 3 | 40.4 ± 3.9 | 81.1 ± 0,1 |
| 1 x 102 | 3 | 50.7 ± 1.6 | 81.1 ±0.1 |
| 1 x 101 | 0 | - | - |
| 1 x 100 | 0 | - | - |
Tabell 3: analytisk følsomhet (deteksjonsgrense) på den B. tabaci lampe analysen. Hver fortynning ble testet i triplicates. CDNA, DNA konsentrasjon per reaksjon; NPR, antall positive replikerer; TP, tid til et positivt resultat var tilgjengelig. TA, annealing temperatur; SD, standardavvik.
Discussion
Evnen til å nøyaktig identifisere skadelige organismer uten tidsforsinkelse representerer en viktig del for håndtering av pest arter9,10,26. Foruten å være rask, for plante importere produkter, skal en ideell pest metode være enkelt å utføre på stedet på POEs8,26. Dette papiret rapporterer protokollen for en ny lampe analysen for rask identifisering av B. tabaci, en karantene insekt organisme ofte fanget på Europas grenser (https://ec.europa.eu/food/sites/food/files/plant/docs/ph_biosec_europhyt _annual-rapport _2016.pdf).
Begrunnelsen bak utviklingen av den diagnostiske testen var å utforme en lett-å-følge protokollen som kan utføres under den anlegg kontroll importen av plante helse inspektører med minimal laboratorium trening. For å gjøre på stedet testing som rask og enkel som mulig, er protokollen delt i to deler, utarbeidelsen av en klar-å-bruke kit og de faktiske resultatene av lampe analysen. Den første delen kan gjøres i en ekstern laboratorium slik at anlegget helseinspektøren kan utføre DNA utvinning og lampe analysen på stedet med bare ett pipettering trinn.
Selv om bare ett trinn, pipettering små mengder av væske kan være utfordrende for brukernes med liten eller ingen laboratorium erfaring. For å løse dette problemet, legges en farge (cresol rød) til utvinning løsning slik at operatøren kan visuelt kontrollere den lille mengden (dvs. 2,5 µL) av DNA overføres riktig til respektive røret. En annen viktig forenkling av protokollen er validering programmet som det muliggjør en pålitelig tolkning av lampe lese-out (ekstra fil 1).
Romanen B. tabaci lampe analysen er validert under laboratorium og stedets forhold ved testing insekt prøver fanget under regelmessig import kontroll av Sveits8. Totalt ble 80 prøver fra tre kontinenter, Afrika, Eurasia og Nord-Amerika, analysert av lampen. Av de 80 prøvene ble bare tre (3.8%) feilaktig identifisert (USANN-negativer)8. Når du analyserer primer målet DNA-sekvenser av de falske-negativ, ble det funnet at de var nye B. tabaci haplotypes som ikke har så langt vært beskrevet8. Basert på disse resultatene, er B. tabaci lampe primer settet endret og vellykket nytt validert8.
Ettall større begrensningen av noen DNA amplifikasjon-basert metode inkludert lampe er at de bare identifiserer pre-definerte mål DNA-sekvenser8,27. En omfattende kunnskap om den genetisk variasjonen i primer målet sekvensen er derfor avgjørende å sikre diagnostisk nøyaktighet8,27. Slik informasjon er imidlertid ofte svært begrenset, spesielt når det gjelder nye pest arter8. Skjønt sjelden, er USANN-negativ resultatene forårsaket av mutasjoner i målet sekvensen forventet8. Ved dagens B. tabaci lampe analysen er en løsning for dette problemet kombinasjonen med DNA barcoding-basert teknologi, en strategi realisert i gjennomføringen av denne diagnosetesten POE Zurich Airport8. Her ble alle lampe-negative resultater re analysert av DNA barcoding i en ekstern laboratorium8. I tilfelle en roman pest haplotype ennå ikke beskrives er oppstått, kan lampe primerne endres ved hjelp av DNA sekvensen generert i barcoding prosessen8. Dermed er den resulterende tap av fart ved et negativt lampe resultat kompensert av maksimal diagnostisk nøyaktighet sikret i denne to-trinns prosess8.
Sette opp kostnadene for gjeldende lampe analysen på en POE er ca USD 25.000. Med økende antall lampe tester utviklet for plante skadedyr (f.eks Erwinia amylovora, Flavescence dorée og Guignardia citricarpa), så en engangsinvestering vises berettiget13,15, 28. imidlertid protokollen kan potensielt bli endret for å redusere disse kostnadene ytterligere. For eksempel for DNA utvinning kunne trinn på 95 ° C thermo mixer brukes her erstattes av en rimeligere vannbad eller dette grepet direkte i sanntid lampe enheten. Videre blande trinnene på virvelen kan trolig bli erstattet av manuelt flicking rør, og i DNA overføring trinn i å hindre kan bli erstattet av sterile inoculation looper.
Fremtidige forbedringer for en rask identifikasjon av B. tabaci og pest kan generelt være en implementering av stedets sekvensering tilnærming som ville tillate for å utføre DNA barcoding analyser på POEs. En lovende kandidat system for slike implementering er nanopore sekvensering teknologi. Faktisk har teknologien nylig blitt implementert i et stedets DNA barcoding forsøk på å vurdere biologisk mangfold i en regnskog8,29,30. En egen DNA barcoding identifikasjonssystem kan erstatte behovet for utvikling av målrettet diagnostiske tester og deres validering. Det kan også samle ytterligere informasjon om pest egenskaper som plantevernmidler motstand gener8. Likevel, til Roman sekvensering teknologi implementeres rutinemessig, B. tabaci lampe analysen representerer en rask (< 1 h) og nøyaktig metode.
Disclosures
Forfatteren Michael Andreou er aksjonær av OptiGene Limited som produserer reagenser og instrumenter brukes i denne artikkelen. Andre forfattere ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne er takknemlige for Annette Grendelmeier, Aurelia Drenovac, Cornelia Studer, Daniel Frei, Elisabeth Razavi, Markus Oggenfuss, Seraina Vonzun og Sven Moeller for å delta i validering av B. tabaci lampe analysen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B. tabaci LAMP primer mix | OptiGene Ltd. | on request | For preparation of read-to-use B. tabaci LAMP kit |
| Centrifuge MiniSpin | Eppendorf AG | 5452000010 | For several centrifugation steps |
| Cresol red (red dye) | Sigma-Aldrich Corp. | 114472 | Component of DNA extraction solution |
| Eppendorf ThermoMixer | Eppendorf AG | 5382000015 | For DNA extraction |
| Genie II (on-site LAMP analysis device) | OptiGene Ltd. | Genie® II | For LAMP analysis |
| Genie Strips (8-tube LAMP strips) | OptiGene Ltd. | OP-0008-50 | For preparation of read-to-use B. tabaci LAMP kit |
| HotStarTaq Master Mix | Qiagen AG | 203443 | For generation of positive amplification control |
| Labcycler (Thermocycler) | SensoQuest GmbH, distributed by Witec AG |
011-103 | For DNA extraction |
| GspSSD Lyse n' Lamp Isothermal Mastermix | OptiGene Ltd. | ISO-001LNL | For preparation of read-to-use B. tabaci LAMP kit |
| Mini centrifuge Labnet Prism | Labnet International Inc. | C1801 | For several centrifugation steps |
| NucleoFast 96 PCR | Marcherey-Nagel GmbH | 743500.4 | For clean-up of positive amplification control |
| Potassium hydroxide solution | Sigma-Aldrich Corp. | 319376 | Component of DNA extraction solution |
| Qbit Fluorometer 3 | Thermo Fisher Scientific Corp. | Q33226 | For measuring DNA conentration of positive control |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | For clean-up of positive amplification control |
| Safe-Lock Tubes 0.5 mL (microcentrifuge tube) | Eppendorf AG | 0030 121.023 | For DNA extraction |
| Safe-Lock Tubes 2.0 mL (microcentrifuge tube) | Eppendorf AG | 0030 120.094 | For preparation of read-to-use B. tabaci LAMP kit |
| Wood Toothpicks | VWR International LLC | 470226-594 | For DNA extraction |
| Vortex-Genie 2 (Vortex) | Scientific Industries Inc. | SI-0236 | For several mixing steps |
References
- De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. Bemisia tabaci: a statement of species status. Annual Review of Entomology. 56, 1-19 (2011).
- Zhang, G. F., Lü, Z. C., Wan, F. H., Lövei, G. L. Real-time PCR quantification of Bemisia tabaci (Homoptera: Aleyrodidae) B-biotype remains in predator guts. Molecular Ecology Notes. 7 (6), 947-954 (2007).
- Boykin, L. M., De Barro, P. J. A practical guide to identifying members of the Bemisia tabaci species complex: and other morphologically identical species. Frontiers in Ecology and Evolution. 2, (2014).
- Cuthbertson, A. G. S., Vänninen, I. The importance of maintaining protected zone status against Bemisia tabaci. Insects. 6 (2), 432-441 (2015).
- Dalmon, A., Halkett, F., Granier, M., Delatte, H., Peterschmitt, M. Genetic structure of the invasive pest Bemisia tabaci: evidence of limited but persistent genetic differentiation in glasshouse populations. Heredity. 100 (3), 316-325 (2008).
- Dickey, A. M., Osborne, L. S., Shatters, R. G., Hall, P. A. M., Mckenzie, C. L. Population genetics of invasive Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) cryptic species in the United States based on microsatellite markers. Journal of Economic Entomology. 106 (3), 1355-1364 (2013).
- Bacon, S. J., Bacher, S., Aebi, A. Gaps in border controls are related to quarantine alien insect invasions in Europe. PLOS ONE. 7 (10), e47689 (2012).
- Blaser, S., et al. From laboratory to point of entry: development and implementation of a loop-mediated isothermal amplification (LAMP)-based genetic identification system to prevent introduction of quarantine insect species. Pest Management Science. 74 (6), 1504-1512 (2018).
- Floyd, R., Lima, J., de Waard, J., Humble, L., Hanner, R. Common goals: policy implications of DNA barcoding as a protocol for identification of arthropod pests. Biological Invasions. 12 (9), 2947-2954 (2010).
- Armstrong, K. F., Ball, S. L. DNA barcodes for biosecurity: invasive species identification. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 360 (1462), 1813-1823 (2005).
- Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research. 28 (12), E63 (2000).
- Tomlinson, J. A., Boonham, N., Dickinson, M. Development and evaluation of a one-hour DNA extraction and loop-mediated isothermal amplification assay for rapid detection of phytoplasmas. Plant Pathology. 59 (3), 465-471 (2010).
- Kogovšek, P., et al. LAMP assay and rapid sample preparation method for on-site detection of flavescence dorée phytoplasma in grapevine. Plant Pathology. 64 (2), 286-296 (2015).
- Lee, M. S., Su, T. Y., Lien, Y. Y., Sheu, S. C. The development of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays for the rapid authentication of five forbidden vegetables in strict vegetarian diets. Scientific Reports. 7, 44238 (2017).
- Bühlmann, A., et al. Erwinia amylovora loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay for rapid pathogen detection and on-site diagnosis of fire blight. Journal of Microbiological Methods. 92 (3), 332-339 (2013).
- Cavalieri, V., Manglli, A., Tiberini, A., Tomassoli, L., Rapisarda, C. Rapid identification of Trialeurodes vaporariorum, Bemisia tabaci (MEAM1 and MED) and tomato-infecting criniviruses in whiteflies and in tomato leaves by real-time reverse transcription-PCR assay. Bulletin of Insectology. 67 (2), 219-225 (2014).
- Baek, J. H., Lee, H. J., Kim, Y. H., Lim, K. J., Lee, S. H., Kim, B. J. Development of an antibody-based diagnostic method for the identification of Bemisia tabaci biotype B. Pesticide Biochemistry and Physiology. 131, 18-23 (2016).
- Hsieh, C. H., Wang, H. Y., Chen, Y. F., Ko, C. C. Loop-mediated isothermal amplification for rapid identification of biotypes B and Q of the globally invasive pest Bemisia tabaci, and studying population dynamics. Pest Management Science. 68 (8), 1206-1213 (2012).
- Rejili, M., et al. A PCR-based diagnostic assay for detecting DNA of the olive fruit fly, Bactrocera oleae, in the gut of soil-living arthropods. Bulletin of Entomological Research. 106 (5), 695-699 (2016).
- Hebert, P. D. N., Ratnasingham, S., deWaard, J. R. Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species. Proceedings. Biological Sciences. 270 (Suppl 1), 96-99 (2003).
- Ratnasingham, S., Hebert, P. D. N. bold: The Barcode of Life Data System (http://www.barcodinglife.org). Molecular Ecology Notes. 7 (3), 355-364 (2007).
- Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Bank Wheeler, D. L. G. en
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Simon, C., Frati, F., Beckenbach, A., Crespi, B., Liu, H., Flook, P. Evolution, weighting, and phylogenetic utility of mitochondrial gene sequences and a compilation of conserved polymerase chain reaction primers. Annals of the Entomological Society of America. 87 (6), 651-701 (1994).
- Simon, C., Buckley, T. R., Frati, F., Stewart, J. B., Beckenbach, A. T. Incorporating molecular evolution into phylogenetic analysis, and a new compilation of conserved polymerase chain reaction primers for animal mitochondrial DNA. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 37 (1), 545-579 (2006).
- Harper, S. J., Ward, L. I., Clover, G. R. G. Development of LAMP and real-time PCR methods for the rapid detection of Xylella fastidiosa for quarantine and field applications. Phytopathology. 100 (12), 1282-1288 (2010).
- Lauri, A., Mariani, P. O. Potentials and limitations of molecular diagnostic methods in food safety. Genes & Nutrition. 4 (1), 1-12 (2009).
- Tomlinson, J. A., et al. A loop-mediated isothermal amplification-based method for confirmation of Guignardia citricarpa in citrus black spot lesions. European Journal of Plant Pathology. 136 (2), 217-224 (2013).
- Branton, D., et al. The potential and challenges of nanopore sequencing. Nature Biotechnology. 26 (10), 1146-1153 (2008).
- Pomerantz, A., et al. Real-time DNA barcoding in a rainforest using nanopore sequencing: opportunities for rapid biodiversity assessments and local capacity building. GigaScience. 7 (4), giy033 (2018).
