Summary
הנייר הזה מדווח הפרוטוקול עבור וזמינותו זיהוי מהיר של כנימת עש הטבק מבוסס על טכנולוגיית בתיווך לופ הגברה איזותרמי (מנורה). הפרוטוקול דורש הכשרה מינימלית מעבדה, לכן, ניתן ליישם באתר בנקודות של ערך היבוא צמח כגון הקנתה ושדות תעופה.
Abstract
הטבק כנימת עש הטבק (Gennadius) הוא המזיק פולשנית חשיבות ניכרת, להשפיע על הייצור של גידולי ירקות ו נוי במדינות רבות ברחבי העולם. ההפסדים חמורות נגרמות מאכילים ישירה, וחשוב עוד יותר, גם השידור של יותר מ-100 צמח מזיקים וירוסים פתוגניים. לגבי מזיקים אחרים פולשני, ולהרחבת הסחר הבינלאומי מקלה על פיזור עש דרב לאזורים מעבר לטווח המקורי שלה. בדיקות של צמח לייבא מוצרים בנקודות הכניסה כגון הקנתה, נמלי תעופה, לכן, נראים כמו אמצעי מניעה חשוב. עם זאת, זו השורה האחרונה של הגנה מפני פלישות המזיק יעילה רק אם שיטות זיהוי מהיר של דגימות חרקים חשוד זמינים. כי הבידול מורפולוגיים בין קרובים ללא בידוד מעמד מוסדר עש ב קשה עבור הלא-טקסונומים, assay זיהוי מולקולרי מהיר המבוסס על (בתיווך לופ הגברה איזותרמי פותחה טכנולוגיה המנורה). פרסום זה מדווח פרוטוקול מפורט של מיצוי assay רומן המתאר DNA מהירה, הסידור של התגובה המנורה, כמו גם הפרשנות שלה read-out, המאפשרת לזהות דגימות עש דרב בתוך שעה אחת. בהשוואה הפרוטוקולים הקיימים עבור זיהוי ספציפי עש ב biotypes, השיטה שפותחה מטרות כל זן עש ב מתחם assay אחד. יתר על כן וזמינותו נועד להיות מיושם באתר על ידי פקחי בריאות הצמח עם הכשרה מינימלית מעבדה ישירות על נקודות כניסה. אימות יסודי תחת מעבדה והתנאים באתר מדגים כי וזמינותו המנורה שדווח הוא כלי זיהוי מהיר ואמין, לשפר את הניהול של עש ב.
Introduction
הטבק כנימת עש הטבק (Gennadius) היא מזיקים חרקים פולשנית המשפיעים על התשואה של גידולים חשובים מבחינה כלכלית רבים, כולל צמחי נוי, ירקות, דגנים קטניות כותנה1,2. לצד הנזק שנגרם באמצעות האכלה שיפה ישירה, המין homopteran פוגעת צמחים באופן עקיף על ידי הפרשה של כמויות גדולות של טל על גבי המשטחים של עלים ופירות, כמו גם על ידי השידור של צמחים רבים וירוסים פתוגניים1 , 3 , 4. מחקרים גנטיים מהשנים האחרונות השוואת DNA רצף ציטוכרום c אוקסידאז של גן מיטוכונדריאלי 1 (COI) גילה כי נולד ב- עש הטבק הוא זן מורכב של morphocryptic לפחות 34 מינים3,4. שני חברים מאוד פולשנית ופוגעים בתוך זה מתחם, biotype B שמקורן במזרח התיכון ובאזור אסיה משנית, וכן biotype Q שמקורם באזור הים תיכוני, יש כבר התפזרו ברחבי העולם דרך מסחר בינלאומי פעילות עם מוצרי המפעל, במיוחד על ידי אמצעי התחבורה של צמחי נוי-1,-5,-6. בשל מעמדה המזיק ברחבי העולם, האיגוד הבינלאומי לשימור הטבע, משאבים טבעיים (IUCN) המפורטים עש דרב כאחת "מין פולש זר הגרועה 100 בעולם", חברי מורכבים המין הם אורגניזמים מוסדר על ידי הרבה מדינות1,3,4.
ב האיחוד האירופי (EU), עש דרב נכלל ברשימת 1AI צמח הבריאות הוראה 2000/29/EC לספח כל אורגניזם הסגר אשר המבוא של מדינות האיחוד, הפצתו בתוך האיחוד האירופי הם אסרו4. אמצעי מניעה חיוני נגד התפשטות אורגניזמים הסגר היא הבדיקה של הצמח משלוחים-נקודות כניסה. כן, הכול (. בסדר) כמו נמלי האוויר והים7,8. במקרה אורגניזם הסגר נמצא, נבחרת הצמח הגנה הארגון (NPPO) אחראי נוקטת בפעולה או דחיה או טיפול (כולל הרס) של המשלוח שורץ9. עם זאת, השוטרים בודקים היבוא לעיתים קרובות אין מומחיות בטקסונומיה לזהות במדויק את המגוון העצום של מינים המזיק המשויך הסחר העולמי9. במיוחד את הזיהוי של שלבי חיים לא בוגר (למשל, ביצים וזחלים) בלי מפתחות מורפולוגיים ברורים בלתי אפשרי כמעט שאינם טקסונומים8,9,10. כתוצאה מכך, כדי לאפשר מימוש אמצעי בידוד עם השהיה מזערית, יש צורך עבור זיהוי באתר חלופי, מהירה מבחני9.
שיטה מועמד היא בתיווך לולאה איזותרמי DNA הגברה (מנורה) הטכנולוגיה שהופגנה לאחרונה להיות טכנולוגיה מתאימה לזיהוי של הצמח פתוגנים11,12,13. המנורה הוא ספציפי מאוד כי השיטה משתמשת לפחות שני זוגות פריימר להכרת שישה ברורים DNA היעד רצפים14. עקב DNA סטרנד הזחה הפעילות של פולימראז ה-DNA Bst , המנורה תגובות מבוצעות תחת תנאים איזותרמי14. לפיכך, בניגוד תגובת שרשרת של פולימראז קונבנציונאלי (PCR)-לפי מבחני שם הוא אין צורך הצנטרפוגה תרמי13,14. יתרון נוסף על מבחני מבוססי ה-PCR היא חוסנה נגד מעכבי פוטנציאליים תמצית ה-DNA, עקיפת הצורך שלב טיהור DNA13. עקב של הפרוטוקול מהירות ופשטות, המנורה אפילו ניתן לבצע בתנאים באתר באמצעות נייד, סוללה מונע זיהוי בזמן אמת התקן8,15.
וזמינותו המנורה עוצבה בתגובה הביקוש שיטת זיהוי מהיר באתר עש נולד ב-8. מטרת העל הייתה לפתח פרוטוקול זה יכול להתבצע על ידי פקחי בריאות הצמח עם הכשרה מעבדה מוגבלת. דגש חזק, לכן נקבע על אופטימיזציה מהירות ופשטות של הפרוטוקול. ואילו בדיקות אבחון הקיימים בדרך כלל פותחו לצורך זיהוי biotypes אחד או מספר של עש דרב, וזמינותו המנורה הרומן מכסה את כל עש ב' מינים מורכבים8,16,17 ,18. הבעיה של המגוון בולטת גנטיים בתוך-טקסון של המתחם נפתר באמצעות שילובים של קבוצות שונות פריימר והיישום של תחל מנוונת8. הרומן עש נ' מנורה assay מתוכנן באופן כזה כי תחל היעד קטע בקצה 3' של ג'ין COI מיטוכונדריאלי8. גן זה מציג מטרה מתאימה עבור מבחני אבחון בעלי חיים בגלל זה בנמלים אזורים והתפאורה מספיק כדי להבטיח אבחון רגישות זן מסוים, תוך כדי להפלות הדוק מספיק בין אורגניזמים19, 20. יתר על כן, הגן COI לעתים קרובות משמש כסמן הגנטי במחקרים גנטיים באוכלוסייה כרצף חתימה ב- DNA barcoding ניתוחים, וכתוצאה מכך רבים ערכי רצף DNA פתוח במסדי נתונים, כגון GenBank מודגש21 ,22. לצד רצפים COI זמין לציבור מפני עש דרב, COI רצף של מינים קרובים (Aleurocanthus spp. [N = 2], Aleurochiton aceris, Aleurodicus dugesii, כנימת spp. [N = 3], Spp. Neomaskellia andropogonis Tetraleurodes השיטים, Trialeurodes [N = 4]) היו כלולים בעיצוב פריימר של מחקר זה, להערכת אבחון רגישות סיליקו8 .
עקב הדיוק של השיטה, מהירותו (< 1 h) ואת הפשטות של הפרוטוקול, וזמינותו הוכח להיות מתאים עבור יישום באתר כאשר מיושמת כחלק הליך בקרת הייבוא פו שוויצרי8.
Protocol
1. תכשירים
- הכנת aliquots של פתרון מיצוי DNA אלקליין.
- לייצר מלאי של אלקליין פתרון מיצוי הדנ א באמצעות כיתה מולקולרית מים בתוספת מיקרומטר 600 אשלגן הידרוקסידי (KOH) ו 2 מיקרומטר Cresol אדום.
התראה: KOH מהווה בסיס חזק מומס במים. הימנע נשפך, ואת העור, קשר עין. - לוותר על 30 µL של אלקליין פתרון הפקת דנ א (להכין בשלב 1.1.1) לתוך צינורות microcentrifuge 0.5 mL ולאחסן את aliquots ב 4 º C.
הערה: השתמש הפתרון aliquoted של הפקת דנ א בתוך שנה אחת.
- לייצר מלאי של אלקליין פתרון מיצוי הדנ א באמצעות כיתה מולקולרית מים בתוספת מיקרומטר 600 אשלגן הידרוקסידי (KOH) ו 2 מיקרומטר Cresol אדום.
- הכנת בקרת הגברה חיובי עש דרב (PAC).
- צור amplicons ה-PCR של קטע DNA היעד המנורה.
הערה: מבוא כללי PCR עקרונות ושיטות ניתנת על ידי לורנץ23.- לסנתז או להשיג את תחל C1-J-2195 (5'-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3 "), TL2-N-3014 (5'-TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA-3′) הגברה שבר של מיטוכונדריאלי COI ג'ין24,25.
- להגדיר את תגובת ה-PCR כפי שמתואר בטבלה 1. השתמש תמצית ה-DNA (ראה שלב 2.1) של הדגימה עש ב הפניה תבנית ה-DNA.
הערה: לחלופין, זה אפשרי לחלץ את עש ב DNA עבור ה-PAC באמצעות ערכת מסחרי על פי הוראות היצרן. - תוכנית של הצנטרפוגה תרמי באמצעות התנאים הבאים: 15 דקות ב 95 מעלות צלזיוס; 45 מחזורי 40 s ב 95 ° C, 15 s ב 45 מעלות צלזיוס, ramping מעל 60 s עד 60 ° צלזיוס, 2 דקות ב-72 מעלות; 7 דקות ב-72 מעלות; . תחזיק על 4 מעלות צלזיוס.
- לנקות את המוצר הגברה PCR באמצעות ערכת ניקיון PCR מסחרי על פי הפרוטוקול של היצרן, elute את המוצר הסופי במים ברמה המולקולרית.
- להשתמש ערכת מסחרי עם צבע intercalating דנ א כדי למדוד את ריכוז הדנ א של המוצר הגברה PCR על פי הוראות היצרן ו לדלל עם מים כיתה מולקולרית כדי ריכוז 1 ng / µL-חנות הגברה PCR מדולל המוצר כפתרון מניות PAC ב-20 ° C.
הערה: השתמש הפתרון מניות PAC בתוך שנה אחת. - תוספת PAC מניות הפתרון (להכין בשלב 1.2.1.5) עם 0.6 מיקרומטר קו ו לדלל עם מים כיתה מולקולרית כדי ריכוז של 5 x 10-3 ng / µL. לאחסן את המוצר ב 4 º C.
הערה: השתמש ה-PAC בתוך 5 שעות עבור הכנת מוכנה לשימוש עש נ' מנורה ערכות המתוארת בשלב הבא.
- צור amplicons ה-PCR של קטע DNA היעד המנורה.
-
הכנת מוכן לשימוש עש נ' מנורה קיט (פרוטוקול עבור 20 יחידות)
- שימוש מספריים כדי לגזור רצועות מנורה 8-שפופרת לתוך שתי רצועות המנורה 4-שפופרת.
- תווית הצינורות של הרצועות 4-שפופרת המנורה על פי התכנית המוצגת באיור1.
- להכין עש נ' מנורה תגובה mastermix (פרוטוקול לתגובות 80).
- הוספת µL 1195.1 של מוכנות לשימוש GspSSD איזותרמי מאסטר מיקס (מכיל פולימראז GspSSD, pyrophosphatase, מגנזיום גופרתי, deoxynucleotides, גדיל כפול איגוד ה-DNA איגוד צבען) ו- µL 717.4 של עש דרב המנורה פריימר שילוב 2 מ ל צינור microcentrifuge. צנטריפוגה בקצרה מערבולת ודופק.
- לוותר על 22.5 µL של המנורה עש ב תגובה mastermix (להכין בשלב 1.3.3.1) לתוך כל שפופרת של 4-שפופרת המנורה רצועות (מוכן ב שלב 1.3.1), הדופק צנטריפוגה.
- צנטריפוגה מערבולת ה עש נ' מנורה-PAC (להכין בשלב 1.2) במהירות ודופק. לאחר מכן, להוסיף 2.5 µL לתוך הצינור בלוחיות הסבר "פאק" כל 4-שפופרת המנורה סטריפ (איור 1).
- קרוב בשלמותם, חנות מוכן לשימוש עש נ' מנורה קיט יחידות ב-20 ° C.
הערה: השתמש אותם בתוך שנה אחת.
2. ניתוח המנורה באתר
- הפקת דנ א
- השתמש קיסמים סטרילי להעביר דגימות חרקים לתוך צינורות microcentrifuge 0.5 mL המכיל 30 µL של פתרון הפקת דנ א (להכין בשלב 1.1.2).
הערה: ודא כי החרקים שקועים בפתרון החילוץ. - דגירה בדגימות למשך 5 דקות ב 95 ° C ב- thermomixer (300 סל ד). צנטריפוגה בקצרה מערבולת ודופק.
- השתמש קיסמים סטרילי להעביר דגימות חרקים לתוך צינורות microcentrifuge 0.5 mL המכיל 30 µL של פתרון הפקת דנ א (להכין בשלב 1.1.2).
-
עש נ' מנורה assay
- הפשרה מוכן לשימוש עש נ' מנורה קיט מוכן בשלב 1.3. מערבולת במהירות, הדופק צנטריפוגה.
הערה: עם כל ערכה, זה גם אפשרי לבחון שתי דגימות שונות או לנתח את תמצית ה-DNA של הדגימה אחד ב כפילויות. - להוסיף 2.5 µL של דגימת DNA תמצית (להכין בשלב 2.1) לתוך הצינורות "S1" ו "S2" של מוכנה לשימוש עש נ' מנורה קיט (איור 1).
- להוסיף 2.5 µL של טהור אלקליין DNA החילוץ פתרון (להכין בסעיף 1.1) לתוך הצינור שכותרתו "NAC" עבור הפקד הגברה שלילי (איור 1).
- מערבולת מוכנות לשימוש עש נ' מנורה קיט במהירות, דופק צנטריפוגה.
- הוספה מוכנות לשימוש עש נ' מנורה לתוך המכשיר ניתוח המנורה (עם מדידת קרינה פלואורסצנטית בזמן אמת) או פלטפורמה PCR בזמן אמת וערכות לבצע ניתוח הגברה DNA איזותרמי ב 65 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.
- למדוד את טמפרטורות ההיתוך של מוצרי הגברה DNA על ידי חימום עד 98 ° C עם צעד קירור עוקבות (כבש שער של 0.05 ° C/s) עד 75 ° C, בעוד מדידת קרינה פלואורסצנטית בזמן אמת.
- הפשרה מוכן לשימוש עש נ' מנורה קיט מוכן בשלב 1.3. מערבולת במהירות, הדופק צנטריפוגה.
- Read-out assay המנורה
- לאמת את המנורה read-out באופן ידני כפי שמוצג להלן.
- אם ה-DNA amplifications נמדדו המדגם, ה-PAC, הגברה DNA לא נמדדה עבור ה-NAC, הטמפרטורה מחזק של מוצרי הגברה היו בין 80.0 ל- 85.5 מעלות C, שקול את תוצאות מנורה כמו חיובי (איור 2).
- אם אין הגברה הדנ א על הדגימות (קרי, צינורות שכותרתו S1 ו- S2) אבל פאק, NAC אז לשקול את התוצאה המנורה שלילי (איור 2).
- אם הדנ א הגברה נמדדה על הדגימות, אבל הקור מחזק של מוצרי הגברה המתאימים היו מחוץ לטווח 80.0 \u2012 85.5 ° C, ו/או PAC נתן אין הגברה DNA ו/או NAC נתן הגברה של ה-DNA, שקול את התוצאה המנורה לא חוקי (איור 2).
- באופן אופציונלי, לאמת את read-out המנורה באמצעות היישום אימות המנורה (קובץ משלים 1).
- להגדיר יעד מינים, להגדיר את מספר הדגימות שנבדקו. לחץ על הלחצן "צור דוח" .
- להעביר את read-out (DNA הגברה כן/לא, חישול טמפרטורה הגברה המוצר, תוצאות של PAC, NAC) באתר המנורה ניתוח ההתקן או פלטפורמה PCR בזמן אמת לשדות המתאימים קלט של היישום אימות. התוצאה של האימות מוצג מיד לאחר הזנת הנתונים.
- לאמת את המנורה read-out באופן ידני כפי שמוצג להלן.
Representative Results
במהלך האימות של עש נ' מנורה וזמינותו, דגימות חרקים יירטה במהלך תהליך בקרת הייבוא שוויצרי רגיל היו שנותחה8. דגימות שמקורם שמונה מדינות שונות (האיים הקנריים, הרפובליקה הדומיניקנית, ישראל, מלזיה, מרוקו, סינגפור, תאילנד ו וייטנאם) ומשקפים את מגוון גנטי של עש ב אירופה כן, הכול בסדר8. כל התוצאות המנורה היו קרוס-אומת על-ידי ה-DNA barcoding8.
מתוך סך של 80 דגימות נותחו על ידי מנורה, דגימות 75 (93.8%) זוהו כהלכה כמו עש דרב (true-תוצאות חיוביות), שתי דגימות (2.5%) זוהו כהלכה כמו לא להיות עש דרב (true-התשלילים) ולאחר 3 דגימות (3.8%) זוהו בטעות כמו לא להיות עש דרב (false-התשלילים) (טבלה 2)8. התוצאות לתקן-שלילי שמקורם שתי דגימות Trialeurodes vaporariorum , זן שאינו מוסדר בסיכון גבוה להתבלבל עם עש ב - כן, הכול בסדר עבור הצמח מוצרים8. בהתבסס על תוצאות אלו, מדידות הבאות של דיוק האבחון חושבו: מבחן ירידה לפרטים (שיעור אמיתי-שלילי), 100%; מבחן רגישות (שיעור אמיתי-חיוביים), 96.2%; בדיקת יעילות (אחוז תוצאות הבדיקה הנכונה), 96.3% (טבלה 2)8. כאשר מעריכים את הרגישות אנליטי (זיהוי מוגבל), וזמינותו עש נ' מנורה מוגבר בהצלחה דגימת DNA מדולל כדי fg 100/µL על פני משכפל טכני 3 (טבלה 3).
תת-קבוצה של מבחני (N = 13) בוצע בתנאים באתר בשדה התעופה ציריך פו שוויצרי על ידי פקחי בריאות הצמח משתמש את מוכנה לשימוש קיטים עש נ' מנורה8. כאשר הצלב-מאומת במעבדה הפניה, כל התוצאות של בדיקות באתר נמצאו כנכון (בדיקת יעילות = 100%)8. הערכת הביצועים assay המנורה באתר, הזמן הממוצע חיובי (זמן עד תוצאות חיוביות היה זמין) היה 38.4 ± 10.3 דקות (זאת אומרת ± סטיית תקן)8. מגרש הגברה דנ א נציג את המתאים נגזרות מחזק ניתוח עש נ' מנורה תחת תנאים באתר מוצגים באיור 3A ו- B. בדוגמה זו, דגימה אחת ושתיים זוהו כהלכה כמו עש דרב שצוין על-ידי ה-DNA הגברה לאחר כ 30 דקות (איור 3A) יחד עם הקור מחזק הצפוי כ 82 מעלות צלזיוס (איור 3B).
איור 1: ויזואליזציה של הסידור ניסיוני של מוכן לשימוש ערכת עש דרב המנורה המתוארת בפרוטוקול. S1, לדוגמה 1; S2, לדוגמה 2; PAC, בקרת הגברה חיובי; NAC, בקרת הגברה שלילי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: המנורה read-out אימות סכימה. PAC: בקרת הגברה חיובי; NAC: בקרת הגברה שלילי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: ה-DNA הגברה נגזרת מגרש (א) ו חישול (B) של ניתוח עש נ' מנורה שבוצעה בתנאים באתר- קרינה פלואורסצנטית נמדד ביחידות שהבוטות היחסית. הקו הירוק, לדוגמה 1; קו הכתום, לדוגמה 2; הקו הכחול, בקרת הגברה שלילי (NAC); הקו האדום, בקרת הגברה חיובי (PAC). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| רכיב | מניות conc. | תגובה אחרונה conc... | נפח לכל תגובה |
| מיקס מאסטר פולימראז Taq | 2 x | 1 x | 10 ΜL |
| פריימר C1-J-2195 | 20 מיקרומטר | מיקרומטר 0.4 | 0.4 ΜL |
| פריימר TL2-N-3014 | 20 מיקרומטר | מיקרומטר 0.4 | 0.4 ΜL |
| מים ברמה מולקולרית | - | - | 8.2 ΜL |
| תבנית ה-DNA | - | - | 1 ΜL |
טבלה 1: הכנת PCR mastermix תגובה עבור עש דרב בקרת הגברה חיובי. רכיבים וריכוזי צורך להגדיר אחד התגובה ה-PCR. אמצעי האחסון התגובה האחרונה נמצא 20 µL. פריימר רצפים מוצגות באיור 1.2.1.1.
| N | NTP | NFP | NTN | NFN | סאן (%) | SPE (%) | EFF (%) |
| 80 | 75 | 0 | 2 | 3 | 96.2 | 100 | 96.3 |
טבלה 2: התוצאות של B. עש המנורה assay אימות. N, מספר ניתוחים; NTP, מספר תוצאות אמת-חיוביות; NFP, מספר תוצאות חיוביות שגויות; NTN, מספר תוצאות אמת-שלילי; NFN, מספר תוצאות false-שלילי; סאן, אבחון רגישות; SPE, אבחון ירידה לפרטים, EFF, בדיקת יעילות.
| גדנ א (fg/µL) | Nיחסי ציבור |
TP (דקות) (אומר ± SD) |
T.A (° C) (אומר ± SD) |
| עונה 1 פרק 105 | 3 | 33.5 ± 2.9 | 81.3 ± 0.1 |
| עונה 1 פרק 104 | 3 | 30.7 ± 1.1 | 81 ± 0.0 |
| עונה 1 פרק 103 | 3 | 40.4 ± 3.9 | 81.1 ± 0.1 |
| עונה 1 פרק 102 | 3 | 50.7 ± 1.6 | 81.1 ±0.1 |
| עונה 1 פרק 101 | 0 | - | - |
| עונה 1 פרק 100 | 0 | - | - |
טבלה 3: רגישות אנליטי (זיהוי מוגבל) של עש דרב assay המנורה. כל דילול נבחנה ב- triplicates. ג,ה-DNA, DNA ריכוז לפי התגובה; Nיחסי ציבור, משכפל מספר חיובי; TP, זמן עד תוצאה חיובית היה זמין; TA, חישול הטמפרטורה; SD, סטיית תקן.
Discussion
היכולת לזהות במדויק אורגניזמים מזיקים ללא השהיית זמן מייצג היבט קריטי לניהול של המזיק מינים9,10,26. מלבד היותו מהירה, עבור מוצרי ייבוא צמחים, שיטת זיהוי המזיק אידיאלי צריך להיות פשוט לבצע באתר-כן, הכול בסדר8,26. מאמר זה מדווח על פרוטוקול assay המנורה חדשניים עבור זיהוי מהיר של עש דרב, אורגניזם חרקים הסגר לעתים קרובות שיורטו על גבולות אירופה (https://ec.europa.eu/food/sites/food/files/plant/docs/ph_biosec_europhyt _2016.pdf _annual-ח).
הרציונל מאחורי התפתחות הבדיקה ' אבחון ' היה לעצב פרוטוקול easy-to-בצע אשר יכול להתבצע במהלך ההליך בקרת הייבוא הצמח על ידי פקחי בריאות הצמח עם הכשרה מינימלית מעבדה. על מנת להפוך באתר בדיקה מהירה, פשוטה ככל האפשר, הפרוטוקול מחולק לשני חלקים, הכנת ערכת מוכנות לשימוש, הביצועים בפועל של המנורה וזמינותו. ניתן לעשות את החלק הראשון במעבדה חיצוניים כך מפקח הבריאות הצמח יכול לבצע את החילוץ הדנ א ואת וזמינותו המנורה באתר עם צעד אחד בלבד pipetting.
אבל צעד אחד בלבד, pipetting כמויות קטנות של נוזל ייתכן מאתגרת עבור משתמשים בעלי ניסיון מעבדה קטנה או לא. כדי לטפל בבעיה זו, צבע (אדום cresol) מתווסף הפתרון החילוץ כך המפעיל יכול לאשר באופן חזותי שכמות קטנה (קרי, 2.5 µL) של ה-DNA מועבר בצורה נכונה הצינור בהתאמה. פישוט חשוב אחר של הפרוטוקול הוא יישום האימות כפי הוא מקל פרשנות אמין של read-out המנורה (קובץ משלים 1).
הרומן עש נ' מנורה assay אומתה תחת מעבדה והתנאים באתר על-ידי בדיקת דגימות חרקים יירטה במהלך תהליך בקרת הייבוא רגיל של שוויץ8. בסך הכל, דגימות 80 בין שלוש היבשות אפריקה, אירואסיה, אמריקה הצפונית, נותחו על ידי מנורה. מהדוגמאות 80, היו רק שלושה (3.8%) מזוהה בטעות (false-התשלילים)8. בעת ניתוח רצפי דנ א המטרה פריימר מהדוגמאות שווא-שלילי, התברר כי הם היו חדשים haplotypes עש דרב שהיו עד כה לא תיאר8. בהתבסס על תוצאות אלו, ערכת פריימר עש דרב המנורה כבר ששונה ו בהצלחה מחדש המאומת8.
מגבלה אחת גדולה של כל DNA הגברה בשיטה המבוססת כולל מנורה היא כי הם רק לזהות מטרה מוגדרת מראש8,של רצפי דנ א27. מידע מקיף על וריאציה גנטית מצא ברצף היעד פריימר ולכן הוא חיוני כדי להבטיח דיוק האבחון8,27. אולם, מידע כזה הוא לעתים קרובות מאוד מוגבל, במיוחד במקרה של החדשים המתעוררים המזיק מינים8. אמנם נדירים, תוצאות false-שלילי נגרמת על ידי מוטציות ברצף היעד הם צפויים8. במקרה של וזמינותו עש דרב המנורה נוכח, פתרון לבעיה זו היא השילוב עם DNA barcoding מבוססי טכנולוגיה, אסטרטגיה הבין במהלך היישום של מבחן אבחון זה נמל התעופה ציריך פו8. כאן, כל מנורה-שלילי התוצאות נותחו מחדש על ידי ה-DNA barcoding ב מעבדה חיצוני8. במקרה haplotype המזיק הרומן עדיין לא תיאר הוא נתקל, תחל המנורה ניתן לשנות באמצעות רצף הדנ א המופקים תהליך barcoding8. ובכך, וכתוצאה מכך איבוד מהירות במקרה של תוצאה שלילית המנורה מפצה את דיוק מירבי אבחון הבטיחו בשני שלבים בתהליך זה8.
העלויות הגדרת עבור וזמינותו המנורה הנוכחית ב- POE הם כ 25,000 דולר. עם הגדלת מספר בדיקות מנורה פיתחה עבור נגעי צמחים (למשל, Erwinia amylovora, Flavescence dorée ו Guignardia citricarpa), השקעה חד פעמית נראה מוצדק13,15, 28. עם זאת, הפרוטוקול יכול פוטנציאלית להיות שונה כדי להפחית את עלויות אלה עוד יותר. לדוגמה, להפקת DNA שלב ב 95 ° C המיקסר תרמו המשמש כאן יכול להיות מוחלף באמבט מים פחות יקר, או על ידי ביצוע שלב זה ישירות במכשיר המנורה בזמן אמת. יתר על כן, המדרגות ערבוב על המערבולת כנראה יכול להיות מוחלף על ידי באופן ידני מצליף הצינורות, בשלב העברת הדנ א pipettor עשוי להיות מוחלף על ידי חיסון סטרילי לולאות.
באופן כללי, שיפורים עתידיים עבור זיהוי מהיר של עש ב' מינים המזיק יכול להיות יישום של גישה באתר רצף שיאפשר כדי לבצע ניתוח barcoding DNA-כן, הכול בסדר. מערכת מועמד מבטיח עבור יישום כזה היא הטכנולוגיה רצף nanopore. אכן, הטכנולוגיה לאחרונה בהצלחה יושמה במאמץ barcoding באתר ה-DNA כדי להעריך את המגוון הביולוגי של יערות הגשם8,29,30. מערכת זיהוי באתר ה-DNA barcoding יכול להחליף לחלוטין את הצורך הפיתוח של יישוב בדיקות אבחון ובדיקת שלהם. זה מאפשר גם איסוף מידע נוסף על מאפייני המזיק כגון חומרי הדברה ההתנגדות גנים8. בכל זאת, עד טכנולוגיות רצף הרומן ייושמו באופן שגרתי, וזמינותו המנורה עש דרב מייצג של רפיד (< 1 h) שיטת זיהוי מדויק.
Disclosures
הסופר מייקל אנדראו הוא מניות של מוגבלת OptiGene שמייצר ריאגנטים, כלים המשמשים במאמר זה. המחברים האחרים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים אסירי אנט Grendelmeier, אורליה Drenovac, קורנליה Studer, דניאל Frei, אליזבת רזאווי, מרקוס Oggenfuss, Seraina Vonzun של סוון מולר להשתתפות האימות של עש נ' מנורה וזמינותו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B. tabaci LAMP primer mix | OptiGene Ltd. | on request | For preparation of read-to-use B. tabaci LAMP kit |
| Centrifuge MiniSpin | Eppendorf AG | 5452000010 | For several centrifugation steps |
| Cresol red (red dye) | Sigma-Aldrich Corp. | 114472 | Component of DNA extraction solution |
| Eppendorf ThermoMixer | Eppendorf AG | 5382000015 | For DNA extraction |
| Genie II (on-site LAMP analysis device) | OptiGene Ltd. | Genie® II | For LAMP analysis |
| Genie Strips (8-tube LAMP strips) | OptiGene Ltd. | OP-0008-50 | For preparation of read-to-use B. tabaci LAMP kit |
| HotStarTaq Master Mix | Qiagen AG | 203443 | For generation of positive amplification control |
| Labcycler (Thermocycler) | SensoQuest GmbH, distributed by Witec AG |
011-103 | For DNA extraction |
| GspSSD Lyse n' Lamp Isothermal Mastermix | OptiGene Ltd. | ISO-001LNL | For preparation of read-to-use B. tabaci LAMP kit |
| Mini centrifuge Labnet Prism | Labnet International Inc. | C1801 | For several centrifugation steps |
| NucleoFast 96 PCR | Marcherey-Nagel GmbH | 743500.4 | For clean-up of positive amplification control |
| Potassium hydroxide solution | Sigma-Aldrich Corp. | 319376 | Component of DNA extraction solution |
| Qbit Fluorometer 3 | Thermo Fisher Scientific Corp. | Q33226 | For measuring DNA conentration of positive control |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | For clean-up of positive amplification control |
| Safe-Lock Tubes 0.5 mL (microcentrifuge tube) | Eppendorf AG | 0030 121.023 | For DNA extraction |
| Safe-Lock Tubes 2.0 mL (microcentrifuge tube) | Eppendorf AG | 0030 120.094 | For preparation of read-to-use B. tabaci LAMP kit |
| Wood Toothpicks | VWR International LLC | 470226-594 | For DNA extraction |
| Vortex-Genie 2 (Vortex) | Scientific Industries Inc. | SI-0236 | For several mixing steps |
References
- De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. Bemisia tabaci: a statement of species status. Annual Review of Entomology. 56, 1-19 (2011).
- Zhang, G. F., Lü, Z. C., Wan, F. H., Lövei, G. L. Real-time PCR quantification of Bemisia tabaci (Homoptera: Aleyrodidae) B-biotype remains in predator guts. Molecular Ecology Notes. 7 (6), 947-954 (2007).
- Boykin, L. M., De Barro, P. J. A practical guide to identifying members of the Bemisia tabaci species complex: and other morphologically identical species. Frontiers in Ecology and Evolution. 2, (2014).
- Cuthbertson, A. G. S., Vänninen, I. The importance of maintaining protected zone status against Bemisia tabaci. Insects. 6 (2), 432-441 (2015).
- Dalmon, A., Halkett, F., Granier, M., Delatte, H., Peterschmitt, M. Genetic structure of the invasive pest Bemisia tabaci: evidence of limited but persistent genetic differentiation in glasshouse populations. Heredity. 100 (3), 316-325 (2008).
- Dickey, A. M., Osborne, L. S., Shatters, R. G., Hall, P. A. M., Mckenzie, C. L. Population genetics of invasive Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) cryptic species in the United States based on microsatellite markers. Journal of Economic Entomology. 106 (3), 1355-1364 (2013).
- Bacon, S. J., Bacher, S., Aebi, A. Gaps in border controls are related to quarantine alien insect invasions in Europe. PLOS ONE. 7 (10), e47689 (2012).
- Blaser, S., et al. From laboratory to point of entry: development and implementation of a loop-mediated isothermal amplification (LAMP)-based genetic identification system to prevent introduction of quarantine insect species. Pest Management Science. 74 (6), 1504-1512 (2018).
- Floyd, R., Lima, J., de Waard, J., Humble, L., Hanner, R. Common goals: policy implications of DNA barcoding as a protocol for identification of arthropod pests. Biological Invasions. 12 (9), 2947-2954 (2010).
- Armstrong, K. F., Ball, S. L. DNA barcodes for biosecurity: invasive species identification. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 360 (1462), 1813-1823 (2005).
- Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research. 28 (12), E63 (2000).
- Tomlinson, J. A., Boonham, N., Dickinson, M. Development and evaluation of a one-hour DNA extraction and loop-mediated isothermal amplification assay for rapid detection of phytoplasmas. Plant Pathology. 59 (3), 465-471 (2010).
- Kogovšek, P., et al. LAMP assay and rapid sample preparation method for on-site detection of flavescence dorée phytoplasma in grapevine. Plant Pathology. 64 (2), 286-296 (2015).
- Lee, M. S., Su, T. Y., Lien, Y. Y., Sheu, S. C. The development of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays for the rapid authentication of five forbidden vegetables in strict vegetarian diets. Scientific Reports. 7, 44238 (2017).
- Bühlmann, A., et al. Erwinia amylovora loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay for rapid pathogen detection and on-site diagnosis of fire blight. Journal of Microbiological Methods. 92 (3), 332-339 (2013).
- Cavalieri, V., Manglli, A., Tiberini, A., Tomassoli, L., Rapisarda, C. Rapid identification of Trialeurodes vaporariorum, Bemisia tabaci (MEAM1 and MED) and tomato-infecting criniviruses in whiteflies and in tomato leaves by real-time reverse transcription-PCR assay. Bulletin of Insectology. 67 (2), 219-225 (2014).
- Baek, J. H., Lee, H. J., Kim, Y. H., Lim, K. J., Lee, S. H., Kim, B. J. Development of an antibody-based diagnostic method for the identification of Bemisia tabaci biotype B. Pesticide Biochemistry and Physiology. 131, 18-23 (2016).
- Hsieh, C. H., Wang, H. Y., Chen, Y. F., Ko, C. C. Loop-mediated isothermal amplification for rapid identification of biotypes B and Q of the globally invasive pest Bemisia tabaci, and studying population dynamics. Pest Management Science. 68 (8), 1206-1213 (2012).
- Rejili, M., et al. A PCR-based diagnostic assay for detecting DNA of the olive fruit fly, Bactrocera oleae, in the gut of soil-living arthropods. Bulletin of Entomological Research. 106 (5), 695-699 (2016).
- Hebert, P. D. N., Ratnasingham, S., deWaard, J. R. Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species. Proceedings. Biological Sciences. 270 (Suppl 1), 96-99 (2003).
- Ratnasingham, S., Hebert, P. D. N. bold: The Barcode of Life Data System (http://www.barcodinglife.org). Molecular Ecology Notes. 7 (3), 355-364 (2007).
- Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Bank Wheeler, D. L. G. en
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Simon, C., Frati, F., Beckenbach, A., Crespi, B., Liu, H., Flook, P. Evolution, weighting, and phylogenetic utility of mitochondrial gene sequences and a compilation of conserved polymerase chain reaction primers. Annals of the Entomological Society of America. 87 (6), 651-701 (1994).
- Simon, C., Buckley, T. R., Frati, F., Stewart, J. B., Beckenbach, A. T. Incorporating molecular evolution into phylogenetic analysis, and a new compilation of conserved polymerase chain reaction primers for animal mitochondrial DNA. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 37 (1), 545-579 (2006).
- Harper, S. J., Ward, L. I., Clover, G. R. G. Development of LAMP and real-time PCR methods for the rapid detection of Xylella fastidiosa for quarantine and field applications. Phytopathology. 100 (12), 1282-1288 (2010).
- Lauri, A., Mariani, P. O. Potentials and limitations of molecular diagnostic methods in food safety. Genes & Nutrition. 4 (1), 1-12 (2009).
- Tomlinson, J. A., et al. A loop-mediated isothermal amplification-based method for confirmation of Guignardia citricarpa in citrus black spot lesions. European Journal of Plant Pathology. 136 (2), 217-224 (2013).
- Branton, D., et al. The potential and challenges of nanopore sequencing. Nature Biotechnology. 26 (10), 1146-1153 (2008).
- Pomerantz, A., et al. Real-time DNA barcoding in a rainforest using nanopore sequencing: opportunities for rapid biodiversity assessments and local capacity building. GigaScience. 7 (4), giy033 (2018).
