Summary
Dette papir rapporter protokol for en hurtig identifikation assay for Bemisia tabaci baseret på løkke-medieret isotermisk forstærkning (lampe) teknologi. Protokollen kræver minimal laboratorium uddannelse og kan derfor gennemføres på stedet på indgangssteder for anlægget import som søhavne og lufthavne.
Abstract
Whitefly Bemisia tabaci (Gennadius) er en invasiv skadedyr af stor betydning, der berører produktionen af grøntsager og prydplanter afgrøder i mange lande rundt om i verden. Svær udbyttetab er forårsaget af direkte fodring, og endnu vigtigere, også ved fremsendelse af mere end 100 skadelige plante patogene vira. Som for andre invasive skadedyr letter øget international handel spredningen af B. tabaci til områder uden for dens naturlige spredningsområde. Inspektioner af anlæg importere produkter ved indgangssteder såsom søhavne og lufthavne er, derfor, set som en vigtig forebyggende foranstaltning. Denne sidste linje i forsvaret mod skadedyr invasioner er imidlertid kun effektiv, hvis hurtige identifikationsmetoder til mistænkelige insekt prøver er let tilgængelige. Fordi de morfologiske differentiering mellem regulerede B. tabaci og nære slægtninge uden karantæne status er vanskeligt for ikke-taksonomer, en hurtig molekylære identifikation analysen baseret på løkke-medieret isotermisk forstærkning ( LAMPE) teknologi er blevet udviklet. Denne publikation rapporter detaljerede protokollen af roman assay beskriver hurtige DNA-ekstraktion, opsætning af lampe reaktion og fortolkning af dens læse-out, som giver mulighed for at identificere B. tabaci prøver inden for en time. I forhold til eksisterende protokoller til påvisning af specifikke B. tabaci biotypes, udviklede metoden henvender sig til hele B. tabaci arter kompleks i én analyse. Desuden er assayet designet til at blive anvendt på stedet af plante sundhed inspektører med minimal laboratorium uddannelse direkte ved indgangssteder. Grundig validering udføres i henhold til laboratorieundersøgelser og stedets betingelser viser, at de rapporterede lampe assay er en hurtig og pålidelig identifikation værktøj, forbedring af forvaltningen af B. tabaci.
Introduction
Whitefly Bemisia tabaci (Gennadius) er en invasiv insekt skadedyr, der påvirker udbyttet af mange økonomisk vigtige afgrøder herunder prydplanter, grønt, bælgplanter og bomuld1,2. Ved siden af skader gennem direkte phloem-fodring, skader arternes homopteran planter indirekte ved udskillelse af store mængder af honningdug på overflader af blade og frugter samt ved fremsendelse af talrige plante patogene vira1 , 3 , 4. seneste genetiske undersøgelser sammenligne DNA-sekvenser af mitokondrie gen cytokrom c oxidase 1 (COI) viste, at B. tabaci en art komplekse mindst 34 morphocryptic arter3,4. To meget invasive og skadelige medlemmer inden for dette komplekse, biotype B stammer fra Mellemøsten og asiatiske mindre regionen, samt biotype Q stammer fra Middelhavsområdet, har været spredt globalt gennem international handel aktiviteter med vegetabilske produkter, især ved transport af prydplanter1,5,6. På grund af sin status som verdensomspændende pest, den internationale Union for bevarelse af naturen og naturressourcerne (IUCN) opført B. tabaci som et af "verdens 100 værste invasive fremmede arter" og medlemmer af de komplekse arter er reguleret organismer af mange lande1,3,4.
I den Europæiske Union (EU), er B. tabaci anført i den plante sundhed direktiv 2000/29/EF bilag 1AI som en karantæne organisme hvis indførsel fra lande uden for EU og dens udbredelse inden for EU er forbudt4. En væsentlig forebyggende foranstaltning mod spredning af karantæne organismer er inspektion af plante forsendelser ved indgangssteder (POEs) såsom lufthavne og søhavne7,8. I tilfældet findes en karantæne organisme, nationale Plant Protection organisation (NPPO) i afgift tager handling af enten afvise eller behandling (herunder tilintetgørelse) af angrebne leverance9. Officerer inspicerer importen ofte har dog ikke den taksonomiske ekspertise til præcist at identificere det omfattende udvalg af skadedyr arter tilknyttet verdenshandelen9. Især identifikation af umodne livsstadier (fx æg og larver) uden særskilt morfologiske nøgler er stort set umuligt for ikke-taksonomer8,9,10. Hen til muliggøre gennemførelsen af karantæneforanstaltninger med minimal forsinkelse, er der derfor behov for alternative, hurtig on-site identifikation assays9.
En kandidat metode er den loop-medieret isotermisk DNA amplifikation (lampe) teknologi, der har for nylig vist sig at være en egnet teknologi til identifikation af anlægget patogener11,12,13. LAMPEN er meget specifikke, fordi metoden anvender mindst to primer par anerkender seks forskellige DNA target sekvenser14. På grund af DNA strand forskydning aktiviteten af Bst DNA polymerase udføres lampe reaktioner under isotermiske forhold14. Derfor, i modsætning til konventionelle Polymerasekædereaktionen (PCR)-baseret assays der er ikke behov for en termisk cycler13,14. En anden fordel i forhold til PCR-baserede analyser er dens modstandsdygtighed mod potentielle hæmmere i DNA-ekstrakt, omgå behovet for et DNA oprensning trin13. På grund af protokollens hastighed og enkelhed, kan LAMPEN selv udføres on-site betingelser ved hjælp af en bærbar, batteri drevet real-time opdagelse enhed8,15.
En lampe analyse blev designet som reaktion på kravet om en hurtig on-site identifikationsmetode for B. tabaci8. Det overordnede formål var at udvikle en protokol, der kan udføres af plante sundhed inspektører med begrænset laboratorium uddannelse. Et stærkt fokus var, derfor indstillet på at optimere hastighed og enkelhed af protokollen. Mens eksisterende diagnostiske tests er generelt blevet udviklet til identifikation af en eller flere biotypes af B. tabaci, Roman lampe analysen dækker hele B. tabaci arter komplekse8,16,17 ,18. Udtalt genetiske inden for-systematisk mangfoldighed af komplekset blev løst ved hjælp af kombinationer af forskellige primer sæt og anvendelsen af degenereret primere8. Roman B. tabaci lampe assay er designet på en sådan måde, at primere målrette et fragment i 3'-slutningen af mitokondrie COI gen8. Dette gen præsenterer et passende mål for animalske diagnostiske undersøgelser, fordi det havne regioner bevares nok til at sikre diagnostiske følsomhed for en bestemt art, under diskriminerer nok mellem nært beslægtede organismer19, 20. Desuden COI gen bruges ofte som en genetiske markør i befolkningen genetiske undersøgelser samt en signatur sekvens i DNA barcoding analyser, resulterer i adskillige DNA sekvens poster i open source-databaser såsom GenBank og fed21 ,22. Ved siden af de offentligt tilgængelige oplysninger om Oprindelseslande sekvenser fra B. tabaci, COI sekvenser fra nært beslægtede arter (Aleurocanthus spp. [N = 2], Aleurochiton aceris, Aleurodicus dugesii, Bemisia spp. [N = 3], Neomaskellia andropogonis, Tetraleurodes acaciaeog Trialeurodes spp. [N = 4]) blev inkluderet i primer design af denne undersøgelse og bruges til at vurdere diagnostiske sensitivitet og specificitet i siliciummangan8 .
På grund af nøjagtigheden af metoden, dens hastighed (< 1 h) og enkelheden i protokollen, analysen har vist at være velegnet til on-site ansøgning når implementeret som en del af proceduren for import på en schweizisk POE8.
Protocol
1. præparater
- Forberede delprøver af alkalisk DNA ekstraktionsopløsning.
- Producere en bestand af alkalisk DNA ekstraktionsopløsning ved hjælp af vand af Molekylær renhed suppleret med 600 µM kaliumhydroxid (KOH) og 2 µM Cresol rød.
Forsigtig: KOH er en stærk base opløst i vand. Undgå spild, og hud- og øjenkontakt. - Undvære 30 µL alkalisk DNA ekstraktionsopløsning (udarbejdet i trin 1.1.1) i 0,5 mL microcentrifuge rør og gemme alikvoter ved 4 ° C.
Bemærk: Brug aliquoted DNA udvinding løsning inden for 1 år.
- Producere en bestand af alkalisk DNA ekstraktionsopløsning ved hjælp af vand af Molekylær renhed suppleret med 600 µM kaliumhydroxid (KOH) og 2 µM Cresol rød.
- Forberede B. tabaci positiv forstærkning kontrol (PAC).
- Generere PCR-amplikoner af lampe target DNA-fragment.
Bemærk: En introduktion til almindelige PCR principper og praksis er givet ved Lorenz23.- Syntetisere eller opnå primere C1-Jørgensen-2195 (5'-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3') og TL2-N-3014 (5'-TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA-3 ') forstærke et fragment af mitokondrie COI gen24,25.
- Opsætning af PCR reaktion som beskrevet i tabel 1. Bruge DNA ekstrakt (Se trin 2.1) af en reference B. tabaci modellen som DNA skabelon.
Bemærk: Hvis det ønskes, det er muligt at udtrække B. tabaci DNA for PAC ved hjælp af en kommerciel kit ifølge producentens anvisninger. - Programmere en termisk cycler ved hjælp af følgende betingelser: 15 min. ved 95 ° C; 45 cyklusser af 40 s ved 95 ° C, 15 s på 45 ° C, ramping over 60 s til 60 ° C, 2 min. ved 72 ° C; 7 min. ved 72 ° C; hold ved 4 ° C.
- Ren PCR forstærkning produktet ved hjælp af en kommerciel PCR oprydning kit efter producentens protokol og elueres slutproduktet i vand af Molekylær renhed.
- Brug en kommerciel kit med DNA-intercalating farvestof til at måle DNA koncentrationen af PCR forstærkning produkt efter producentens anvisninger og fortyndes med vand af Molekylær renhed til en koncentration af 1 ng / µL. Opbevar den fortyndede PCR-amplifikation produkt som PAC stamopløsning ved-20 ° C.
Bemærk: Brug PAC stamopløsning inden for 1 år. - Supplere PAC stamopløsningen (udarbejdet i trin 1.2.1.5) med 0,6 µM KOH og fortyndes med vand af Molekylær renhed til en koncentration på 5 x 10-3 ng / µL. Store produkt ved 4 ° C.
Bemærk: Brug PAC inden for 5 h for udarbejdelsen af en klar-til-brug B. tabaci lampe kits beskrevet i næste trin.
- Generere PCR-amplikoner af lampe target DNA-fragment.
-
Forbereder klar-til-brug B. tabaci lampe kit (protokol for 20 enheder)
- Brug saks til at klippe 8-tube lampe strimler i to 4-tube lampe strimler.
- Label rør af 4-tube lampe strimler efter den ordning, der er vist i figur 1.
- Forberede B. tabaci lampe reaktion mastermix (protokol for 80 reaktioner).
- Tilføj 1195.1 µL af klar-til-brug GspSSD isotermisk master mix (indeholdende GspSSD polymerase, pyrophosphatase, magnesium-sulfat, deoxynucleotides, dobbeltstrenget bindende DNA bindende farvestof) og 717.4 µL af B. tabaci lampe primer blandes til en 2 mL microcentrifuge rør. Kort vortex og puls centrifuge.
- Dispensere 22,5 µL af B. tabaci lampe reaktion mastermix (udarbejdet i trin 1.3.3.1) i hver tube 4-tube lampe strimler (forberedt i trin 1.3.1) og puls centrifuge.
- Vortex B. tabaci lampe PAC (udarbejdet i trin 1.2) hurtigt og puls centrifugeres. Tilføj derefter 2,5 µL ind i røret, mærket med "PAC" af hver 4-tube lampe strimmel (figur 1).
- Tæt låg og opmagasinere klar-til-brugen B. tabaci lampe kit enheder ved-20 ° C.
Bemærk: Brug dem inden for 1 år.
2. ejendommen lampe analyse
- DNA-ekstraktion
- Brug sterile tandstikkere at overføre insekt enhederne i 0,5 mL microcentrifuge-rør indeholdende 30 µL DNA ekstraktionsopløsning (udarbejdet i trin 1.1.2).
Bemærk: Sørg for, at insekterne er nedsænket i ekstraktionsopløsningen. - Inkuber prøver for 5 min. ved 95 ° C i en thermomixer (300 rpm). Kort vortex og puls centrifuge.
- Brug sterile tandstikkere at overføre insekt enhederne i 0,5 mL microcentrifuge-rør indeholdende 30 µL DNA ekstraktionsopløsning (udarbejdet i trin 1.1.2).
-
B. tabaci lampe assay
- Tø en klar-til-brug B. tabaci lampe kit forberedt i trin 1.3. Vortex hurtigt og puls centrifuge.
Bemærk: Med hvert sæt er det enten muligt at afprøve to forskellige enheder eller at analysere DNA-ekstrakt af en model i to eksemplarer. - Tilføje 2,5 µL DNA prøveekstrakt (udarbejdet i trin 2.1) i rør mærket "S1" og "S2" af klar-til-brugen B. tabaci lampe kit (figur 1).
- Tilføje 2,5 µL af ren alkalisk DNA ekstraktionsopløsning (udarbejdet i afsnit 1.1) ind i røret, mærket "NAC" for kontrolelementet negativ forstærkning (figur 1).
- Vortex af klar-til-brug B. tabaci lampe kit hurtigt og puls centrifuge.
- Indsæt klar-til-brug B. tabaci lampe kits til lampe analyse enhed (med real-time fluorescens målingen) eller en real-time PCR platform og udføre en isotermisk DNA amplifikation analyse ved 65 ° C til 60 min.
- Måling af DNA amplifikation produkter smeltende temperatur ved opvarmning op til 98 ° C med en efterfølgende afkøling trin (rampe rate på 0,05 ° C/s) til 75 ° C, mens måling fluorescens i realtid.
- Tø en klar-til-brug B. tabaci lampe kit forberedt i trin 1.3. Vortex hurtigt og puls centrifuge.
- LAMPE assay udlæsning
- Validere lampe udlæsning manuelt som følger.
- Hvis DNA klarlægger blev målt til prøven og PAC, ingen DNA amplifikation blev målt for NAC, og den udgloedning temperatur af forstærkning produkter var mellem 80.0 og 85,5 ° C, overveje lampe resultater som POSITIVE (figur 2).
- Hvis der er ingen DNA amplifikation prøverne (dvs. rør mærket S1 og S2) men for PAC og NAC derefter overveje lampe resultatet som negativ (figur 2).
- Hvis DNA amplifikation blev målt til prøver, men de udgloedning temperaturer på tilsvarende forstærkning produkter var uden for rækkevidde 80.0 \u2012 85,5 ° C, PAC gav ingen DNA amplifikation eller NAC gav en DNA amplifikation, overveje lampe resultatet som UGYLDIG (figur 2).
- Valgfrit, validere lampe udlæsning ved hjælp af programmet lampe validering (supplerende fil 1).
- Definere målarter og definere antallet af testede prøver. Klik på knappen "generere rapport" .
- Overføre den læse-out (DNA amplifikation ja/nej, udglødning temperatur forstærkning produkt, resultater af PAC og NAC) fra on-site lampe analyse enhed eller real-time PCR platform til de tilsvarende input felter i programmet validering. Resultatet af validering vises umiddelbart efter indtastning af data.
- Validere lampe udlæsning manuelt som følger.
Representative Results
Under validering af B. tabaci lampe assay var insekt prøver opsnappet i løbet af de regelmæssige schweiziske importprocessen, som kontrol analyseret8. Enhederne stammer fra otte forskellige lande (de Kanariske Øer, den Dominikanske Republik, Israel, Malaysia, Marokko, Singapore, Thailand og Vietnam) og afspejler den genetiske mangfoldighed af B. tabaci fundet på europæiske POEs8. Alle lampe resultater var cross-valideret af DNA barcoding8.
Fra i alt 80 prøver analyseret af lampe, 75 eksemplarer (93.8%) blev korrekt identificeret som B. tabaci (true-positiver), to eksemplarer (2,5%) blev korrekt identificeret som ikke værende B. tabaci (true-negativer), og tre prøveemner (3,8%) var fejlagtigt identificeret som ikke- B. tabaci (false-negativer) (tabel 2)8. De rette negative resultater stammer fra to Trialeurodes vaporariorum eksemplarer, en ikke-regulerede arter i høj risiko må forveksles med B. tabaci på POEs for vegetabilske produkter8. Baseret på disse resultater, følgende målinger af diagnostisk nøjagtighed blev beregnet: teste specificitet (true-negativ sats), 100%; teste følsomhed (true-positive sats), 96.2%; teste effektiviteten (procentdel af korrekte testresultater), 96,3% (tabel 2)8. Ved vurderingen af den analytiske sensitivitet (detektionsgrænsen), forstærket B. tabaci lampe assay med held prøve DNA fortyndet til 100 fg/µL på tværs af tre tekniske flergangsbestemmelser (tabel 3).
En delmængde af assays (N = 13) blev udført på stedet betingelser på Swiss POE Zürich Airport plante sundhed inspektører ved hjælp af klar-til-brug B. tabaci lampe kits8. Når cross-valideret i referencelaboratoriet, alle resultater fra hotellets test blev fundet for at være korrekte (test effektivitet = 100%)8. Vurdering på stedet lampe assay ydeevne, var den gennemsnitlige tid til positive (tid indtil en positive resultater forelå) 38,4 ± 10,3 min (gennemsnit ± standardafvigelse)8. En repræsentativ DNA amplifikation plot og den tilsvarende udgloedning afledte fra en B. tabaci lampe analyse udføres i henhold til stedets betingelser er vist i figur 3A og B. I dette eksempel prøve et og to blev korrekt identificeret som B. tabaci angivet ved DNA amplifikation efter ca 30 min (figur 3A) sammen med de forventede udgloedning temperaturer på ca 82 ° C (figur 3B).
Figur 1: visualisering af eksperimenterende set-up af en klar-til-brug B. tabaci lampe kit beskrevet i protokollen. S1, prøve 1; S2, prøve 2; PAC, positiv forstærkning kontrol; NAC, negativ forstærkning kontrol. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: lampe udlæsning validering skema. PAC: positiv forstærkning kontrol; IAK: negativ forstærkning kontrol. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: DNA amplifikation plot (A) og udglødning derivat (B) af en B. tabaci lampe analyse udføres i henhold til stedets betingelser. Fluorescens blev målt i relativ intensitet enheder. Grønne linje, prøve 1; orange linie, prøve 2; blå linje, negativ forstærkning kontrol (NAC); rød streg, positiv forstærkning kontrol (PAC). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Komponent | Bestanden koncentreret | Endelige reaktion koncentreret | Volumen pr. reaktion |
| Taq-Polymerase Master Mix | 2 x | 1 x | 10 ΜL |
| Primer C1-Jørgensen-2195 | 20 ΜM | 0,4 ΜM | 0,4 ΜL |
| Primer TL2-N-3014 | 20 ΜM | 0,4 ΜM | 0,4 ΜL |
| Vand af Molekylær renhed | - | - | 8.2 ΜL |
| DNA-skabelon | - | - | 1 ΜL |
Tabel 1: forberedelse af PCR reaktion mastermix for den B. tabaci positiv forstærkning kontrol. Komponenter og koncentrationer, der er nødvendige for at etablere en PCR reaktion. Den endelige reaktion volumen er 20 µL. Primer sekvenser er vist i 1.2.1.1.
| N | NTP | NFP | NTN | NFN | SEN (%) | SPE (%) | EFF (%) |
| 80 | 75 | 0 | 2 | 3 | 96.2 | 100 | 96,3 |
Tabel 2: Resultater af B. tabaci LAMPE assay validering. Nielsen, antallet af analyser; NTP, antallet af sandt positive resultater; NFP, antallet af falsk-positive resultater; NTN, antallet af sand-negative resultater; NFN, antal falsk negative resultater; SEN, diagnostiske følsomhed; SPE, diagnostisk specificitet, EFF, teste effektiviteten.
| CDNA (fg/µL) | NPR |
TP (min) (mener ± SD) |
TA (° C) (mener ± SD) |
| 1 x 105 | 3 | 33,5 ± 2.9 | 81.3 ± 0,1 |
| 1 x 104 | 3 | 30,7 ± 1.1 | 81 ± 0,0 |
| 1 x 103 | 3 | 40.4 ± 3,9 | 81,1 ± 0,1 |
| 1 x 102 | 3 | 50,7 ± 1.6 | 81,1 ±0.1 |
| 1 x 101 | 0 | - | - |
| 1 x 100 | 0 | - | - |
Tabel 3: analytiske følsomhed (detektionsgrænsen) af den B. tabaci lampe assay. Hver fortynding blev testet i tre. CDNA, DNA koncentration pr. reaktion; NPR, antallet af positive replikater; TP, indtil der forelå et positivt resultat; TA, udglødning temperatur; SD, standard afvigelse.
Discussion
Evnen til at identificere potentielt skadelige organismer uden tidsforsinkelse repræsenterer et kritisk aspekt for forvaltningen af skadedyr arter9,10,26. Udover at være hurtig, for import planteprodukter, bør en ideel skadedyr identifikationsmetode være enkle at udføre onsite på POEs8,26. Dette papir rapporterer en roman lampe assay til hurtig identifikation af B. tabaci, en karantæne insekt organisme ofte opsnappet ved EU 's grænser (https://ec.europa.eu/food/sites/food/files/plant/docs/ph_biosec_europhyt-protokollen _annual-rapport _2016.pdf).
Rationalet bag udviklingen af den diagnostiske test var at designe en let at følge protokollen, som kan udføres under den plante procedure for import af plante sundhed inspektører med minimal laboratorium uddannelse. For at gøre onsite test som hurtige og enkle som muligt, er protokollen opdelt i to dele, udarbejdelse af en klar-til-brug kit og selve udførelsen af LAMPEN assay. Den første del kan foretages i et eksternt laboratorium, således at plante sundhed inspektør kan udføre DNA-ekstraktion og lampe assay on-site med kun én pipettering trin.
Selv om kun ét trin, pipettering små mængder af væske kan være udfordrende for brugere med ringe eller ingen laboratorium erfaring. For at løse dette problem, tilføjes et farvestof (cresol rød) ekstraktionsopløsningen således at operatøren kan visuelt bekræfte den lille mængde (dvs. 2,5 µL) af DNA er korrekt overført til den respektive tube. En anden vigtig forenkling af protokollen er programmet validering som det letter en pålidelig fortolkning af lampe udlæsning (supplerende fil 1).
Roman B. tabaci lampe assay er blevet valideret laboratorieundersøgelser og stedets betingelser ved at teste insekt prøver opfanges under regelmæssig kontrol-importen af Schweiz8. I alt blev 80 enheder fra tre kontinenter, Afrika, Eurasien og Nordamerika, analyseret af lampe. Af de 80 enheder var kun tre (3,8%) fejlagtigt identificeret (false-negativer)8. Når du analyserer primer target DNA-sekvenser af falsk negative prøver, konstateredes det, at de var nye B. tabaci haplotypes, der ikke hidtil har været beskrevet8. Baseret på disse resultater, har B. tabaci lampe primer sæt været modificeret og med succes re validerede8.
En stor begrænsning af enhver DNA amplifikation-baseret metode herunder lampe er, at de kun betegner foruddefinerede mål DNA sekvenser8,27. En omfattende viden om den genetiske variation fundet i primer target sekvens er derfor afgørende at sikre diagnostiske nøjagtighed8,27. Sådanne oplysninger er dog ofte meget begrænset, især i forbindelse med nyopstået skadedyr arter8. Selvom sjælden, er falsk negative resultater skyldes mutationer i target sekvens forventede8. I forbindelse med den nuværende B. tabaci lampe assay er en løsning på dette problem en kombination med en DNA barcoding-baseret teknologi, en strategi, der er realiseret i forbindelse med gennemførelsen af denne diagnostiske test på POE Zürich lufthavn8. Her, alle lampe-negative resultater var re-analyseres af DNA barcoding i et eksternt laboratorium8. I tilfælde af en roman skadedyrsbekæmpelse haplotype endnu ikke beskrevet er stødt på, kan lampe primere ændres ved hjælp af DNA-sekvens genereret i stregkodesystem proces8. Dermed, der det deraf følgende tab af hastighed i tilfælde af et negativt resultat af lampe kompenseres for den maksimale diagnostisk nøjagtighed sikres i denne to-trins proces8.
De nuværende lampe analysen på en POE opstartsomkostningerne er cirka USD 25.000. Med det stigende antal lampe test udviklet til plante skadedyr (fx Erwinia amylovora, Flavescence dorée og Guignardia citricarpa), sådan en engangsinvestering vises begrundede13,15, 28. imidlertid protokollen kunne potentielt blive ændret for at reducere disse omkostninger endnu mere. For eksempel, for DNA-ekstraktion kunne trin ved 95 ° C thermo mixer brugt her blive erstattet af en billigere vandbad, eller ved at udføre dette trin direkte i realtid lampe enhed. Derudover blanding trinene på vortex kunne sandsynligvis blive erstattet af manuelt svippede rør, og i DNA overførsel skridt pipette kan erstattes af sterile podning sløjfer.
Fremtidige forbedringer til en hurtig identifikation af B. tabaci og skadedyr arter kunne i almindelighed være en gennemførelse af en on-site sekventering tilgang, der gør det muligt for at udføre DNA barcoding analyser på POEs. En lovende kandidat system for sådan en gennemførelse er nanopore sekventering teknologi. Faktisk, teknologien har for nylig været med succes gennemført i et on-site DNA barcoding forsøg til vurdering af biodiversiteten i en regnskov8,29,30. En on-site DNA barcoding identifikationssystem kan helt erstatte behovet for udvikling af målrettede diagnostiske test og deres validering. Det giver også mulighed for, at indsamle yderligere oplysninger om pest karakteristika såsom pesticider resistens gener8. Ikke desto mindre, indtil romanen sekventering teknologier gennemføres rutinemæssigt, B. tabaci lampe analysen repræsenterer en hurtig (< 1 h) og nøjagtig identifikationsmetode.
Disclosures
Forfatteren Michael Andreou er aktionær i OptiGene Limited, der producerer reagenser og instrumenter, der anvendes i denne artikel. Andre forfattere har intet at videregive.
Acknowledgments
Forfatterne er Annette Grendelmeier, Aurelia Drenovac, Cornelia Studer, Daniel Frei, Elisabeth Razavi, Markus Oggenfuss, Seraina Vonzun og Sven Moeller taknemmelig for at deltage i validering af B. tabaci lampe assay.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B. tabaci LAMP primer mix | OptiGene Ltd. | on request | For preparation of read-to-use B. tabaci LAMP kit |
| Centrifuge MiniSpin | Eppendorf AG | 5452000010 | For several centrifugation steps |
| Cresol red (red dye) | Sigma-Aldrich Corp. | 114472 | Component of DNA extraction solution |
| Eppendorf ThermoMixer | Eppendorf AG | 5382000015 | For DNA extraction |
| Genie II (on-site LAMP analysis device) | OptiGene Ltd. | Genie® II | For LAMP analysis |
| Genie Strips (8-tube LAMP strips) | OptiGene Ltd. | OP-0008-50 | For preparation of read-to-use B. tabaci LAMP kit |
| HotStarTaq Master Mix | Qiagen AG | 203443 | For generation of positive amplification control |
| Labcycler (Thermocycler) | SensoQuest GmbH, distributed by Witec AG |
011-103 | For DNA extraction |
| GspSSD Lyse n' Lamp Isothermal Mastermix | OptiGene Ltd. | ISO-001LNL | For preparation of read-to-use B. tabaci LAMP kit |
| Mini centrifuge Labnet Prism | Labnet International Inc. | C1801 | For several centrifugation steps |
| NucleoFast 96 PCR | Marcherey-Nagel GmbH | 743500.4 | For clean-up of positive amplification control |
| Potassium hydroxide solution | Sigma-Aldrich Corp. | 319376 | Component of DNA extraction solution |
| Qbit Fluorometer 3 | Thermo Fisher Scientific Corp. | Q33226 | For measuring DNA conentration of positive control |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | For clean-up of positive amplification control |
| Safe-Lock Tubes 0.5 mL (microcentrifuge tube) | Eppendorf AG | 0030 121.023 | For DNA extraction |
| Safe-Lock Tubes 2.0 mL (microcentrifuge tube) | Eppendorf AG | 0030 120.094 | For preparation of read-to-use B. tabaci LAMP kit |
| Wood Toothpicks | VWR International LLC | 470226-594 | For DNA extraction |
| Vortex-Genie 2 (Vortex) | Scientific Industries Inc. | SI-0236 | For several mixing steps |
References
- De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. Bemisia tabaci: a statement of species status. Annual Review of Entomology. 56, 1-19 (2011).
- Zhang, G. F., Lü, Z. C., Wan, F. H., Lövei, G. L. Real-time PCR quantification of Bemisia tabaci (Homoptera: Aleyrodidae) B-biotype remains in predator guts. Molecular Ecology Notes. 7 (6), 947-954 (2007).
- Boykin, L. M., De Barro, P. J. A practical guide to identifying members of the Bemisia tabaci species complex: and other morphologically identical species. Frontiers in Ecology and Evolution. 2, (2014).
- Cuthbertson, A. G. S., Vänninen, I. The importance of maintaining protected zone status against Bemisia tabaci. Insects. 6 (2), 432-441 (2015).
- Dalmon, A., Halkett, F., Granier, M., Delatte, H., Peterschmitt, M. Genetic structure of the invasive pest Bemisia tabaci: evidence of limited but persistent genetic differentiation in glasshouse populations. Heredity. 100 (3), 316-325 (2008).
- Dickey, A. M., Osborne, L. S., Shatters, R. G., Hall, P. A. M., Mckenzie, C. L. Population genetics of invasive Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) cryptic species in the United States based on microsatellite markers. Journal of Economic Entomology. 106 (3), 1355-1364 (2013).
- Bacon, S. J., Bacher, S., Aebi, A. Gaps in border controls are related to quarantine alien insect invasions in Europe. PLOS ONE. 7 (10), e47689 (2012).
- Blaser, S., et al. From laboratory to point of entry: development and implementation of a loop-mediated isothermal amplification (LAMP)-based genetic identification system to prevent introduction of quarantine insect species. Pest Management Science. 74 (6), 1504-1512 (2018).
- Floyd, R., Lima, J., de Waard, J., Humble, L., Hanner, R. Common goals: policy implications of DNA barcoding as a protocol for identification of arthropod pests. Biological Invasions. 12 (9), 2947-2954 (2010).
- Armstrong, K. F., Ball, S. L. DNA barcodes for biosecurity: invasive species identification. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 360 (1462), 1813-1823 (2005).
- Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research. 28 (12), E63 (2000).
- Tomlinson, J. A., Boonham, N., Dickinson, M. Development and evaluation of a one-hour DNA extraction and loop-mediated isothermal amplification assay for rapid detection of phytoplasmas. Plant Pathology. 59 (3), 465-471 (2010).
- Kogovšek, P., et al. LAMP assay and rapid sample preparation method for on-site detection of flavescence dorée phytoplasma in grapevine. Plant Pathology. 64 (2), 286-296 (2015).
- Lee, M. S., Su, T. Y., Lien, Y. Y., Sheu, S. C. The development of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays for the rapid authentication of five forbidden vegetables in strict vegetarian diets. Scientific Reports. 7, 44238 (2017).
- Bühlmann, A., et al. Erwinia amylovora loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay for rapid pathogen detection and on-site diagnosis of fire blight. Journal of Microbiological Methods. 92 (3), 332-339 (2013).
- Cavalieri, V., Manglli, A., Tiberini, A., Tomassoli, L., Rapisarda, C. Rapid identification of Trialeurodes vaporariorum, Bemisia tabaci (MEAM1 and MED) and tomato-infecting criniviruses in whiteflies and in tomato leaves by real-time reverse transcription-PCR assay. Bulletin of Insectology. 67 (2), 219-225 (2014).
- Baek, J. H., Lee, H. J., Kim, Y. H., Lim, K. J., Lee, S. H., Kim, B. J. Development of an antibody-based diagnostic method for the identification of Bemisia tabaci biotype B. Pesticide Biochemistry and Physiology. 131, 18-23 (2016).
- Hsieh, C. H., Wang, H. Y., Chen, Y. F., Ko, C. C. Loop-mediated isothermal amplification for rapid identification of biotypes B and Q of the globally invasive pest Bemisia tabaci, and studying population dynamics. Pest Management Science. 68 (8), 1206-1213 (2012).
- Rejili, M., et al. A PCR-based diagnostic assay for detecting DNA of the olive fruit fly, Bactrocera oleae, in the gut of soil-living arthropods. Bulletin of Entomological Research. 106 (5), 695-699 (2016).
- Hebert, P. D. N., Ratnasingham, S., deWaard, J. R. Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species. Proceedings. Biological Sciences. 270 (Suppl 1), 96-99 (2003).
- Ratnasingham, S., Hebert, P. D. N. bold: The Barcode of Life Data System (http://www.barcodinglife.org). Molecular Ecology Notes. 7 (3), 355-364 (2007).
- Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Bank Wheeler, D. L. G. en
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Simon, C., Frati, F., Beckenbach, A., Crespi, B., Liu, H., Flook, P. Evolution, weighting, and phylogenetic utility of mitochondrial gene sequences and a compilation of conserved polymerase chain reaction primers. Annals of the Entomological Society of America. 87 (6), 651-701 (1994).
- Simon, C., Buckley, T. R., Frati, F., Stewart, J. B., Beckenbach, A. T. Incorporating molecular evolution into phylogenetic analysis, and a new compilation of conserved polymerase chain reaction primers for animal mitochondrial DNA. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 37 (1), 545-579 (2006).
- Harper, S. J., Ward, L. I., Clover, G. R. G. Development of LAMP and real-time PCR methods for the rapid detection of Xylella fastidiosa for quarantine and field applications. Phytopathology. 100 (12), 1282-1288 (2010).
- Lauri, A., Mariani, P. O. Potentials and limitations of molecular diagnostic methods in food safety. Genes & Nutrition. 4 (1), 1-12 (2009).
- Tomlinson, J. A., et al. A loop-mediated isothermal amplification-based method for confirmation of Guignardia citricarpa in citrus black spot lesions. European Journal of Plant Pathology. 136 (2), 217-224 (2013).
- Branton, D., et al. The potential and challenges of nanopore sequencing. Nature Biotechnology. 26 (10), 1146-1153 (2008).
- Pomerantz, A., et al. Real-time DNA barcoding in a rainforest using nanopore sequencing: opportunities for rapid biodiversity assessments and local capacity building. GigaScience. 7 (4), giy033 (2018).
