Summary
Этот документ сообщает протокол для быстрой идентификации assay для Bemisia tabaci на основе технологии цикла опосредованной изотермической амплификация (лампа). Протокол требует минимальной Лаборатория обучения и может таким образом, осуществляться на месте в пунктах въезда для растений импорта таких, как морские порты и аэропорты.
Abstract
Белокрылка Bemisia tabaci (Геннадий) является инвазивным вредителей большое значение, затрагивающие производство овощных и декоративных культур, во многих странах мира. Тяжелой урожайности, вызванных прямым кормления и даже более важно, также передачи патогенных вирусов более чем 100 вредных растений. Что касается других инвазивных вредителей расширение международной торговли облегчает разгон B. tabaci в районы за пределами своей родной диапазон. Инспекции завода импорта товаров в пунктах въезда, таких, как морские порты и аэропорты следовательно, рассматривать как меру важные предупреждения. Однако эта последняя линия обороны против нашествия вредителей эффективен только если методы быстрой идентификации подозрительных насекомых образцов легко доступны. Потому что трудно для не систематиков, быстрое молекулярной идентификации анализа на основе цикла опосредованной изотермической амплификация (морфологические различия между регулируемых B. tabaci и близких родственников без карантина статуса Была разработана технология лампа). Эта публикация докладов подробный протокол Роман пробирного описывая быстрого экстракции ДНК, настройки LAMP реакции, а также толкование его считывания, которая позволяет идентифицировать B. tabaci образцов в течение одного часа. По сравнению с существующими протоколами для обнаружения конкретных B. tabaci биотипов, разработанный метод целей всей B. tabaci видов комплекс в одном assay. Кроме того assay призван применяться на местах инспекторами здоровья растений с минимальным лабораторных занятий непосредственно в пунктах въезда. Тщательной проверки выполняются в лаборатории и на месте условиях показывает, что сообщил assay лампа инструмент быстрой и надежной идентификации, улучшение управления B. tabaci.
Introduction
Белокрылка Bemisia tabaci (Геннадий) является инвазивным насекомых, влияющих на урожайность многих экономически важных сельскохозяйственных культур, включая декоративных растений, овощей, зернобобовых и хлопок1,2. Помимо ущерба путем прямого флоэма кормления homopteran видов наносит вред растений косвенно выделение большого количества нектар на поверхности листьев и плодов, а также передачи многочисленных патогенных вирусов растений1 , 3 , 4. Недавние генетические исследования, сравнивающие последовательностей ДНК митохондриальной гена цитохрома-оксидазы c 1 (COI) показал, что б tabaci вид комплекса по меньшей мере 34 morphocryptic видов3,4. Два очень инвазивных и разрушительных членов в рамках этого комплекса, биотипа B возникая от Ближнего Востока и Азии незначительные региона, а также биотипа Q возникая от средиземноморского региона, были разогнаны глобально через международной торговли деятельность с растений, особенно на транспорте декоративных1,5,6. Из-за своего статуса во всем мире Пешт Международного союза охраны природы и природных ресурсов (МСОП) перечислены B. tabaci как один из «мира 100 худших инвазивные чужеродные виды» и членов комплекс видов являются регулируемых организмов Многие страны1,3,4.
В Европейский союз (ЕС), б. tabaci указана в 1АИ завод здравоохранения Директивой 2000/29/EC приложение как организм карантина, чьи введение из стран-нечленов ЕС и ее распространения в рамках ЕС запретил4. Основные предупреждения мерой против распространения карантинных организмов является инспекции растений грузов в пунктах въезда (ПГС), такие как аэропорты и морские порты7,8. В случае находится организм карантина, Национальная организация защиты растений (NPPO) в заряд принимает меры отказа или лечения (включая уничтожение) зараженных отгрузки9. Однако офицеров, проверки импорта часто не имеют таксономических опыта, чтобы точно определить широкий спектр видов вредителей, связанные с глобальной торговли9. Особенности идентификации этапов незрелых жизни (например, яйца и личинки) без различных морфологических ключей для не систематиков8,9,10практически невозможно. Следовательно чтобы включить осуществление карантинных мер с минимальной задержкой, существует потребность в альтернативных, быстрое на месте идентификации анализов9.
Кандидат метод является петля опосредованной изотермический ДНК амплификации (лампа) технология, которая недавно было показано, чтобы быть подходящей технологии для выявления растений патогенов11,12,13. ЛАМПА является весьма специфическим, потому, что метод использует по крайней мере две пары праймера, признавая шесть различных ДНК целевой последовательности14. Благодаря деятельности перемещения нити ДНК полимеразы дна Bst лампа реакции выполняются при изотермических условиях14. Таким образом, в отличие от обычных полимеразной цепной реакции (ПЦР)-на основе анализов там не требуется тепловая велосипедист13,14. Еще одно преимущество над на основе ПЦР анализов является его устойчивость против потенциальных ингибиторов в ДНК экстракт, обходя необходимость очистки ДНК шаг13. Благодаря протоколу скорость и простота лампа может даже выполняться условиях на месте, с помощью портативной, батареи driven реального времени обнаружения устройства8,15.
ЛАМПА пробирного был разработан в ответ на спрос на метод быстрой идентификации на месте B. tabaci8. Главной целью было разработать протокол, который может выполняться инспекторами здоровья растений с ограниченным лабораторных занятий. Сильный был таким образом, фокус на оптимизации скорости и простоты протокола. Хотя существующие диагностические тесты обычно были разработаны для идентификации одного или нескольких биотопов B. tabaci, Роман assay лампа охватывает весь B. tabaci видов комплекс8,16,17 ,18. Проблема разнообразия выраженным генетическим в таксон комплекса была решена с помощью комбинации различных грунтовка наборы и применение вырожденный грунтовки8. Роман B. tabaci лампа пробирного разработан таким образом, что праймеры целевой фрагмент в конце 3' митохондриальной гена COI8. Этот ген представляет подходящей мишенью для животных диагностики assays потому, что он укрывает регионах сохраняется достаточно для обеспечения диагностической чувствительностью для конкретных видов, при этом дискриминации достаточно между тесно связанных организмов19, 20. Кроме того, гена COI часто используется как генетический маркер в генетических исследованиях населения и как подпись последовательности ДНК штриховое кодирование анализа, что приводит к многочисленных ДНК последовательность записей в базах данных открытым исходным кодом, такие как GenBank и ПОЛУЖИРНЫЙ21 ,22. Помимо общедоступных ПОУ последовательности от B. tabaci, ПОУ последовательностей от близкородственных видов (Aleurocanthus spp. [N = 2], Aleurochiton aceris, Aleurodicus dugesii, Bemisia spp. [N = 3], Neomaskellia andropogonis, Tetraleurodes acaciaeи Trialeurodes spp. [N = 4]) были включены в конструкции праймера этого исследования и используется для оценки диагностической чувствительностью и специфичностью в silico8 .
Из-за точность метода, его скорость (< 1 h) и простота протокола, assay было показано, чтобы быть пригодным для занятия приложения при реализации как часть процедуры контроля импорта на швейцарский POE8.
Protocol
1. Подготовка
- Подготовка аликвоты щелочной раствор экстракции ДНК.
- Производят запас щелочной раствор экстракции ДНК с помощью молекулярного уровня воды с 600 мкм гидроксид калия (KOH) и 2 мкм крезол красный.
Предупреждение: Кох является мощной базой растворенных в воде. Избегайте пятен и кожу и глаза. - Лунки 30 мкл щелочной раствор экстракции ДНК (подготовленных на шаге 1.1.1) в 0,5 мл microcentrifuge трубы и хранить аликвоты при 4 ° C.
Примечание: Используйте aliquoted решение экстракции ДНК в течение 1 года.
- Производят запас щелочной раствор экстракции ДНК с помощью молекулярного уровня воды с 600 мкм гидроксид калия (KOH) и 2 мкм крезол красный.
- Подготовка B. tabaci позитивным усиление контроля (ПАК).
- Генерировать ПЦР ампликонов фрагмента ДНК целевой лампа.
Примечание: Лоренц23дается введение в общие принципы PCR и практику.- Синтезировать или получить грунтовки C1-J-2195 (5'-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3') и TL2-N-3014 (5'-TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA-3′) усилительных фрагмент митохондриальной гена COI24,25.
- Настройка реакции PCR как описано в таблице 1. Использование ДНК экстракт (см. шаг 2.1) ссылка B. tabaci образца ДНК шаблон.
Примечание: При необходимости, его можно извлечь б tabaci ДНК для Пак с использованием коммерческих комплекта согласно инструкциям производителя. - Программа тепловая велосипедист, используя следующие условия: 15 мин при температуре 95 ° C; 45 циклов 40 s при 95 ° C, 15 s при температуре 45 ° C, наращивает свыше 60 s до 60 ° C, 2 мин при 72 ° C; 7 мин при 72 ° C; Держите на 4 ° C.
- Чистый продукт амплификации PCR, с помощью коммерческих комплект очистки ПЦР по данным производителя протокол и элюировать конечного продукта в воде молекулярные класс.
- Используйте коммерческих комплект с ДНК, интеркалирующие краситель для измерения концентрации ДНК продукта PCR амплификация согласно инструкциям производителя и разбавляют молекулярного уровня воды до концентрации 1 нг / мкл. хранить разбавленные амплификации PCR продукт, как PAC Стоковый раствор при температуре-20 ° C.
Примечание: Используйте Пак Стоковый раствор в течение 1 года. - Дополнение к Пак Стоковый раствор (подготовленных на шаге 1.2.1.5) с 0,6 мкм Кох и разбавляют водой молекулярной класс к концентрации 5 x 10-3 нг / мкл. хранить продукт на 4 ° C.
Примечание: Используйте Пак в течение 5 ч для подготовки готовых к использованию B. tabaci лампа наборы, описанные на следующем шаге.
- Генерировать ПЦР ампликонов фрагмента ДНК целевой лампа.
-
Подготовка-готовым B. tabaci лампа комплект (протокол для 20 единиц)
- Используйте ножницы сократить 8-трубки лампы полоски на две 4-трубки лампы полоски.
- Этикетке трубки 4-трубки лампы полос по схеме показано на рисунке 1.
- Подготовьте B. tabaci лампа реакции mastermix (протокол для 80 реакций).
- Мкл 1195.1 готовых к использованию GspSSD изотермической мастер смеси (содержащие полимеразы GspSSD, пирофосфатаза, магния сульфат, deoxynucleotides, двойной нити ДНК привязки привязка краситель) и 717.4 мкл B. tabaci лампа грунтовка микс 2 мл Microcentrifuge трубки. Кратко вихря и импульсный режим центрифуги.
- Лунки 22,5 мкл B. tabaci лампа реакции mastermix (подготовленных на шаге 1.3.3.1) в каждую пробирку 4-трубки лампы полоски (подготовленные в шаг 1.3.1) и импульсного центрифуги.
- Вихревой B. tabaci лампа Пак (подготовленных на шаге 1.2) быстро и пульс центрифуги. Затем мкл 2,5 в трубу, помечены «PAC» каждого 4-трубки лампы полосы (рис. 1).
- Закрыть крышками и хранить готовые к использованию B. tabaci лампа комплект единиц при-20 ° C.
Примечание: Используйте их в течение 1 года.
2. на месте лампа анализ
- Экстракции ДНК
- Используйте стерильные зубочистки для передачи насекомых образцов в 0,5 мл microcentrifuge пробирки, содержащие 30 мкл раствора экстракции ДНК (подготовленных на шаге 1.1.2).
Примечание: Убедитесь в том, что насекомые погружаются в решении добыча. - Проинкубируйте образцы для 5 мин при 95 ° C в thermomixer (300 об/мин). Кратко вихря и импульсный режим центрифуги.
- Используйте стерильные зубочистки для передачи насекомых образцов в 0,5 мл microcentrifuge пробирки, содержащие 30 мкл раствора экстракции ДНК (подготовленных на шаге 1.1.2).
-
B. tabaci лампа пробирного
- Оттепель-готовым B. tabaci лампа комплект подготовленных в шаге 1.3. Вихревой быстро и пульс центрифуги.
Примечание: С каждым набором, это либо можно проверить два различных образцов или для анализа ДНК экстракт одного образца в двух экземплярах. - 2.5 мкл пример ДНК экстракта (подготовленных на шаге 2.1) в пробирки с надписью «S1» и «С2» готовые к использованию B. tabaci лампа комплект (рис. 1).
- 2.5 мкл чистого щелочной раствор экстракции ДНК (подготовлен в разделе 1.1), в трубу, с надписью «Нац» для отрицательных усиления контроля (рис. 1).
- Вихревой готовых к использованию B. tabaci лампа комплект быстро и пульс центрифуги.
- Вставка, готовых к использованию B. tabaci лампа наборы в анализ устройства лампа (с измерения в реальном времени флуоресценции) или платформу ПЦР в реальном времени и выполнить изотермической амплификация анализ ДНК при 65 ° C для 60 мин.
- Измерения температуры плавления продуктов амплификации ДНК путем нагрева до 98 ° C с шагом последующего охлаждения (рампа ставка 0,05 ° C/s) до 75 ° C, при измерении флуоресценции в режиме реального времени.
- Оттепель-готовым B. tabaci лампа комплект подготовленных в шаге 1.3. Вихревой быстро и пульс центрифуги.
- ЛАМПА пробирного считывания
- Проверка лампа считывания вручную следующим образом.
- Если амплификации ДНК были измерены для образца и Пак, не амплификации ДНК была измерена для НСС, и отжига температура продуктов амплификации 80.0-85,5 ° C, рассмотреть результаты лампа как положительные (рис. 2).
- Если есть не амплификации ДНК образцов (то есть, трубки помечены S1 и S2), но для Пак и NAC затем считать результат лампа в виде ОТРИЦАТЕЛЬНОЙ (рис. 2).
- Если амплификации ДНК была измерена для образцов, но температуры нагрева при отжиге соответствующих продуктов амплификации были вне диапазона 80.0 \u2012 85,5 ° C, Пак дал не амплификации ДНК или НАК дал амплификации ДНК, рассмотрим результат лампа в виде НЕВЕРНО (рис. 2).
- При необходимости проверьте лампа считывания с помощью приложения проверки лампа (дополнительный файл 1).
- Определение целевых видов и определить количество испытанных образцов. Нажмите кнопку «создать отчет» .
- Передача считывания (амплификации ДНК да/нет, отжига температура продукта амплификации, результаты Пак и NAC) от отеля лампа анализ устройства или реального времени PCR платформы в соответствующие поля ввода проверки приложения. Результат проверки отображается сразу же после ввода данных.
- Проверка лампа считывания вручную следующим образом.
Representative Results
Во время проверки пробу B. tabaci лампа насекомых образцов, перехватили в ходе процесса контроля регулярные Швейцарский импорта были проанализированы8. Образцы возникла из восьми разных стран (Канарские острова, Доминиканская Республика, Израиль, Малайзия, Марокко, Сингапур, Таиланд и Вьетнам) и отражают генетического разнообразия B. tabaci в8европейских POEs. Все лампы результаты были, кросс подтверждено ДНК штриховое кодирование8.
Из в общей сложности 80 образцов анализируемой лампа 75 образцов (93,8%) были правильно идентифицированы как B. tabaci (true положительных), двух образцов (2,5%) были правильно идентифицированы как не B. tabaci (true негативов) и три образца (3,8%) были ошибочно определены как не B. tabaci (false негативы) (Таблица 2)8. Правильно отрицательные результаты, возникла из двух Trialeurodes vaporariorum образцы, нерегулируемых видов с высоким риском быть смущенным с B. tabaci в POEs завод продукции8. На основе этих результатов были рассчитаны следующие измерения точности диагностики: тест специфичность (true отрицательной курс), 100%; Тестирование чувствительности (true позитивный курс), 96,2%; Тест эффективности (в процентах от правильного теста результаты), 96,3% (Таблица 2)8. При оценке Аналитическая чувствительность (предел обнаружения), лампа б tabaci assay успешно усиленный образец ДНК, разбавляют до 100 fg/мкл через три технических реплицирует (Таблица 3).
Подмножество анализов (N = 13) была выполнена под на месте условия в аэропорту Цюриха POE швейцарского инспекторами здоровья растений, с помощью готовых к использованию B. tabaci лампа комплекты8. При кросс проверены в референс-лаборатории, все результаты тестирования на месте были найдены правильно (проверить эффективность = 100%)8. Оценки на месте эффективности пробирного лампа, среднее время для позитивных (время до получения положительных результатов) был 38.4 ± 10,3 мин (среднее ± стандартное отклонение)8. Представительный участок амплификации ДНК и соответствующего отжига производной от B. tabaci лампа анализа на местах условиях показано в рисунке 3A и B. В этом примере Пример 1 и 2 были правильно идентифицированы как B. tabaci обозначается амплификации ДНК после около 30 мин (Рисунок 3А) вместе с ожидаемой температуры нагрева при отжиге на приблизительно 82 ° C (рис. 3B).
Рисунок 1: Визуализация экспериментальной установки готовых к использованию B. tabaci лампа комплект описаны в протоколе. S1, пример 1; S2, пример 2; Пак, позитивным усиление контроля; NAC, отрицательные усиления контроля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: схема проверки считывания лампа. Пак: позитивным усиление контроля; НАК: негативные усиления контроля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: ДНК амплификации сюжета (A) и отжига производная (B) B. tabaci лампа анализа, выполняются на месте условия. Флуоресценции был измеряется в единицах относительной интенсивности. Зеленая линия, пример 1; Оранжевая линия, пример 2; синяя линия, отрицательные усиления контроля (NAC); Красная линия, позитивным усиление контроля (ПАК). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Компонент | Складе высококонцентрированные | Высококонцентрированные окончательной реакции | Объем в реакции |
| Taq-полимеразы Мастер-микс | 2 x | 1 x | 10 МКЛ |
| Грунтовка C1-J-2195 | 20 МКМ | 0,4 МКМ | 0.4 МКЛ |
| Грунт TL2-N-3014 | 20 МКМ | 0,4 МКМ | 0.4 МКЛ |
| Молекулярного уровня воды | - | - | 8.2 МКЛ |
| Шаблон ДНК | - | - | 1 МКЛ |
Таблица 1: подготовка mastermix реакции PCR для B. tabaci положительных усиление управления. Компоненты и концентрации, необходимые для создания одной реакции PCR. Объем окончательной реакции-20 мкл. грунтовка последовательности приведены в 1.2.1.1.
| N | NTP | NПС | NTN | NFN | СЕНА (%) | SPE (%) | РЭ (%) |
| 80 | 75 | 0 | 2 | 3 | 96,2 | 100 | 96,3 |
Таблица 2: Результаты б. tabaci ЛАМПА пробирного проверки. N, количество анализов; NТП, количество true положительные результаты; NПС, количество ложно положительных результатов; NTN, количество true отрицательных результатов; NFN, количество ложно отрицательные результаты; Сена, диагностической чувствительностью; SPE, диагностические специфичности, EFF, проверить работоспособность.
| CДНК (fg/мкл) | NPR |
TP (мин) (означает ± SD) |
A T (° C) (означает ± SD) |
| 1 х 105 | 3 | 33.5 ± 2.9 | 81,3 ± 0,1 |
| 1 x 10-4 | 3 | 30.7 ± 1.1 | 81 ± 0.0 |
| 1 x 10-3 | 3 | 40.4 ± 3,9 | 81.1 ± 0,1 |
| 1 x 10-2 | 3 | 50.7 ± 1,6 | 81.1 ±0, 1 |
| 1 x 101 | 0 | - | - |
| 1 x 100 | 0 | - | - |
Таблица 3: Аналитическая чувствительность (предел обнаружения) B. tabaci лампа пробирного. В triplicates был испытан каждого разведения. CДНК, ДНК концентрация в реакции; NPR, количество положительных реплицирует; TP, время до положительный результат; TA, отжига температура; SD, стандартное отклонение.
Discussion
Способность точно определять потенциально вредных организмов без задержки представляет собой критический аспект для управления вредителей видов9,10,26. Помимо того, что быстрое, импорт продукции растениеводства, метод идентификации идеальный Пешт должна быть простой для выполнения на месте в POEs8,26. Этот документ сообщает протокол Роман assay лампа для быстрой идентификации B. tabaci, организм насекомых карантина, часто перехватили границ Европы (https://ec.europa.eu/food/sites/food/files/plant/docs/ph_biosec_europhyt _annual доклад _2016.pdf).
Обоснование разработки диагностических тест был для разработки easy-to последующие протокол, который может выполняться во время процедуры контроля импорта завод инспекторами здоровья растений с минимальным лабораторных занятий. Для того, чтобы сделать на месте тестирования как быстрый и простой, насколько это возможно, протокол разделен на две части, подготовка набор готовых к использованию и фактические результаты деятельности пробирного лампа. Первая часть может быть сделано в внешней лаборатории, что инспектор здравоохранения завод выполнять экстракции ДНК и лампа assay занятия с дозирования только один шаг.
Хотя только один шаг, дозирования небольшое количество жидкости может быть сложным для пользователей с мало или нет опыта лаборатории. Для решения этой проблемы, краситель (крезол красный) добавляется к экстракции раствор так что оператор может визуально подтвердить, что небольшое количество ДНК (т.е., 2.5 мкл) корректно перенесены на соответствующие трубу. Еще один важный упрощение протокола является применение проверки как она способствует надежной интерпретации лампа считывания (дополнительный файл 1).
Роман B. tabaci лампа пробирного был проверен в лаборатории и на месте условия тестирования насекомых образцов перехвачены во время процесса контроля регулярного импорта Швейцарии8. В общей сложности 80 образцов из трех континентов, Африка, Евразии и Северной Америке, были проанализированы лампа. 80 образцов только три (3,8%), были ошибочно определены (false негативы)8. При анализе грунтовка последовательности ДНК образцов ложно отрицательные, было установлено, что они были новые B. tabaci гаплотипов, который до настоящего времени не были описаны8. На основе этих результатов, набор грунтовка б tabaci лампа был изменен и успешно перепроверяются8.
Одним из основных ограничений любого метода на основе амплификации ДНК, включая лампа является, что они только определить площадной цели8,последовательностей ДНК27. Всесторонние знания о генетической вариации, в последовательности целевого объекта грунтовка Поэтому решающее значение для обеспечения диагностической точности8,27. Однако такая информация зачастую весьма ограничен, особенно в случае новых видов вредителей8. Хотя редко, ложно отрицательные результаты, вызванных мутациями в последовательности целевых объектов являются ожидаемой8. В случае нынешнего пробу B. tabaci лампа решение для этой проблемы является комбинация с ДНК штриховое кодирование-технологии, стратегии, поняли в ходе осуществления диагностический тест на POE Цюрих аэропорт8. Здесь все лампы отрицательные результаты были повторно проанализированы штриховое кодирование ДНК в внешней лаборатории8. В случае, если встречается Роман Пешт гаплотип пока не описано, лампа грунтовки можно изменять с помощью последовательности ДНК, образующихся в процессе штриховое кодирование8. Таким образом в результате потери скорости в случае отрицательный результат лампа компенсируется для максимальной точности диагностики, обеспечивают в этом двухэтапный процесс8.
Затраты на создание для текущего assay лампа на POE являются приблизительно 25 000 долларов США. С увеличением числа лампа тестов, разработанных для вредителей растений (например, Erwinia amylovora, Flavescence-Дори и Guignardia citricarpa), единовременных инвестиций представляется оправданным13,15, 28. Однако протокол потенциально может быть изменена для сокращения этих расходов еще больше. Например для извлечения ДНК шаг на 95 ° C, термо смеситель используется здесь можно заменить на менее дорогой водяной бане, или выполняя этот шаг непосредственно в устройство лампа режиме реального времени. Кроме того смешивая шаги на vortex вероятно могут быть заменены вручную стряхивая трубы, а на шаге передачи ДНК дозаторов может быть заменен стерильные прививка петли.
Будущие усовершенствования для быстрой идентификации видов B. tabaci и вредителей в целом может быть реализация на месте последовательности подхода, который позволит выполнять анализ ДНК штриховое кодирование в POEs. Перспективный кандидат системы для такой реализации это технология виртуализации Нанопор. Действительно технология недавно была успешно внедрена в отеле ДНК штриховое кодирование попытке оценить биологическое разнообразие леса8,29,30. Систему идентификации штриховое кодирование на месте ДНК может полностью заменить необходимость разработки целенаправленных диагностических тестов и их проверки. Также она позволяет собирать дополнительную информацию о характеристиках вредителей как пестицида сопротивления генов8. Тем не менее, до тех пор, пока роман последовательности технологий будет осуществляться регулярно, лампа пробу B. tabaci представляет быстрый (< 1 h) и точной идентификации метода.
Disclosures
Автор Майкл Андреу является акционером компании OptiGene Limited, которая производит реагентов и инструменты, используемые в этой статье. Другие авторы имеют ничего не разглашать.
Acknowledgments
Авторы благодарны Аннет Grendelmeier, Aurelia Влашки, Корнелия Studer, Даниэль Фрей, Элизабет Разави, Маркус Oggenfuss, Seraina Vonzun и Sven Moeller за участие в проверке B. tabaci лампа assay.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B. tabaci LAMP primer mix | OptiGene Ltd. | on request | For preparation of read-to-use B. tabaci LAMP kit |
| Centrifuge MiniSpin | Eppendorf AG | 5452000010 | For several centrifugation steps |
| Cresol red (red dye) | Sigma-Aldrich Corp. | 114472 | Component of DNA extraction solution |
| Eppendorf ThermoMixer | Eppendorf AG | 5382000015 | For DNA extraction |
| Genie II (on-site LAMP analysis device) | OptiGene Ltd. | Genie® II | For LAMP analysis |
| Genie Strips (8-tube LAMP strips) | OptiGene Ltd. | OP-0008-50 | For preparation of read-to-use B. tabaci LAMP kit |
| HotStarTaq Master Mix | Qiagen AG | 203443 | For generation of positive amplification control |
| Labcycler (Thermocycler) | SensoQuest GmbH, distributed by Witec AG |
011-103 | For DNA extraction |
| GspSSD Lyse n' Lamp Isothermal Mastermix | OptiGene Ltd. | ISO-001LNL | For preparation of read-to-use B. tabaci LAMP kit |
| Mini centrifuge Labnet Prism | Labnet International Inc. | C1801 | For several centrifugation steps |
| NucleoFast 96 PCR | Marcherey-Nagel GmbH | 743500.4 | For clean-up of positive amplification control |
| Potassium hydroxide solution | Sigma-Aldrich Corp. | 319376 | Component of DNA extraction solution |
| Qbit Fluorometer 3 | Thermo Fisher Scientific Corp. | Q33226 | For measuring DNA conentration of positive control |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | For clean-up of positive amplification control |
| Safe-Lock Tubes 0.5 mL (microcentrifuge tube) | Eppendorf AG | 0030 121.023 | For DNA extraction |
| Safe-Lock Tubes 2.0 mL (microcentrifuge tube) | Eppendorf AG | 0030 120.094 | For preparation of read-to-use B. tabaci LAMP kit |
| Wood Toothpicks | VWR International LLC | 470226-594 | For DNA extraction |
| Vortex-Genie 2 (Vortex) | Scientific Industries Inc. | SI-0236 | For several mixing steps |
References
- De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. Bemisia tabaci: a statement of species status. Annual Review of Entomology. 56, 1-19 (2011).
- Zhang, G. F., Lü, Z. C., Wan, F. H., Lövei, G. L. Real-time PCR quantification of Bemisia tabaci (Homoptera: Aleyrodidae) B-biotype remains in predator guts. Molecular Ecology Notes. 7 (6), 947-954 (2007).
- Boykin, L. M., De Barro, P. J. A practical guide to identifying members of the Bemisia tabaci species complex: and other morphologically identical species. Frontiers in Ecology and Evolution. 2, (2014).
- Cuthbertson, A. G. S., Vänninen, I. The importance of maintaining protected zone status against Bemisia tabaci. Insects. 6 (2), 432-441 (2015).
- Dalmon, A., Halkett, F., Granier, M., Delatte, H., Peterschmitt, M. Genetic structure of the invasive pest Bemisia tabaci: evidence of limited but persistent genetic differentiation in glasshouse populations. Heredity. 100 (3), 316-325 (2008).
- Dickey, A. M., Osborne, L. S., Shatters, R. G., Hall, P. A. M., Mckenzie, C. L. Population genetics of invasive Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) cryptic species in the United States based on microsatellite markers. Journal of Economic Entomology. 106 (3), 1355-1364 (2013).
- Bacon, S. J., Bacher, S., Aebi, A. Gaps in border controls are related to quarantine alien insect invasions in Europe. PLOS ONE. 7 (10), e47689 (2012).
- Blaser, S., et al. From laboratory to point of entry: development and implementation of a loop-mediated isothermal amplification (LAMP)-based genetic identification system to prevent introduction of quarantine insect species. Pest Management Science. 74 (6), 1504-1512 (2018).
- Floyd, R., Lima, J., de Waard, J., Humble, L., Hanner, R. Common goals: policy implications of DNA barcoding as a protocol for identification of arthropod pests. Biological Invasions. 12 (9), 2947-2954 (2010).
- Armstrong, K. F., Ball, S. L. DNA barcodes for biosecurity: invasive species identification. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 360 (1462), 1813-1823 (2005).
- Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research. 28 (12), E63 (2000).
- Tomlinson, J. A., Boonham, N., Dickinson, M. Development and evaluation of a one-hour DNA extraction and loop-mediated isothermal amplification assay for rapid detection of phytoplasmas. Plant Pathology. 59 (3), 465-471 (2010).
- Kogovšek, P., et al. LAMP assay and rapid sample preparation method for on-site detection of flavescence dorée phytoplasma in grapevine. Plant Pathology. 64 (2), 286-296 (2015).
- Lee, M. S., Su, T. Y., Lien, Y. Y., Sheu, S. C. The development of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays for the rapid authentication of five forbidden vegetables in strict vegetarian diets. Scientific Reports. 7, 44238 (2017).
- Bühlmann, A., et al. Erwinia amylovora loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay for rapid pathogen detection and on-site diagnosis of fire blight. Journal of Microbiological Methods. 92 (3), 332-339 (2013).
- Cavalieri, V., Manglli, A., Tiberini, A., Tomassoli, L., Rapisarda, C. Rapid identification of Trialeurodes vaporariorum, Bemisia tabaci (MEAM1 and MED) and tomato-infecting criniviruses in whiteflies and in tomato leaves by real-time reverse transcription-PCR assay. Bulletin of Insectology. 67 (2), 219-225 (2014).
- Baek, J. H., Lee, H. J., Kim, Y. H., Lim, K. J., Lee, S. H., Kim, B. J. Development of an antibody-based diagnostic method for the identification of Bemisia tabaci biotype B. Pesticide Biochemistry and Physiology. 131, 18-23 (2016).
- Hsieh, C. H., Wang, H. Y., Chen, Y. F., Ko, C. C. Loop-mediated isothermal amplification for rapid identification of biotypes B and Q of the globally invasive pest Bemisia tabaci, and studying population dynamics. Pest Management Science. 68 (8), 1206-1213 (2012).
- Rejili, M., et al. A PCR-based diagnostic assay for detecting DNA of the olive fruit fly, Bactrocera oleae, in the gut of soil-living arthropods. Bulletin of Entomological Research. 106 (5), 695-699 (2016).
- Hebert, P. D. N., Ratnasingham, S., deWaard, J. R. Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species. Proceedings. Biological Sciences. 270 (Suppl 1), 96-99 (2003).
- Ratnasingham, S., Hebert, P. D. N. bold: The Barcode of Life Data System (http://www.barcodinglife.org). Molecular Ecology Notes. 7 (3), 355-364 (2007).
- Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Bank Wheeler, D. L. G. en GenBank. Nucleic Acids Research. 33, D34-D38 (2005).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Simon, C., Frati, F., Beckenbach, A., Crespi, B., Liu, H., Flook, P. Evolution, weighting, and phylogenetic utility of mitochondrial gene sequences and a compilation of conserved polymerase chain reaction primers. Annals of the Entomological Society of America. 87 (6), 651-701 (1994).
- Simon, C., Buckley, T. R., Frati, F., Stewart, J. B., Beckenbach, A. T. Incorporating molecular evolution into phylogenetic analysis, and a new compilation of conserved polymerase chain reaction primers for animal mitochondrial DNA. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 37 (1), 545-579 (2006).
- Harper, S. J., Ward, L. I., Clover, G. R. G. Development of LAMP and real-time PCR methods for the rapid detection of Xylella fastidiosa for quarantine and field applications. Phytopathology. 100 (12), 1282-1288 (2010).
- Lauri, A., Mariani, P. O. Potentials and limitations of molecular diagnostic methods in food safety. Genes & Nutrition. 4 (1), 1-12 (2009).
- Tomlinson, J. A., et al. A loop-mediated isothermal amplification-based method for confirmation of Guignardia citricarpa in citrus black spot lesions. European Journal of Plant Pathology. 136 (2), 217-224 (2013).
- Branton, D., et al. The potential and challenges of nanopore sequencing. Nature Biotechnology. 26 (10), 1146-1153 (2008).
- Pomerantz, A., et al. Real-time DNA barcoding in a rainforest using nanopore sequencing: opportunities for rapid biodiversity assessments and local capacity building. GigaScience. 7 (4), giy033 (2018).
