Summary
Bu kağıt için döngü-aracılı izotermal amplifikasyon (lamba) teknolojisini temel alan Bemisia tabaci hızlı kimlik tahlil için protokol bildirir. En az laboratuvar eğitim gerektirir ve bu nedenle, Tesis içi giriş bitki ithalat liman ve Havaalanı gibi noktalarda uygulanabilir iletişim kuralı.
Abstract
Whitefly Bemisia tabaci (Gennadius) dünya çapında pek çok ülkede sebze ve süs bitkileri üretimi etkileyen invaziv bir böcekten önemli önemi var. Şiddetli verim kayıp doğrudan besleme tarafından ve daha da önemlisi, ayrıca 100'den fazla zararlı bitki patojenik virüs iletim tarafından kaynaklanır. Diğer invaziv zararlıları gelince, artan uluslararası ticaret B. tabaci yayılma alanlarına yerli yelpazesini ötesinde kolaylaştırır. Denetimler bitkinin puanlar giriş liman gibi ürünlerin ithalat ve hava alanları bu nedenle, bir önemli önleme tedbiri görülür. Ancak, bu son karşı savunma hattı haşere istilası sadece hızlı tanımlama yöntemleri şüpheli böcek numuneler için gönüllülük elde edilebilir eğer etkili olur. Düzenlenmiş B. tabaci ve karantina durumu olmadan yakın akrabalar arasındaki morfolojik farklılaşma sigara-katılmakta, temel üzerinde döngü-aracılı izotermal amplifikasyon (hızlı moleküler kimlik tahlil zor olduğundan LAMBA) teknoloji geliştirilmiştir. Bu yayın roman tahlil açıklayan hızlı DNA ekstraksiyon, set-up lamba tepki yanı sıra B. tabaci örnekler bir saat içinde tanımlama sağlar onun okuma yorumu detaylı protokolünden bildirir. Belirli B. tabaci tespiti için varolan iletişim kurallarına göre biotypes, Gelişmiş Yöntem hedefleyen bütün B. tabaci tür bir tahlil karmaşık. Ayrıca tahlil yerinde giriş noktalarını doğrudan en az laboratuvar eğitimi ile bitki sağlık müfettişleri tarafından uygulanmak üzere tasarlanmıştır. Laboratuvar ve yerinde koşullar altında ayrıntılı doğrulaması gösterir bildirilen lamba tahlil yönetiminin iyileştirilmesi bir hızlı ve güvenilir tanımlama aracı olduğunu B. tabaci.
Introduction
Whitefly Bemisia tabaci (Gennadius) süs bitkileri, sebzeler, tahıl baklagiller ve pamuk1,2de dahil olmak üzere birçok ekonomik açıdan önemli bitkileri verimini etkileyen invaziv bir böcek zararlı olduğunu. Doğrudan phloem besleme yoluyla hasarları, homopteran bu tür bitkiler dolaylı olarak atılımı honeydew yaprak ve meyve yüzeylerin üzerine büyük miktarda yanı sıra çok sayıda bitki patojenik virüs1 iletim tarafından zarar verir , 3 , 4. genetik çalışmalar mitokondrial gen sitokrom c oksidaz 1 (COI) DNA dizileri karşılaştırarak ortaya B. tabaci bir tür karmaşık en az 34 morphocryptic türler3,4. Bu kompleks, Orta Doğu ve Asya alt bölge biotype B kaynaklanan, hem de biotype Q Akdeniz bölgesinden kaynaklanan içinde iki son derece invaziv ve zararlı üye-var genel olarak dağınık uluslararası ticaret kanalıyla faaliyetleri ile bitki ürünleri, özellikle taşımayla süsbitkileri1,5,6. Onun dünya çapında haşere durumu nedeniyle Uluslararası Birliği için doğa koruma ve doğal kaynakların (IUCN) B. tabaci "dünyanın 100 kötü invaziv yabancı türlerin" biri olarak listelenen ve karmaşık türlerin tarafından düzenlenmiş organizmalar birçok ülkede1,3,4.
AB üyesi olmayan ülkeler ve AB içinde onun yayma kimin giriş are bir karantina organizma4yasaklı olarak Avrupa Birliği (AB), B. tabaci bitki sağlık Direktifi 2000/29/EC ek 1AI listelenir. Denetim girişinin (POEs)7,8hava alanları ve liman gibi noktalarda bitki sevkiyatların karantina organizmalar yayılmasına karşı bir temel önleme önlemidir. Durumda bir karantina organizma bulundu, reddetme veya infeste sevk irsaliyesi9(yıkım dahil olmak üzere) tedavisinde tarafından eylem sorumlu Ulusal bitki koruma Örgütü (NPPO) alır. Ancak, ithalat kez teftiş memuru doğru geniş küresel ticaret9ile ilişkili zararlı türlerin tanımlamak için taksonomik uzmanlığa sahip değil. Özellikle farklı morfolojik anahtarlar olmadan olgunlaşmamış yaşam evreleri (Örneğin, yumurta ve larva) tanımlaması katılmakta8,9,10için neredeyse imkansız. Sonuç olarak, en az gecikme ile karantina önlemlerinin uygulanması sağlamak için bir ihtiyaç olduğunu alternatif, hızlı yerinde tanımlama deneyleri9.
Son zamanlarda bitki patojenleri11,12,13tanımlanması için uygun bir teknoloji olarak gösterilen döngü-aracılı izotermal DNA amplifikasyon (lamba) teknolojisinin bir aday yöntemidir. LAMBA çok özel çünkü en az iki astar çift altı farklı DNA hedef sıraları14tanıma yöntemi kullanır. DNA iplikçik deplasman aktivitesini Bst DNA polimeraz nedeniyle, lamba reaksiyonlar izotermal koşul14altında gerçekleştirilir. Bu nedenle, aksine konvansiyonel polimeraz zincir tepkimesi (PCR)-tabanlı deneyleri için sebep yok bir termal cycler13,14. PCR tabanlı deneyleri üzerinde başka bir avantaj onun esneklik potansiyel inhibitörleri DNA arıtma adım13ihtiyacını engellemeyi DNA özü karşı olduğunu. Protokolün hız ve kolaylık nedeniyle, lamba bile yerinde koşullar altında bir taşınabilir, gerçek zamanlı algılama aygıtı8,15tahrik pil kullanarak gerçekleştirilebilir.
Bir lamba tahlil B. tabaci8için hızlı yerinde tanımlama yöntemi için talebi karşılamak üzere tasarlanmıştır. Kapsamlı amaç bitki sağlık müfettişleri ile sınırlı laboratuvar eğitim tarafından gerçekleştirilen bir iletişim kuralı geliştirmekti. Bu nedenle, çok büyük önem hız ve kolaylık iletişim kuralının optimize üzerinde kurulmuştur. Varolan tanı testleri genellikle bir veya daha fazla biotypes, B. tabacitanımlanması için geliştirilmiştir iken, Bütün roman lamba tahlil kapsar B. tabaci tür karmaşık8,16,17 ,18. Sorunu karmaşık belirgin genetik içinde-takson çeşitliliğin farklı astar setleri ve dejenere astar8uygulama kullanarak çözüldü. Roman B. tabaci lamba tahlil astar bir parçası sonunda 3' mitokondrial COI gene8hedef şekilde tasarlanmıştır. Bu gen bölgeleri limanlar çünkü hayvan kontrol deneyleri için uygun bir hedef sunar ayrımcılık ise belirli bir tür için tanılama duyarlılık sağlamak için yeterli korunmuş yeterli arasında yakından ilgili organizmalar19, 20. Ayrıca, COI gen kez nüfus genetik çalışmalar genetik işaretleyicisinde ve DNA barkodlama analizleri, çok sayıda DNA dizisi girişi GenBank ve kalın21 gibi açık kaynak veritabanlarında sonuçlanan bir imza sırayla olarak kullanılır ,22. B. tabaciüzerinden kamuya COI dizileri COI dizileri yakından ilişkili tür (Aleurocanthus spp. [N = 2], Aleurochiton aceris, Aleurodicus dugesii, Bemisia spp. [N = 3], Neomaskellia andropogonis, Tetraleurodes acaciaeve Trialeurodes spp. [N = 4]) Bu çalışmada astar tasarım dahil ve tanılama duyarlılık ve özgüllük silico8 değerlendirmek için kullanılan .
Yöntemi, sürati doğruluğunu nedeniyle (< 1s) ve protokol basitlik, İsviçre POE8alma kontrol yordamının parçası olarak uygulandığında yerinde uygulama için uygun olmak için tahlil gösterilmiştir.
Protocol
1. hazırlıkları
- Aliquots alkali DNA ekstraksiyon çözüm hazırlanıyor.
- Bir hisse senedi 600 µM potasyum hidroksit (KOH) ile takviye moleküler sınıf su kullanarak alkalin DNA ekstraksiyon çözüm üretmek ve 2 µM kresol kırmızı.
Dikkat: KOH suda güçlü bir üstür. Sızıntıları ve cilt ve göz teması önlemek. - (Adım 1.1.1 hazır) alkalin DNA ekstraksiyon çözüm 30 µL 0.5 mL microcentrifuge tüpler içine dağıtmak ve aliquots 4 ° C'de depolayın
Not: 1 yıl içinde bölünmemeli DNA ekstraksiyon çözüm kullanın.
- Bir hisse senedi 600 µM potasyum hidroksit (KOH) ile takviye moleküler sınıf su kullanarak alkalin DNA ekstraksiyon çözüm üretmek ve 2 µM kresol kırmızı.
- B. tabaci olumlu amplifikasyon kontrolü (PAC) hazırlanıyor.
- PCR amplicons lamba hedef DNA parçasının oluşturmak.
Not: Genel PCR ilkeleri ve uygulamaları içine giriş Lorenz23tarafından verilir.- Sentez veya C1-J-2195 astar elde etmek (5'-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3') ve TL2-N-3014 (5'-TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA-3 ') bir parçası olan mitokondrial COI gen24,25yükseltecek.
- PCR reaksiyon Tablo 1' de açıklandığı gibi ayarlayın. DNA özü kullanın (bkz. Adım 2.1) bir başvuru B. tabaci örnek DNA şablon olarak.
Not: İsteğe bağlı olarak, üretici yönergelerine göre ticari bir seti kullanarak PAC için B. tabaci DNA ayıklamak mümkündür. - Aşağıdaki koşullar kullanarak bir termal cycler programı: 15dk 95 ° c; 40 45 devir s 95 ° c, 15 s 60 ramping 45 ° C'de s 60 ° c, 2 dk 72 ° c; 7 dk. 72 ° c; 4 ° C'de tutun
- Üreticinin protokolüne göre ticari bir PCR temizlik seti kullanarak PCR güçlendirme ürün temiz ve moleküler sınıf su son üründe elute.
- PCR güçlendirme ürün üretici yönergelerine göre DNA konsantrasyon ölçmek ve moleküler sınıf su 1 bir konsantrasyon ile sulandırmak için DNA enterkalasyon boya ile ticari bir setini kullanın ng / µL. mağaza seyreltilmiş PCR güçlendirme -20 ° C'de PAC hisse senedi çözüm olarak ürün
Not: PAC hisse senedi çözüm 1 yıl içinde kullanın. - (Adım 1.2.1.5 hazır) PAC hisse senedi çözüm 0.6 µM KOH ile ek ve 5 x 10-3 ng bir konsantrasyon için moleküler sınıf suyla seyreltik / µL. mağaza ürün 4 ° C'de
Not: 5 h içinde PAC için kullanıma hazır B. tabaci lamba hazırlanması için kullanın sonraki adımda açıklanan kitleri.
- PCR amplicons lamba hedef DNA parçasının oluşturmak.
-
Hazırlanması için kullanıma hazır B. tabaci lamba seti (20 birim için iletişim kuralı)
- 8-tüp lamba şeritler iki 4-tüp lamba şeritler halinde kesmek için makas kullan.
- 4-tüp lamba şeritler Şekil 1' de gösterilen düzenine göre tüpler etiketleyin.
- B. tabaci lamba tepki mastermix (80 reaksiyonlar için iletişim kuralı) hazırlayın.
- 1195.1 µL kullanıma hazır GspSSD izotermal ana Mix (GspSSD polimeraz, pyrophosphatase, magnezyum sülfat, deoxynucleotides, Çift Kişilik strand bağlama DNA bağlama boya içeren) ekleyin ve B. tabaci lamba astar Mix 2 ml 717.4 µL microcentrifuge tüp. Kısaca girdap ve nabız santrifüj.
- B. tabaci lamba tepki mastermix (1.3.3.1 adımda hazırlanan) 22.5 µL her 4-tüp lamba şeritler (hazırlanan adım 1.3.1) ve nabız santrifüj tüpüne dağıtmak.
- Girdap B. tabaci lamba (1.2 adımda hazırlanan) PAC hızlı bir şekilde ve nabız santrifüj kapasitesi. Daha sonra her 4-tüp lamba şerit (Şekil 1) "PAC" ile etiketlenmiş tüp içine 2.5 µL ekleyin.
- -20 ° C'de birimleri yakın kapakları ve mağaza için kullanıma hazır B. tabaci lamba kiti
Not: 1 yıl içinde kullanalım.
2. yerinde lamba Analizi
- DNA ekstraksiyon
- Steril kürdan böcek örnekler içeren DNA ekstraksiyon çözüm (1.1.2 adımda hazırlanan) 30 µL 0.5 mL microcentrifuge tüpler içine aktarmak için kullanın.
Not: böcekler ayıklama çözümde batırma vardır emin olun. - Bir thermomixer (300 rpm) 95 ° C'de 5 min için örnekleri kuluçkaya. Kısaca girdap ve nabız santrifüj.
- Steril kürdan böcek örnekler içeren DNA ekstraksiyon çözüm (1.1.2 adımda hazırlanan) 30 µL 0.5 mL microcentrifuge tüpler içine aktarmak için kullanın.
-
B. tabaci lamba tahlil
- 1.3. adımda hazırlanan tezcan hazır, kullanımı B. tabaci lamba seti. Girdap hızlı bir şekilde ve nabız santrifüj.
Not: her kiti ile o ya da iki farklı örnekleri test etmek için veya yinelenen bir numune DNA özü analiz etmek mümkündür. - 2.5 µL ekstresinin (2.1 adımda hazırlanan) örnek DNA "S1" ve "S2" hazır kullanımlı B. tabaci lamba seti (Şekil 1) etiketli tüpler içine ekleyin.
- 2.5 µL saf alkalin DNA ekstraksiyon çözüm (1.1 bölümünde hazır) "NAC" negatif amplifikasyon kontrolü (Şekil 1) etiketli tüp içine ekleyin.
- Hazır kullanımlı B. tabaci lamba hızla kiti ve santrifüj darbe.
- INSERT hazır kullanmak B. tabaci lamba lamba analiz cihazı (ile gerçek zamanlı floresans ölçüm) veya gerçek zamanlı PCR platformu kitleri ve için 60 dk 65 ° c izotermal bir DNA amplifikasyon çözümlemesi gerçekleştirin.
- 98 ° C'ye kadar bir sonraki soğutma adım ile Isıtma tarafından DNA amplifikasyon ürünleri erime sıcaklıkları ölçmek (rampa oranı 0,05 ° C/s) Floresan içinde gerçek-zaman ölçme sırasında 75 ° c.
- 1.3. adımda hazırlanan tezcan hazır, kullanımı B. tabaci lamba seti. Girdap hızlı bir şekilde ve nabız santrifüj.
- LAMBA tahlil okuma
- LAMBA çıktı aşağıdaki gibi el ile doğrulamak.
- DNA arttırımlar örnek ve PAC için ölçüldü, hiçbir DNA amplifikasyon için NAC ölçüldü ve amplifikasyon ürünleri tavlama sıcaklığı vardı 80.0 ve 85.5 ° C arasında lamba sonuçları olarak düşünün pozitif (resim 2).
- Hiçbir DNA amplifikasyon için (Yani, tüpler etiketli S1 ve S2) örnekleri ise ancak o zaman PAC ve NAC lamba sonucu olarak düşünün için negatif (Şekil 2).
- DNA amplifikasyon örnekleri için ölçüldü ama karşılık gelen amplifikasyon ürünleri tavlama sıcaklığı aralığı 80.0 \u2012 85.5 ° C, olduğunu ve/veya PAC hiçbir DNA amplifikasyon verdi, ve/veya DNA amplifikasyon NAC verdi, lamba sonucu olarak düşünün GEÇERSİZ (Şekil 2).
- İsteğe bağlı olarak, istimal belgili tanımlık lamba doğrulama kullanma (ek dosya 1) lamba eşleştirmeyi doğrulamak.
- Hedef türler tanımlamak ve test örnekleri sayısını tanımlayın. "Rapor oluştur" düğmesini tıklatın.
- Eşleştirmeyi transfer (tavlama sıcaklığı amplifikasyon ürünü, Evet/Hayır, DNA amplifikasyon sonuçları PAC ve NAC) yerinde lamba analiz cihazı veya gerçek zamanlı PCR platform doğrulama uygulama karşılık gelen giriş alanları için. Doğrulama sonucunu hemen verileri girdikten sonra görüntülenir.
- LAMBA çıktı aşağıdaki gibi el ile doğrulamak.
Representative Results
B. tabaci lamba tahlil doğrulama sırasında analiz8böcek numuneler düzenli İsviçre alma denetim işlemi sırasında ele olduğunu. Numuneler sekiz farklı ülkeden (Kanarya Adaları, Dominik Cumhuriyeti, İsrail, Malezya, Fas, Singapur, Tayland ve Vietnam) kökenli ve Avrupa POEs8' de bulunan B. tabaci genetik çeşitliliği yansıtmaktadır. Tüm lamba sonuçları çapraz DNA barkodlama8tarafından onaylanmış olduğunu.
Toplam 80 örneklerin lamba tarafından analiz, 75 örnekler (%93,8) doğru B. tabaci (true-pozitif) tespit edilmiştir, iki örnek (% 2.5) doğru B. tabaci (true-negatifleri) ve üç örnekler (%3,8) değil varlık olarak tespit edilmiştir yanlış B. tabaci (yanlış-negatif) (Tablo 2) değil varlık olarak tespit edilmiştir8. İki Trialeurodes vaporariorum örnekleri, bir sigara düzenlenir tür bitki ürünleri8için B. tabaci POEs yönü ile karıştırılmaması için yüksek risk altında kökenli düzeltmek negatif sonuçları. Bu sonuçlara bağlı olarak, aşağıdaki ölçümleri tanısal doğruluk hesaplanmıştır: test (true negatif oranı), özgüllüğü % 100; hassasiyet (true-pozitif oranı), %96.2 test; Verimlilik (doğru test sonuçları yüzdesi), test %96,3 (Tablo 2)8. Analitik duyarlılık (algılama sınırı) değerlendirirken, B. tabaci lamba tahlil başarıyla örnek DNA 100 fg/µL için üç teknik çoğaltır (Tablo 3) seyreltilmiş güçlendirilmiş.
Bir alt kümesini deneyleri (N = 13) için kullanıma hazır B. tabaci lamba setleri8kullanarak bitki sağlık müfettişleri tarafından yerinde koşullarda Swiss POE Zürih Havaalanı'nda gerçekleştirildi. Ne zaman çapraz doğrulanmış referans laboratuvarı bünyesinde test tüm sonuç doğru olmak bulunamadı (test verimliliği = %100)8. Yerinde lamba tahlil performansı değerlendiriliyor, pozitif (olumlu sonuçlar kadar kullanılabilir saat) için Ortalama süre 38.4 ± 10.3 min (ortalama ± standart sapma)8yaşındaydım. Temsil edici bir DNA amplifikasyon arsa ve karşılık gelen tavlama türev yerinde koşullar altında gerçekleştirilen bir B. tabaci lamba çözümlemesi Şekil 3A ve Bgösterilir. Örneğin, örnek bir ve iki doğru tespit edildi olarak B. tabaci DNA amplifikasyon sonra yaklaşık 30 dakika (Şekil 3A) beklenen tavlama sıcaklıkları yaklaşık 82 ° c (Şekil 3B) ile birlikte gösterilir.
Şekil 1: görsel bir hazır kullanımlı B. tabaci lamba seti deneysel up olarak açıklanan iletişim kuralında. S1, örnek 1; S2, örnek 2; PAC, pozitif amplifikasyon kontrolü; NAC olumsuz amplifikasyon kontrolü. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: lamba okuma doğrulama şema. PAC: pozitif amplifikasyon kontrolü; NAC: negatif amplifikasyon kontrolü. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: DNA amplifikasyon Arsa (A) ve tavlama türevi (B) B. tabaci lamba Analizi gerçekleştirilen yerinde koşullar altında. Floresans göreli yoğunluğunu birimleri cinsinden ölçülmüştür. Yeşil hat, örnek 1; turuncu çizgi, örnek 2; mavi çizgili, negatif amplifikasyon kontrolü (NAC); kırmızı çizgi, pozitif amplifikasyon kontrolü (PAC). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Bileşen | Hisse senedi konsantrasyonlu | Son tepki konsantrasyonlu | Birim başına tepki |
| Taq polimeraz Master Mix | 2 x | 1 x | 10 ΜL |
| Astar C1-J-2195 | 20 ΜM | 0.4 ΜM | 0.4 ΜL |
| Astar TL2-N-3014 | 20 ΜM | 0.4 ΜM | 0.4 ΜL |
| Moleküler sınıf su | - | - | 8.2 ΜL |
| DNA şablonu | - | - | 1 ΜL |
Tablo 1: PCR reaksiyon mastermix için hazırlanması B. tabaci olumlu amplifikasyon kontrolü. Bileşenleri ve konsantrasyonları bir PCR reaksiyonu ayarlamak gerekli. Son tepki birimdir 20 µL. astar dizileri 1.2.1.1 içinde gösterilir.
| N | NTP | NFP | NTN | NFN | SEN (%) | SPE (%) | EFF (%) |
| 80 | 75 | 0 | 2 | 3 | 96.2 | 100 | 96,3 |
Tablo 2: B. sonuçlarını tabaci LAMBA tahlil doğrulama. N, analizleri sayısı; NTP, true-pozitif sonuç sayısı; NFP, yanlış pozitif sonuç sayısı; NTN, true-negatif sonuç sayısı; NFN, yanlış negatif sonuç sayısı; SEN, tanılama duyarlılık; SPE, tanılama özgüllük, EFF, test verimliliği.
| CDNA (fg/µL) | NPR |
TP (min) (± SD demek) |
TA (° C) (± SD demek) |
| 1 x 105 | 3 | 33,5 ± 2.9 | 81.3 ± 0,1 |
| 1 x 104 | 3 | 30,7 ± 1.1 | 81 ± 0.0 |
| 1 x 103 | 3 | 40,4 ± 3.9 | 81,1 ± 0,1 |
| 1 x 102 | 3 | 50,7 ± 1,6 | 81,1 ±0.1 |
| 1 x 101 | 0 | - | - |
| 1 x 100 | 0 | - | - |
Tablo 3: analitik duyarlılığını (algılama sınırı) B. tabaci lamba tahlil. Her seyreltme triplicates test edildi. CDNA, DNA toplama tepki başına; NPR, pozitif sayısını çoğaltır; TP, zaman-e kadar olumlu bir sonuç elde edilebilir; Tavlama sıcaklığı TA, SD, standart sapma.
Discussion
Doğru zaman gecikme olmadan zararlı organizmalar tanımlama yeteneği haşere türü9,10,26yönetimi için önemli bir özelliği temsil eder. Bitki alma ürünleri için hızlı olmanın yanı sıra, bir ideal haşere tanımlama yöntemi yerinde POEs8,26gerçekleştirmek basit olmalıdır. Bu kağıt B. tabaci, sık sık Avrupa sınırlarında (https://ec.europa.eu/food/sites/food/files/plant/docs/ph_biosec_europhyt ele bir karantina böcek organizma hızlı tanımlanması için yeni bir lamba tahlil Protokolü raporları _annual-rapor _2016.pdf).
Tanı testi gelişimi arkasındaki mantığı bitki alma denetim işlemi sırasında en az laboratuvar eğitim ile bitki sağlık müfettişleri tarafından gerçekleştirilen bir takip etmek kolay iletişim kuralı tasarımı oldu. Yerinde hızlı ve mümkün olduğunca basit olarak test yapmak için protokol iki bölüme, kullanıma hazır kit hazırlanması ve lamba tahlil gerçek performansını ayrılmıştır. Bitki Sağlık müfettişi DNA ekstraksiyon ve lamba tahlil ile sadece bir pipetting adım yerinde gerçekleştirebilmesi için ilk bölümü dış bir laboratuvarda yapılabilir.
Yine de sadece bir adım, pipetting az miktarda sıvı az veya hiç laboratuvar deneyimi ile kullanıcılar için zor olabilir. Bu sorunu gidermek için bir boya (kresol kırmızı) operatör görsel olarak az miktarda DNA (Yani, 2.5 µL) doğru ilgili tüp transfer edilir teyit edebilir böylece ayıklama çözüme eklenir. O lamba eşleştirmeyi (ek dosya 1) güvenilir bir yorumu kolaylaştırır gibi önemli basitleştirilmesi başka bir iletişim kuralı doğrulama uygulamasıdır.
Roman B. tabaci lamba tahlil Laboratuvarı ve yerinde koşullar altında böcek numuneler İsviçre8düzenli alma denetim işlemi sırasında ele sınayarak doğrulandı. Toplamda, üç kıtada, Afrika, Avrasya ve Kuzey Amerika, üzerinden 80 örnekler lamba tarafından analiz edildi. 80 örnekleri sadece üç (% 3.8) yanlış tespit (yanlış negatifleri)8vardı. Astar hedef DNA dizileri yanlış negatif örneklerin analiz ederken, ana kadar açıklanan8oldu değil yeni B. tabaci haplotypes olduklarını bulundu. Bu sonuçlara dayanarak, B. tabaci lamba astar kümesi8değiştirilmiş ve başarıyla yeniden doğrulanmış oldu.
Bir büyük lamba dahil olmak üzere herhangi bir DNA amplifikasyon tabanlı yöntemi yalnızca önceden tanımlanmış hedef DNA dizileri8,27tanımlar kısıtlamasıdır. Astar hedef sırada bulunan genetik varyasyon kapsamlı bir bilgi bu nedenle tanısal doğruluk8,27sağlamak çok önemlidir. Ancak, bu tür bilgiler sık sık özellikle yeni haşere türü8ortaya çıkan söz konusu olduğunda çok sınırlıdır. Nadir olsa da, hedef sıra mutasyonlar neden yanlış negatif sonuçlar beklenen8vardır. Mevcut B. tabaci lamba tahlil söz konusu olduğunda, bu sorun için bir çözüm bir DNA barkodlama tabanlı teknoloji, POE Zürih Havaalanı8tanılama Bu sınama uygulaması sırasında fark bir strateji ile oluşur. Burada, tüm lamba negatif sonuçları DNA barkodlama bir dış Laboratuvarı8tarafından yeniden analiz edildi. Henüz açıklanan bir roman haşere haplogrubundan karşılaştı diye, lamba astar barkodlama işlemi8' oluşturulan DNA dizisi kullanılarak değiştirilebilir. Böylece, bu iki aşamalı bir süreç8' sağlamıştır maksimum tanısal doğruluk için hızı negatif bir lamba sonuç durumunda ortaya çıkan kaybı telafi.
Yaklaşık 25.000 USD bir POE, geçerli lamba tahlil için set-up maliyetlerdir. Bitki zararlıları için (Örneğin, Erwinia amylovora, Flavescence dorée ve Guignardia citricarpa) geliştirilen lamba testleri sayısının artması ile böyle bir kerelik yatırım haklı13,15, görünür 28. ancak, protokol potansiyel olarak bu maliyetleri daha da azaltmak için değiştirilmiş olabilir. Örneğin, DNA ekstraksiyon için adım termo Mikser burada kullanılan 95 ° C'de daha az pahalı bir su banyosu veya doğrudan gerçek zamanlı lamba cihazda bu adımı gerçekleştirmek yerini olabilir. Ayrıca, girdap karıştırma merdivenlerinde muhtemelen el ile tüpler flicking tarafından değiştirilebilir ve DNA aktarımı adımda pipettor steril aşılama döngüler tarafından değiştirilmesi.
Bir hızlı teşhis edilmesi için kullanılan B. tabaci ve zararlı türlerin gelecekteki iyileştirmeler genel POEs, DNA barkodlama çözümlemesi için izin verecek bir yerinde sıralama yaklaşım uygulaması olabilir. Bir umut verici adayı gibi bir uygulama için nanopore sıralama teknolojisi sistemidir. Gerçekten de, teknoloji son zamanlarda başarıyla bir yağmur ormanı8,29,30biyoçeşitlilik değerlendirmek için bir yerinde DNA barkodlama çaba uygulamaya konmuştur. Bir yerinde DNA barkod tanımlama sistemi tamamen hedeflenen tanı sınamaları geliştirme ve onların doğrulama ihtiyacını değiştirebilirsiniz. Ayrıca böcek ilacı direnç genleri8gibi zararlı özellikleri hakkında daha fazla bilgi toplama sağlar. Roman sıralama teknolojileri rutin olarak uygulanan kadar yine de, B. tabaci lamba tahlil hızlı bir temsil eder (< 1s) ve doğru tanımlama yöntemi.
Disclosures
Yazar Michael Andreou OptiGene Limited şirketi reaktifler ve bu makalede kullanılan aletleri üreten bir hissedar olduğunu. Diğer yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar Annette Grendelmeier, Aurelia Drenovac, Cornelia Studer, Daniel Frei, Elisabeth Razavi, Markus Oggenfuss, Seraina Vonzun ve Sven Moeller B. tabaci lamba testin doğrulama katıldığınız için minnettarız.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B. tabaci LAMP primer mix | OptiGene Ltd. | on request | For preparation of read-to-use B. tabaci LAMP kit |
| Centrifuge MiniSpin | Eppendorf AG | 5452000010 | For several centrifugation steps |
| Cresol red (red dye) | Sigma-Aldrich Corp. | 114472 | Component of DNA extraction solution |
| Eppendorf ThermoMixer | Eppendorf AG | 5382000015 | For DNA extraction |
| Genie II (on-site LAMP analysis device) | OptiGene Ltd. | Genie® II | For LAMP analysis |
| Genie Strips (8-tube LAMP strips) | OptiGene Ltd. | OP-0008-50 | For preparation of read-to-use B. tabaci LAMP kit |
| HotStarTaq Master Mix | Qiagen AG | 203443 | For generation of positive amplification control |
| Labcycler (Thermocycler) | SensoQuest GmbH, distributed by Witec AG |
011-103 | For DNA extraction |
| GspSSD Lyse n' Lamp Isothermal Mastermix | OptiGene Ltd. | ISO-001LNL | For preparation of read-to-use B. tabaci LAMP kit |
| Mini centrifuge Labnet Prism | Labnet International Inc. | C1801 | For several centrifugation steps |
| NucleoFast 96 PCR | Marcherey-Nagel GmbH | 743500.4 | For clean-up of positive amplification control |
| Potassium hydroxide solution | Sigma-Aldrich Corp. | 319376 | Component of DNA extraction solution |
| Qbit Fluorometer 3 | Thermo Fisher Scientific Corp. | Q33226 | For measuring DNA conentration of positive control |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | For clean-up of positive amplification control |
| Safe-Lock Tubes 0.5 mL (microcentrifuge tube) | Eppendorf AG | 0030 121.023 | For DNA extraction |
| Safe-Lock Tubes 2.0 mL (microcentrifuge tube) | Eppendorf AG | 0030 120.094 | For preparation of read-to-use B. tabaci LAMP kit |
| Wood Toothpicks | VWR International LLC | 470226-594 | For DNA extraction |
| Vortex-Genie 2 (Vortex) | Scientific Industries Inc. | SI-0236 | For several mixing steps |
References
- De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. Bemisia tabaci: a statement of species status. Annual Review of Entomology. 56, 1-19 (2011).
- Zhang, G. F., Lü, Z. C., Wan, F. H., Lövei, G. L. Real-time PCR quantification of Bemisia tabaci (Homoptera: Aleyrodidae) B-biotype remains in predator guts. Molecular Ecology Notes. 7 (6), 947-954 (2007).
- Boykin, L. M., De Barro, P. J. A practical guide to identifying members of the Bemisia tabaci species complex: and other morphologically identical species. Frontiers in Ecology and Evolution. 2, (2014).
- Cuthbertson, A. G. S., Vänninen, I. The importance of maintaining protected zone status against Bemisia tabaci. Insects. 6 (2), 432-441 (2015).
- Dalmon, A., Halkett, F., Granier, M., Delatte, H., Peterschmitt, M. Genetic structure of the invasive pest Bemisia tabaci: evidence of limited but persistent genetic differentiation in glasshouse populations. Heredity. 100 (3), 316-325 (2008).
- Dickey, A. M., Osborne, L. S., Shatters, R. G., Hall, P. A. M., Mckenzie, C. L. Population genetics of invasive Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) cryptic species in the United States based on microsatellite markers. Journal of Economic Entomology. 106 (3), 1355-1364 (2013).
- Bacon, S. J., Bacher, S., Aebi, A. Gaps in border controls are related to quarantine alien insect invasions in Europe. PLOS ONE. 7 (10), e47689 (2012).
- Blaser, S., et al. From laboratory to point of entry: development and implementation of a loop-mediated isothermal amplification (LAMP)-based genetic identification system to prevent introduction of quarantine insect species. Pest Management Science. 74 (6), 1504-1512 (2018).
- Floyd, R., Lima, J., de Waard, J., Humble, L., Hanner, R. Common goals: policy implications of DNA barcoding as a protocol for identification of arthropod pests. Biological Invasions. 12 (9), 2947-2954 (2010).
- Armstrong, K. F., Ball, S. L. DNA barcodes for biosecurity: invasive species identification. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 360 (1462), 1813-1823 (2005).
- Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research. 28 (12), E63 (2000).
- Tomlinson, J. A., Boonham, N., Dickinson, M. Development and evaluation of a one-hour DNA extraction and loop-mediated isothermal amplification assay for rapid detection of phytoplasmas. Plant Pathology. 59 (3), 465-471 (2010).
- Kogovšek, P., et al. LAMP assay and rapid sample preparation method for on-site detection of flavescence dorée phytoplasma in grapevine. Plant Pathology. 64 (2), 286-296 (2015).
- Lee, M. S., Su, T. Y., Lien, Y. Y., Sheu, S. C. The development of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays for the rapid authentication of five forbidden vegetables in strict vegetarian diets. Scientific Reports. 7, 44238 (2017).
- Bühlmann, A., et al. Erwinia amylovora loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay for rapid pathogen detection and on-site diagnosis of fire blight. Journal of Microbiological Methods. 92 (3), 332-339 (2013).
- Cavalieri, V., Manglli, A., Tiberini, A., Tomassoli, L., Rapisarda, C. Rapid identification of Trialeurodes vaporariorum, Bemisia tabaci (MEAM1 and MED) and tomato-infecting criniviruses in whiteflies and in tomato leaves by real-time reverse transcription-PCR assay. Bulletin of Insectology. 67 (2), 219-225 (2014).
- Baek, J. H., Lee, H. J., Kim, Y. H., Lim, K. J., Lee, S. H., Kim, B. J. Development of an antibody-based diagnostic method for the identification of Bemisia tabaci biotype B. Pesticide Biochemistry and Physiology. 131, 18-23 (2016).
- Hsieh, C. H., Wang, H. Y., Chen, Y. F., Ko, C. C. Loop-mediated isothermal amplification for rapid identification of biotypes B and Q of the globally invasive pest Bemisia tabaci, and studying population dynamics. Pest Management Science. 68 (8), 1206-1213 (2012).
- Rejili, M., et al. A PCR-based diagnostic assay for detecting DNA of the olive fruit fly, Bactrocera oleae, in the gut of soil-living arthropods. Bulletin of Entomological Research. 106 (5), 695-699 (2016).
- Hebert, P. D. N., Ratnasingham, S., deWaard, J. R. Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species. Proceedings. Biological Sciences. 270 (Suppl 1), 96-99 (2003).
- Ratnasingham, S., Hebert, P. D. N. bold: The Barcode of Life Data System (http://www.barcodinglife.org). Molecular Ecology Notes. 7 (3), 355-364 (2007).
- Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Bank Wheeler, D. L. G. en
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Simon, C., Frati, F., Beckenbach, A., Crespi, B., Liu, H., Flook, P. Evolution, weighting, and phylogenetic utility of mitochondrial gene sequences and a compilation of conserved polymerase chain reaction primers. Annals of the Entomological Society of America. 87 (6), 651-701 (1994).
- Simon, C., Buckley, T. R., Frati, F., Stewart, J. B., Beckenbach, A. T. Incorporating molecular evolution into phylogenetic analysis, and a new compilation of conserved polymerase chain reaction primers for animal mitochondrial DNA. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 37 (1), 545-579 (2006).
- Harper, S. J., Ward, L. I., Clover, G. R. G. Development of LAMP and real-time PCR methods for the rapid detection of Xylella fastidiosa for quarantine and field applications. Phytopathology. 100 (12), 1282-1288 (2010).
- Lauri, A., Mariani, P. O. Potentials and limitations of molecular diagnostic methods in food safety. Genes & Nutrition. 4 (1), 1-12 (2009).
- Tomlinson, J. A., et al. A loop-mediated isothermal amplification-based method for confirmation of Guignardia citricarpa in citrus black spot lesions. European Journal of Plant Pathology. 136 (2), 217-224 (2013).
- Branton, D., et al. The potential and challenges of nanopore sequencing. Nature Biotechnology. 26 (10), 1146-1153 (2008).
- Pomerantz, A., et al. Real-time DNA barcoding in a rainforest using nanopore sequencing: opportunities for rapid biodiversity assessments and local capacity building. GigaScience. 7 (4), giy033 (2018).
