Summary
Detta papper rapporterar protokollet för en snabb identifiering analys för Bemisia tabaci baserat på loop-medierad isotermiska amplifiering (lampa) teknik. Protokollet kräver minimal laboratorium utbildning och kan därför genomföras på plats vid införselorter för växt import till exempel hamnar och flygplatser.
Abstract
Mjöllus Bemisia tabaci (Gennadius) är en invasiv skadegörare av stor betydelse, som påverkar produktionen av grönsaker och prydnadsväxter grödor i många länder runt om i världen. Svår skördeförluster orsakas av direkt utfodring, och ännu viktigare, också av överföring av mer än 100 skadliga växt lågpatogena virus. När det gäller andra invasiva skadedjur underlättar ökad internationell handel spridning av B. tabaci till områden utanför sitt naturliga utbredningsområde. Inspektioner av anläggningar importerar produkter vid införselorter till exempel hamnar och flygplatser, därför ses som en viktig förebyggande åtgärd. Men är denna sista försvarslinje mot pest invasioner endast effektiva om snabba identifieringsmetoder för misstänkta insekt exemplar finns tillgängliga. Eftersom morfologisk differentiering mellan reglerade B. tabaci och nära släktingar utan karantänstatus är svårt för icke-taxonomer, en snabb molekylärbiologisk identifiering analys utifrån den loop-medierad isotermiska amplifiering ( LAMPA) teknik har utvecklats. Denna publikation rapporterar detaljerad protokollet av Roman analys som beskriver snabb DNA-extraktion, set-up lampa reaktion, liksom tolkningen av dess avläsningssystem, som gör det möjligt att identifiera B. tabaci exemplar inom en timme. Jämfört med befintliga protokoll för påvisande av specifika B. tabaci biotyper, den utvecklade metoden riktar sig till hela B. tabaci arter komplexa i en analys. Dessutom är analysen avsedd att appliceras på plats av hälsoinspektörer växt med minimal laboratorium utbildning direkt vid införselorter. Grundlig validering utförs enligt laboratoriet och hotellets villkor visar att rapporterade lampa-analysen är ett verktyg för snabb och tillförlitlig identifiering, förbättra förvaltningen av B. tabaci.
Introduction
Mjöllus Bemisia tabaci (Gennadius) är en invasiv insekt skadegörare som påverkar avkastningen av många ekonomiskt viktiga grödor, däribland prydnadsväxter, grönsaker, trindsädesslag och bomull1,2. Bredvid skador som orsakats genom direkta phloem-utfodring, skadar de homopteran arterna växter indirekt av utsöndring av stora mängder honeydew på ytor av löv och frukter, samt av överföringen av talrika växt patogena virus1 , 3 , 4. senaste genetiska studier jämför DNA sekvenser av den mitokondriella genen cytokrom c oxidasen 1 (COI) avslöjade att B. tabaci ingår i släktet komplex av minst 34 morphocryptic arter3,4. Två mycket invasiva och skadliga medlemmar inom detta komplex, biotyp B med ursprung från Mellanöstern och asiatiska mindre regionen samt biotyper Q med ursprung från Medelhavsområdet, har varit spridda globalt genom internationell handel aktiviteter med vegetabiliska produkter, särskilt genom transport av prydnadsväxter1,5,6. På grund av dess världsomspännande pest status, den internationella unionen för bevarande av natur och naturresurser (IUCN) anges B. tabaci som en av de ”världens 100 worst invasiva främmande arter” och medlemmar av de komplexa arterna är reglerade organismer av många länder1,3,4.
I Europeiska unionen (EU), listas B. tabaci i den växt hälsa direktiv 2000/29/EG bilaga 1AI som en karantän organism vars införsel från länder utanför EU och dess spridning inom EU är förbjudet4. En viktig förebyggande åtgärd mot spridningen av karantän organismer är inspektion av anläggningen transporter vid införselorter (POEs) såsom flygplatser och kusthamnar7,8. I fall hittas en karantän organism, den nationella växt skydd organisation (NPPO) ansvarig vidtar åtgärder av antingen avvisa eller behandling (inklusive destruktion) av angripna sändning9. Officerare inspekterar importen ofta har dock inte den taxonomiska kompetensen att korrekt identifiera det omfattande utbudet av skadedjur associerade med global handel9. Särskilt en identifiering av omogna stadier (t.ex. ägg och larver) utan distinkta morfologiska nycklar är praktiskt taget omöjligt för icke-taxonomer8,9,10. Följaktligen, för att möjliggöra genomförandet av karantänåtgärder med minimal fördröjning, finns det ett behov för alternativa, snabb på plats identifiering analyser9.
En kandidat metod är den loop-medierad isotermiska DNA amplifiering (lampa) teknik som har nyligen visat sig vara en lämplig teknik för identifiering av anläggningen patogener11,12,13. LAMPAN är mycket specifik eftersom metoden använder minst två primer par erkänner sex distinkta DNA mål sekvenser14. På grund av aktiviteten DNA strand förskjutning av Bst DNA polymerase utförs lampa reaktioner under isotermiska villkor14. Därför, i motsats till konventionella polymeraskedjereaktion (PCR)-baserade analyser det finns ingen anledning för en termocykel13,14. En annan fördel över PCR-baserade analyser är dess motståndskraft mot potentiella inhibitorer i den DNA-extrakt, kringgå behovet av en DNA rening steg13. På grund av protokollets hastighet och enkelhet, kan lampa även utföras enligt hotellets villkor med hjälp av en bärbar, batteridriven realtid upptäcka enheten8,15.
En lampa analysen utformades som svar på efterfrågan på en snabb Hotellets identifieringsmetod för B. tabaci8. Det övergripande målet var att utveckla ett protokoll som kan utföras av hälsoinspektörer växt med begränsad laboratorium utbildning. Ett starkt fokus, därför sattes på att optimera hastighet och enkelhet i protokollet. Och befintliga diagnostiska tester har generellt sett utvecklats för identifiering av en eller flera biotyp av B. tabaci, romanen lampa analysen omfattar hela B. tabaci arter komplexa8,16,17 ,18. Problemet med uttalad genetiska inom-taxon mångfalden av komplexet löstes med kombinationer av olika primer uppsättningar och tillämpningen av degenererade primers8. Romanen B. tabaci lampa assay är utformad på ett sådant sätt att primers rikta ett fragment i 3' slutet av mitokondriell COI gen8. Denna gen presenterar ett lämpligt mål för djur diagnostiska analyser eftersom det hamnar regioner bevarad tillräckligt för diagnostiska sensitiviteten för en specifik art, medan diskriminera nog mellan närbesläktade organismer19, 20. Dessutom COI genen används ofta som en genetisk markör i befolkningen genetiska studier och som en signatur sekvensen i DNA-streckkodning analyser, vilket resulterar i många DNA sekvens poster i öppen källkod databaser såsom GenBank och fet21 ,22. Bredvid den offentligt tillgängliga COI sekvenser från B. tabaci, COI sekvenser från närbesläktade arter (Aleurocanthus spp. [N = 2], Aleurochiton aceris, Aleurodicus dugesii, Bemisia spp. [N = 3], Neomaskellia andropogonis, Tetraleurodes acaciaeoch Trialeurodes spp. [N = 4]) var ingår i primer utformningen av denna studie och används för att bedöma diagnostisk sensitivitet och specificitet i silico8 .
På grund av riktigheten av metoden, dess hastighet (< 1 h) och enkelheten i protokollet, analysen har visat sig vara lämpliga för hotellets ansökan när den genomförs som en del av förfarandet för kontroll av import på schweiziska POE8.
Protocol
1. förberedelser
- Förbereda alikvoter av alkaliska DNA extraktionslösning.
- Producera ett bestånd av alkaliska DNA extraktionslösningen med vatten för molekylär användning kompletteras med 600 µM kaliumhydroxid (KOH) och 2 µM Cresol Red.
Varning: KOH är en stark bas löses i vatten. Undvik spill, och hud och ögonkontakt. - Dispensera 30 µL alkalisk DNA extraktionslösning (bereddes i steg 1.1.1) i 0,5 mL mikrocentrifugrör och lagra alikvoter vid 4 ° C.
Obs: Använd aliquoted DNA extraktionslösning inom 1 år.
- Producera ett bestånd av alkaliska DNA extraktionslösningen med vatten för molekylär användning kompletteras med 600 µM kaliumhydroxid (KOH) och 2 µM Cresol Red.
- Förbereda B. tabaci positiv amplifiering kontroll (PAC).
- Generera PCR-amplikoner av lampa mål DNA-fragment.
Obs: En introduktion till allmänna PCR principer och praxis ges av Lorenz23.- Syntetisera eller erhålla primers C1-J-2195 (5'-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3') och balkonger TL2-N-3014 (5'-TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA-3′) förstärka ett fragment av de mitokondriella COI gen24,25.
- Ställa in PCR-reaktionen som beskrivs i tabell 1. Använda DNA-extrakt (se steg 2.1) av referens B. tabaci provexemplar som DNA mall.
Obs: Valfritt, det är möjligt att extrahera den B. tabaci DNA för PAC hjälp en kommersiella kit enligt tillverkarens anvisningar. - Programmera en termocykel med följande villkor: 15 min vid 95 ° C; 45 cykler av 40 s vid 95 ° C, 15 s vid 45 ° C, ramp över 60 s till 60 ° C, 2 min vid 72 ° C; 7 min vid 72 ° C; Håll vid 4 ° C.
- Rengöring av PCR-amplifiering produkten med en kommersiell PCR sanering kit enligt tillverkarens protokollet och eluera den slutliga produkten i vatten för molekylär användning.
- Använd ett kommersiella kit med DNA-infoga färgämne att mäta DNA koncentrationen av PCR-amplifiering produkten enligt tillverkarens anvisningar och späd med molekylärbiologisk kvalitet vatten till en koncentration av 1 ng / µL. Förvara den utspädda PCR-amplifieringen produkt som PAC stamlösning vid-20 ° C.
Obs: Använd PAC stamlösning inom 1 år. - Komplettera PAC stamlösning (bereddes i steg 1.2.1.5) med 0,6 µM KOH och späd med molekylärbiologisk kvalitet vatten till en koncentration av 5 x 10-3 ng / µL. lagra produkten vid 4 ° C.
Obs: Använda PAC inom 5 h för beredning av den färdiga att använda B. tabaci lampa kits beskrivs i nästa steg.
- Generera PCR-amplikoner av lampa mål DNA-fragment.
-
Förbereda ready-to-use B. tabaci LAMP kit (protokoll för 20 enheter)
- Använd sax för att strimlat 8-tube lampa remsor två 4-tube lampa.
- Märk rören av 4-tube lampa remsorna enligt schemat visas i figur 1.
- Förbereda B. tabaci lampa reaktion mastermix (protokoll för 80 reaktioner).
- Tillsätt 1195.1 µL av ready-to-use GspSSD isotermiska master mix (innehållande GspSSD polymeras, pyrophosphatase, magnesiumsulfat, deoxinukleotider, dubbel strand bindande DNA bindande färgämne) och 717.4 µL av B. tabaci lampa primer mix till en 2 mL mikrocentrifug rör. Kort vortex och puls centrifug.
- Fördela 22,5 µL av B. tabaci lampa reaktion mastermix (bereddes i steg 1.3.3.1) i varje rör 4-tube lampa remsor (beredd i steg 1.3.1) och puls centrifug.
- Vortex B. tabaci lampa PAC (bereddes i steg 1.2) snabbt och puls Centrifugera. Lägg sedan till 2,5 µL i röret märkas med ”PAC” av varje 4-tube lampa remsa (figur 1).
- Stäng locken och store den redo-till-använda B. tabaci LAMP kit enheter vid-20 ° C.
Obs: Använd dem inom 1 år.
2. Hotellets lampa analys
- DNA-extraktion
- Använd sterila tandpetare för att överföra insekt exemplaren i 0,5 mL mikrocentrifugrör innehållande 30 µL av DNA extraktionslösning (bereddes i steg 1.1.2).
Obs: Se till att insekterna är nedsänkt i extraktionslösningen. - Inkubera proverna för 5 min vid 95 ° C i en thermomixer (300 rpm). Kort vortex och puls centrifug.
- Använd sterila tandpetare för att överföra insekt exemplaren i 0,5 mL mikrocentrifugrör innehållande 30 µL av DNA extraktionslösning (bereddes i steg 1.1.2).
-
B. tabaci lampa assay
- Tina en ready-to-use B. tabaci LAMP kit bereddes i steg 1.3. Vortex snabbt och puls centrifug.
Obs: Med varje kit, det är antingen möjligt testa två olika prover eller analysera DNA extrakt av ett prov i två exemplar. - Tillsätt 2,5 µL DNA provextrakt (bereddes i steg 2.1) in i rören märkt ”S1” och ”S2” av den färdiga att använda B. tabaci LAMP kit (figur 1).
- Tillsätt 2,5 µL av ren alkaliska DNA extraktionslösning (förberedd i avsnitt 1.1) i röret ”NAC” för negativ förstärkning kontroll (figur 1).
- Vortex den redo-till-använda B. tabaci LAMP kit snabbt och pulsera centrifug.
- Infoga den redo-till-använda B. tabaci lampa byggsatser till lampa analys enheten (med realtid fluorescens mätning) eller en realtids PCR-plattform och utföra en isotermiska DNA förstärkning analys vid 65 ° C i 60 min.
- Mäta smälttemperaturer DNA förstärkning produkter genom att värma upp till 98 ° C med en efterföljande kyla steget (ramp andelen 0,05 ° C/s) till 75 ° C, medan mätning fluorescens i realtid.
- Tina en ready-to-use B. tabaci LAMP kit bereddes i steg 1.3. Vortex snabbt och puls centrifug.
- LAMPAN assay avläsningssystem
- Validera den lampa avläsningssystem manuellt enligt följande.
- Om DNA kompletteringar mättes för provet och PAC, ingen DNA-amplifiering mättes för NAC, och glödgning temperaturen av förstärkning produkter var mellan 80,0 och 85,5 ° C, anser lampa resultaten som positiv (figur 2).
- Om det finns ingen DNA-amplifiering för prover (dvs rör märkta S1 och S2) men för PAC och NAC sedan överväga lampa resultatet som negativ (figur 2).
- Om DNA förstärkning mättes för proverna, men glödgning temperaturerna av motsvarande förstärkning produkter var utanför det intervallet 80,0 \u2012 85,5 ° C, eller PAC gav ingen DNA-amplifiering NAC gav en DNA-amplifiering, överväga lampa resultatet som OGILTIG (figur 2).
- Alternativt kan du validera den lampa avläsningssystem med programmet lampa validering (kompletterande fil 1).
- Definiera målarter och definiera antalet testade prover. Klicka på knappen ”Skapa rapport” .
- Överföra avläsning (DNA förstärkning Ja/Nej, glödgning temperatur förstärkning produkt, resultat av PAC och NAC) från hotellets lampa analys enheten eller realtids PCR-plattform till de motsvarande inmatningsfält av validering ansökan. Resultatet av valideringen visas omedelbart efter att ange data.
- Validera den lampa avläsningssystem manuellt enligt följande.
Representative Results
Under valideringen av B. tabaci lampa analysen var insekt exemplaren fångas upp i samband med regelbunden schweiziska kontroll importprocessen analyserade8. Exemplaren härstammar från åtta olika länder (Kanarieöarna, Dominikanska republiken, Israel, Malaysia, Marocko, Singapore, Thailand och Vietnam) och återspeglar den genetiska mångfalden av B. tabaci hittade på Europeiska POEs8. Alla lampa resultaten var cross-validerade av DNA streckkodning8.
Från totalt 80 prover analyseras av lampa, 75 exemplar (93,8%) identifierades korrekt som B. tabaci (true-positiva), två exemplar (2,5%) identifierades korrekt som inte B. tabaci (true-negativ) och tre exemplar (3,8%) identifierades felaktigt betraktas inte som B. tabaci (falsk-negativ) (tabell 2)8. Korrigera-negativa resultaten härstammar från två Trialeurodes vaporariorum exemplar, en icke-reglerade arter med hög risk att förväxlas med B. tabaci på POEs för växt produkter8. Baserat på dessa resultat beräknades följande mätningar av diagnostisk noggrannhet: testa specificitet (true-negativ ränta), 100%. testa känslighet (true-positiv ränta), 96,2%. testa effektivitet (andelen korrekta testresultat), 96,3% (tabell 2)8. Vid bedömningen av analytisk känslighet (detektionsgränsen), förstärks B. tabaci lampa analysen framgångsrikt prov DNA späds till 100 fg/µL över tre tekniska replikat (tabell 3).
En delmängd av analyserna (N = 13) utfördes enligt hotellets villkor på den schweiziska POE Zürich flygplats av växten hälsoinspektörer använder de färdiga att använda B. tabaci LAMP kit8. När cross-validerade i referenslaboratorium, alla resultat från på plats tester befanns vara rätt (testa effektivitet = 100%)8. Bedömning på plats lampa assay, var genomsnittlig tid för att positiv (tid tills en positiva resultat var tillgänglig) 38,4 ± 10.3 min (medelvärde ± standardavvikelse)8. En representativ DNA amplification plot och motsvarande glödgning derivatan från en B. tabaci lampa analys utförs enligt hotellets villkor visas i figur 3A och B. I det här exemplet identifierades korrekt prov ett och två B. tabaci indikeras av DNA förstärkning efter ca 30 min (figur 3A) tillsammans med de beräknade glödgning temperaturerna på ca 82 ° C (figur 3B).
Figur 1: visualisering av den experimentella uppbyggnaden av en ready-to-use B. tabaci LAMP kit beskrivs i protokollet. S1, prov 1; S2, prov 2; PAC, positiv amplifiering kontroll; NAC, negativ förstärkning kontroll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: lampa avläsningssystem validering schemat. PAC: positiv amplifiering kontroll; NAC: negativ förstärkning kontroll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: DNA amplification plot (A) och glödgning derivat (B) av en B. tabaci lampa analys utförs enligt hotellets villkor. Fluorescens mättes i relativ intensitet enheter. Grön linje, prov 1; orange linje, prov 2; blå linjen, negativ förstärkning kontroll (NAC); röda linjen, positiv amplifiering kontroll (PAC). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Komponent | Beståndet konc. | Slutliga reaktion konc | Volym per reaktion |
| Taq polymeras Master Mix | 2 x | 1 x | 10 ΜL |
| Primer C1-J-2195 | 20 ΜM | 0,4 ΜM | 0,4 ΜL |
| Primer balkonger TL2-N-3014 | 20 ΜM | 0,4 ΜM | 0,4 ΜL |
| Vatten för molekylär användning | - | - | 8,2 ΜL |
| DNA-mall | - | - | 1 ΜL |
Tabell 1: förberedelse av PCR-reaktionen mastermix för den B. tabaci positiv amplifiering kontroll. Komponenter och koncentrationer som behövs för att ställa in en PCR-reaktion. Den slutliga reaktionsvolym är 20 µL. Primer sekvenser visas i 1.2.1.1.
| N | NTP | NFP | NTN | NFN | SEN (%) | SPE (%) | EFF (%) |
| 80 | 75 | 0 | 2 | 3 | 96,2 | 100 | 96,3 |
Tabell 2: Resultat av B. tabaci LAMPAN assay validering. N, antal analyser; NTP, antal sant positiva resultat; NFP, antalet falskt positiva resultat; NTN, antal sant negativa resultat; NFN, antal falskt negativa resultat. SEN, diagnostiska känslighet; SPE, diagnostisk specificitet, EFF, testa effektivitet.
| CDNA (fg/µL) | NPR |
TP (min) (genomsnitt ± SD) |
TA (° C) (genomsnitt ± SD) |
| 1 x 105 | 3 | 33,5 ± 2,9 | 81,3 ± 0,1 |
| 1 x 104 | 3 | 30,7 ± 1,1 | 81 ± 0,0 |
| 1 x 103 | 3 | 40,4 ± 3.9 | 81,1 ± 0,1 |
| 1 x 102 | 3 | 50,7 ± 1,6 | 81,1 ±0, 1 |
| 1 x 101 | 0 | - | - |
| 1 x 100 | 0 | - | - |
Tabell 3: Analytisk känslighet (detektionsgränsen) i B. tabaci lampa assay. Varje spädningssteg testades i exemplar. CDNA, DNA-koncentration per reaktion; NPR, antal positiva replikerar; TP, tiden fram till ett positivt resultat var tillgängligt; TA, glödgning temperatur; SD, standardavvikelse.
Discussion
Förmågan att korrekt identifiera potentiellt skadliga organismer utan tidsfördröjning representerar en kritisk aspekt för förvaltningen av pest arter9,10,26. Förutom att vara snabb, för import växtprodukter, ska en idealisk pest identifieringsmetod vara enkelt att utföra på plats på POEs8,26. Detta papper rapporterar protokollet av en roman lampa analys för snabb identifiering av B. tabaci, en karantän insekt organism ofta fångas upp vid de europeiska gränserna (https://ec.europa.eu/food/sites/food/files/plant/docs/ph_biosec_europhyt _annual-rapport _2016.pdf).
Logiken bakom utvecklingen av det diagnostiska testet var att utforma ett lätt-att-följa-protokoll som kan utföras under förfarandet för kontroll av import av växt av hälsoinspektörer växt med minimal laboratorium utbildning. För att göra på plats tester som snabba och enkla som möjligt, är protokollet uppdelad i två delar, utarbetandet av en ready-to-use kit och den faktiska prestandan lampa analysens. Den första delen kan göras i ett externt laboratorium så att växten hälsovårdsinspektören kan utföra DNA-extraktion och lampa analys på plats med endast en pipettering steg.
Men bara ett steg, pipettering små mängder vätska kan vara utmanande för användare med liten eller ingen laboratorium erfarenhet. För att lösa problemet, läggs ett färgämne (kresol röd) till extraktionslösningen så att operatören kan visuellt bekräfta den liten beloppet (dvs. 2,5 µL) av DNA överförs korrekt till respektive röret. En annan viktig förenkling av protokollet är validering applikation som underlättar en tillförlitlig tolkning av den lampa avläsningssystem (kompletterande fil 1).
Romanen B. tabaci lampa assay har validerats enligt laboratoriet och hotellets villkor genom att testa insekt exemplaren fångas upp under regelbunden importen kontroll av Schweiz8. Totalt analyserades 80 exemplar från tre kontinenter, Afrika, Eurasien och Nordamerika, av lampan. Av 80 exemplar var endast tre (3,8%) felaktigt identifierade (falsk-negativ)8. När man analyserar de primer mål DNA-sekvenserna av falskt negativa exemplar, konstaterades det att de var nya B. tabaci haplotyper som hittills inte har beskrivs8. Baserat på dessa resultat, har B. tabaci lampa primer uppsättningen varit modifierade och framgångsrikt nytt validerade8.
En stor begränsning av någon DNA förstärkning-baserade metod inklusive lampa är att de endast identifiera fördefinierade mål DNA sekvenser8,27. En omfattande kunskap om den genetiska variationen i sekvensen primer mål är därför avgörande att säkerställa diagnostisk noggrannhet8,27. Sådan information är dock ofta mycket begränsad, särskilt när det gäller nya framväxande pest arter8. Men sällsynt, är falskt negativa resultat orsakas av mutationer i sekvensen mål beräknade8. När det gäller nuvarande B. tabaci lampa analysen är en lösning för detta problem i kombination med en DNA streckkodning-baserad teknik, en strategi som insåg under genomförandet av detta diagnostiska test på POE Zürich flygplats8. Här analyserades åter alla lampa-negativa resultat av DNA-streckkodning i ett externt laboratorium8. Om en roman pest haplotyp ännu inte beskrivs påträffas, kan lampa primers ändras med hjälp den DNA-sekvens som genereras i streckkodning processen8. Därmed, kompenseras förlusten av hastighet vid en negativ lampa resultat för maximal diagnostiska riktigheten garanteras i denna process i två steg8.
Där installationskostnaderna för nuvarande lampa analysen på en POE är cirka USD 25.000. Med det ökande antalet lampa tester utvecklats för skadegörare (t.ex. Erwinia amylovoraFlavescence dorée och Guignardia citricarpa), sådan en engångsinvestering visas motiverade13,15, 28. dock protokollet skulle potentiellt kunna ändras för att minska dessa kostnader ytterligare. Till exempel för de DNA-extraktionen kan steg vid 95 ° C thermo mixern används här ersättas genom ett billigare vattenbad eller genom att utföra det här steget direkt i realtid lampa enheten. Dessutom blandande stegen på vortex skulle förmodligen kunna ersättas av manuellt snärta rören och i DNA överföring steg den vi rekommenderar kan ersättas med steril inympning loopar.
Framtida förbättringar för en snabb identifiering av B. tabaci och pest arter kunde i allmänhet vara en implementering av en Hotellets sekvensering strategi som skulle tillåta för att utföra DNA-streckkodning analyser på POEs. En lovande kandidat system för sådan en implementering är den nanopore sekvensering tekniken. Ja, tekniken har nyligen genomförts framgångsrikt Hotellets DNA streckkodning för att bedöma den biologiska mångfalden i en regnskog8,29,30. Ett Hotellets identifieringssystem för DNA-streckkodning kan helt ersätta behovet av utveckling av riktade diagnostiska test och validering. Det kan också samla in ytterligare information om pest egenskaper såsom bekämpningsmedel motstånd gener8. Ändå tills romanen sekvensering teknik kommer att genomföras rutinmässigt, B. tabaci lampa analysen representerar en snabb (< 1 h) och korrekt identifieringsmetod.
Disclosures
Författaren Michael Andreou är aktieägare i OptiGene Limited som producerar reagens och instrument som används i denna artikel. De andra författarna inte har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna är tacksam till Annette Grendelmeier, Aurelia Drenovac, Cornelia Studer, Daniel Frei, Elisabeth Razavi, Markus Oggenfuss, Seraina Vonzun och Sven Moeller för deltagande i validering av B. tabaci lampa analysen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B. tabaci LAMP primer mix | OptiGene Ltd. | on request | For preparation of read-to-use B. tabaci LAMP kit |
| Centrifuge MiniSpin | Eppendorf AG | 5452000010 | For several centrifugation steps |
| Cresol red (red dye) | Sigma-Aldrich Corp. | 114472 | Component of DNA extraction solution |
| Eppendorf ThermoMixer | Eppendorf AG | 5382000015 | For DNA extraction |
| Genie II (on-site LAMP analysis device) | OptiGene Ltd. | Genie® II | For LAMP analysis |
| Genie Strips (8-tube LAMP strips) | OptiGene Ltd. | OP-0008-50 | For preparation of read-to-use B. tabaci LAMP kit |
| HotStarTaq Master Mix | Qiagen AG | 203443 | For generation of positive amplification control |
| Labcycler (Thermocycler) | SensoQuest GmbH, distributed by Witec AG |
011-103 | For DNA extraction |
| GspSSD Lyse n' Lamp Isothermal Mastermix | OptiGene Ltd. | ISO-001LNL | For preparation of read-to-use B. tabaci LAMP kit |
| Mini centrifuge Labnet Prism | Labnet International Inc. | C1801 | For several centrifugation steps |
| NucleoFast 96 PCR | Marcherey-Nagel GmbH | 743500.4 | For clean-up of positive amplification control |
| Potassium hydroxide solution | Sigma-Aldrich Corp. | 319376 | Component of DNA extraction solution |
| Qbit Fluorometer 3 | Thermo Fisher Scientific Corp. | Q33226 | For measuring DNA conentration of positive control |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | For clean-up of positive amplification control |
| Safe-Lock Tubes 0.5 mL (microcentrifuge tube) | Eppendorf AG | 0030 121.023 | For DNA extraction |
| Safe-Lock Tubes 2.0 mL (microcentrifuge tube) | Eppendorf AG | 0030 120.094 | For preparation of read-to-use B. tabaci LAMP kit |
| Wood Toothpicks | VWR International LLC | 470226-594 | For DNA extraction |
| Vortex-Genie 2 (Vortex) | Scientific Industries Inc. | SI-0236 | For several mixing steps |
References
- De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. Bemisia tabaci: a statement of species status. Annual Review of Entomology. 56, 1-19 (2011).
- Zhang, G. F., Lü, Z. C., Wan, F. H., Lövei, G. L. Real-time PCR quantification of Bemisia tabaci (Homoptera: Aleyrodidae) B-biotype remains in predator guts. Molecular Ecology Notes. 7 (6), 947-954 (2007).
- Boykin, L. M., De Barro, P. J. A practical guide to identifying members of the Bemisia tabaci species complex: and other morphologically identical species. Frontiers in Ecology and Evolution. 2, (2014).
- Cuthbertson, A. G. S., Vänninen, I. The importance of maintaining protected zone status against Bemisia tabaci. Insects. 6 (2), 432-441 (2015).
- Dalmon, A., Halkett, F., Granier, M., Delatte, H., Peterschmitt, M. Genetic structure of the invasive pest Bemisia tabaci: evidence of limited but persistent genetic differentiation in glasshouse populations. Heredity. 100 (3), 316-325 (2008).
- Dickey, A. M., Osborne, L. S., Shatters, R. G., Hall, P. A. M., Mckenzie, C. L. Population genetics of invasive Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) cryptic species in the United States based on microsatellite markers. Journal of Economic Entomology. 106 (3), 1355-1364 (2013).
- Bacon, S. J., Bacher, S., Aebi, A. Gaps in border controls are related to quarantine alien insect invasions in Europe. PLOS ONE. 7 (10), e47689 (2012).
- Blaser, S., et al. From laboratory to point of entry: development and implementation of a loop-mediated isothermal amplification (LAMP)-based genetic identification system to prevent introduction of quarantine insect species. Pest Management Science. 74 (6), 1504-1512 (2018).
- Floyd, R., Lima, J., de Waard, J., Humble, L., Hanner, R. Common goals: policy implications of DNA barcoding as a protocol for identification of arthropod pests. Biological Invasions. 12 (9), 2947-2954 (2010).
- Armstrong, K. F., Ball, S. L. DNA barcodes for biosecurity: invasive species identification. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 360 (1462), 1813-1823 (2005).
- Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research. 28 (12), E63 (2000).
- Tomlinson, J. A., Boonham, N., Dickinson, M. Development and evaluation of a one-hour DNA extraction and loop-mediated isothermal amplification assay for rapid detection of phytoplasmas. Plant Pathology. 59 (3), 465-471 (2010).
- Kogovšek, P., et al. LAMP assay and rapid sample preparation method for on-site detection of flavescence dorée phytoplasma in grapevine. Plant Pathology. 64 (2), 286-296 (2015).
- Lee, M. S., Su, T. Y., Lien, Y. Y., Sheu, S. C. The development of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays for the rapid authentication of five forbidden vegetables in strict vegetarian diets. Scientific Reports. 7, 44238 (2017).
- Bühlmann, A., et al. Erwinia amylovora loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay for rapid pathogen detection and on-site diagnosis of fire blight. Journal of Microbiological Methods. 92 (3), 332-339 (2013).
- Cavalieri, V., Manglli, A., Tiberini, A., Tomassoli, L., Rapisarda, C. Rapid identification of Trialeurodes vaporariorum, Bemisia tabaci (MEAM1 and MED) and tomato-infecting criniviruses in whiteflies and in tomato leaves by real-time reverse transcription-PCR assay. Bulletin of Insectology. 67 (2), 219-225 (2014).
- Baek, J. H., Lee, H. J., Kim, Y. H., Lim, K. J., Lee, S. H., Kim, B. J. Development of an antibody-based diagnostic method for the identification of Bemisia tabaci biotype B. Pesticide Biochemistry and Physiology. 131, 18-23 (2016).
- Hsieh, C. H., Wang, H. Y., Chen, Y. F., Ko, C. C. Loop-mediated isothermal amplification for rapid identification of biotypes B and Q of the globally invasive pest Bemisia tabaci, and studying population dynamics. Pest Management Science. 68 (8), 1206-1213 (2012).
- Rejili, M., et al. A PCR-based diagnostic assay for detecting DNA of the olive fruit fly, Bactrocera oleae, in the gut of soil-living arthropods. Bulletin of Entomological Research. 106 (5), 695-699 (2016).
- Hebert, P. D. N., Ratnasingham, S., deWaard, J. R. Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species. Proceedings. Biological Sciences. 270 (Suppl 1), 96-99 (2003).
- Ratnasingham, S., Hebert, P. D. N. bold: The Barcode of Life Data System (http://www.barcodinglife.org). Molecular Ecology Notes. 7 (3), 355-364 (2007).
- Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Bank Wheeler, D. L. G. en
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Simon, C., Frati, F., Beckenbach, A., Crespi, B., Liu, H., Flook, P. Evolution, weighting, and phylogenetic utility of mitochondrial gene sequences and a compilation of conserved polymerase chain reaction primers. Annals of the Entomological Society of America. 87 (6), 651-701 (1994).
- Simon, C., Buckley, T. R., Frati, F., Stewart, J. B., Beckenbach, A. T. Incorporating molecular evolution into phylogenetic analysis, and a new compilation of conserved polymerase chain reaction primers for animal mitochondrial DNA. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 37 (1), 545-579 (2006).
- Harper, S. J., Ward, L. I., Clover, G. R. G. Development of LAMP and real-time PCR methods for the rapid detection of Xylella fastidiosa for quarantine and field applications. Phytopathology. 100 (12), 1282-1288 (2010).
- Lauri, A., Mariani, P. O. Potentials and limitations of molecular diagnostic methods in food safety. Genes & Nutrition. 4 (1), 1-12 (2009).
- Tomlinson, J. A., et al. A loop-mediated isothermal amplification-based method for confirmation of Guignardia citricarpa in citrus black spot lesions. European Journal of Plant Pathology. 136 (2), 217-224 (2013).
- Branton, D., et al. The potential and challenges of nanopore sequencing. Nature Biotechnology. 26 (10), 1146-1153 (2008).
- Pomerantz, A., et al. Real-time DNA barcoding in a rainforest using nanopore sequencing: opportunities for rapid biodiversity assessments and local capacity building. GigaScience. 7 (4), giy033 (2018).
