Summary
Her præsenterer vi en protokol til generering af neutrofile ekstracellulære fælder (NETs) og operativ NETQUANT, en fuldautomatisk software option til kvantificering af net i immunofluorescens billeder.
Abstract
Neutrofile ekstrellulære fælder (NETs) er web-lignende antimikrobielle strukturer bestående af DNA og granulat afledte antimikrobielle proteiner. Immunofluorescens mikroskopi og billedbaserede kvantificeringsmetoder er fortsat vigtige værktøjer til kvantificering af neutrofile ekstracellulær fælde dannelse. Der er imidlertid væsentlige begrænsninger for immunofluorescens baserede metoder, som i øjeblikket er tilgængelige for kvantificering af garn. Manuelle metoder til billedbaseret netto kvantificering er ofte subjektive, tilbøjelige til at fejl og kedelig for brugere, især ikke-erfarne brugere. Også, i øjeblikket tilgængelige software muligheder for kvantificering er enten semi-automatiske eller kræver uddannelse før drift. Her viser vi implementeringen af en automatiseret immunofluorescence-baseret billed kvantificerings metode til at evaluere netto dannelsen kaldet NETQUANT. Softwaren er nem at bruge og har en brugervenlig grafisk brugergrænseflade (GUI). Det betragter biologisk relevante parametre såsom en stigning i overfladearealet og DNA: netto markør protein ratio, og nuklear deformation at definere netto dannelse. Desuden er dette værktøj er bygget som en frit tilgængelig app, og giver mulighed for enkelt-celle opløsning kvantificering og analyse.
Introduction
Neutrofiler er afgørende mediatorer af medfødte vært forsvar svar mod en bred vifte af mikrobielle patogener1. De udfører deres antimikrobielle funktioner ved at frigive deres granulat, der indeholder en bred vifte af antimikrobielle proteiner2, producerer reaktive ilt arter (ros) og hypochlorit1, og gennem fagocytose3. Desuden er Brink Mann et al. 4 beskrev neutrofile ekstracellulære fælder (NETs) som en ny mekanisme, hvormed neutrofiler fælde og eliminere invaderende patogener. Siden deres opdagelse lidt over et årti siden4, har NETs været impliceret i en bred vifte af infektiøse5,6 og ikke-infektiøse7 morbiditeter. NETTO dannelse er en aktiv proces og resulterer i ekstrudering af kromatin DNA belagt med granulerede antimikrobielle proteiner8. Nogle af de vigtigste ændringer i cellulære og nukleare morfologi forbundet med netto dannelse omfatter tab af nuklear morfologi, kromatin dekoncentration, mobilisering af granulat proteiner fra cytoplasmaet til kernen og en stigning i den nukleare og cellulære diameter8,9.
De web-lignende net, som kan fremstå som diffuse strukturer lidt større end cellen eller som strukturer flere gange større end en enkelt neutrofile betragtes som indikatorer for netosis5,10. Ved hjælp af Fluorescens mikroskopi kan NETs påvises ved sondering af DNA med en fluorescerende sonde såsom 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) og ved immunofluorescens farvning mod NET-bundne proteiner såsom neutrofilelastase. Kvantificering af overlappende områder for farvning af DNA og NETBUNDNE proteiner bestemmer det samlede areal under garn i et billede11.
En række billedanalyse muligheder er tilgængelige til at udføre fluorescens billedbaserede kvantificering af NETs11,12. Men disse software muligheder nuværende begrænsninger i ikke at være brugervenlig og/eller fuldt automatiseret. I denne artikel demonstrerer vi driften af NETQUANT13, en frit tilgængelig app, der kan udføre upartisk fuldt automatiseret immunofluorescens mikroskopi billedbaseret netto kvantificering. Den app har en brugervenlig grafisk grænseflade (GUI) og kan udføre en enkelt celle analyse. Softwaren kvantificerer Netose i et billede ved at detektere de morfologiske ændringer i området af DNA-NET-bundet markør, kromatin dekompensation forbundet deformation af kernen og stigning i DNA: netto-bundet protein ratio. Tilsammen giver de flere netto definitionskriterier mulighed for en stringent netto kvantificering på tværs af flere datasæt på en upartisk måde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den etiske komité på Lunds Universitet godkendte indsamlingen af venøs blod fra raske frivillige i overensstemmelse med Helsingfors-erklæringen (2013/728). Alle frivillige meddelte deres skriftlige samtykke.
1. isolering af perifert blod neutrofiler ved hjælp af tæthed-gradient centrifugering
- Indsamle humant venøs blod i rør, der indeholder heparin og tillade rørene at nå stuetemperatur.
Bemærk: der kræves mindst 16 mL blod fra en sund donor for at give en tilstrækkelig stor celle pellet. - Bland blodet med et volumen på 2% dextran i saltvand (0,9% NaCl) og gør det muligt at sediment ved stuetemperatur i 30 minutter i et sterilt 50 mL konisk centrifugeglas.
- Supernatanten indsugning i et sterilt 50 mL konisk centrifugeglas og centrifugeres ved 200 x g i 10 minutter ved 4 °C.
- Fra dette trin fortsætter isolationen ved 4 °C eller på is.
- Resuspension af pellet i 5 mL iskold saltvand og lag oven på 5 mL leukocyt isolations gradient (9,1% natriumdiatrizoat med 5,7% dextran, w/v) i et sterilt 15 mL konisk centrifugeglas.
- Centrifuger i 30 min ved 400 x g ved 4 °C.
- Aspirér supernatanten, og kassér den.
- Røde blodlegemer ved at resuspendere pellet i 3 mL iskold vand i 30 s. Tilsæt straks 1 mL 3,6% NaCl og fyld derefter 10 mL iskold saltopløsning.
- Centrifuger cellesuspensionen i 10 minutter ved 350 x g.
- Fjern supernatanten, Saml celle pellet og resuspension det i 1 mL saltvand. Der afsættes 10 μL i et mikrocentrifuge glas til vurdering af cellernes antal og levedygtighed ved hjælp af trypan og et Blue i et Bürker kammer.
- Tilsæt 10 μL cellesuspension til 90 μL 0,4% trypan og et blå opløsning. Tag 10 μL af cellesuspensionen i et Bürker-kammer. Tæl cellerne i de 4 firkanter bundet af 3 linjer i hvert hjørne af kammeret. Celler, der vises mørkeblå til optagelsen af farvestof er ikke-levedygtige, udelukke dem fra det samlede celle nummer.
- Udtryk celle nummeret som celler/mL som defineret ved ligningen nedenfor.
Bemærk: her var kammer faktoren 10.000, fortyndingsfaktoren var 10, og det samlede antal firkanter var 4. - Den resterende cellesuspension fortyndes til 10 mL til et endeligt vaske trin.
- Centrifuger i 5 minutter ved 200 x g.
- Resuspension af neutrofiler i RPMI-1640 med 2 mg/mL varme inaktiveret humant serumalbumin (HSA) i en koncentration på 5 x 105 celler/ml.
2. klargøring af Dæksedler og stimulering af neutrofiler
- Placer en dækseddel (10 mm, #1) i hver brønd af en 12-brønd plade og frakke dæksedlen ved at tilføje 200 μL 0,01% poly-L-lysin opløsning og lad det være ved 37 °C natten over.
- Vask dæksedlerne med 300 μL fosfatbuffer saltvand (PBS) én gang, og lad det tørre.
- Tilsæt 400 μL 5 x 105 neutrofiler/ml til hver brønd og Inkuber ved stuetemperatur i 15 minutter.
- Pladen, der indeholder neutrofiler, flyttes til en inkubator ved 37 °C med 5% CO2 i 15 min.
- Fjern supernatanten. Tilsæt 400 μl forvarmede rpmi-1640 medium med 2 mg/ml HSA til kontrol. Tilsæt 300 μL forvarmet RPMI med 20 nM phorbols 12-myristat 13-acetat (PMA) til stimulation.
- Neutrofiler stimuleres i 150 min ved 37 °C med 5% CO2.
3. visualisering af NETs
- Fjern supernatanten og vask prøverne 2x med 200 μL PBS.
- Stikprøverne ved at tilsætte 200 μL 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i PBS i 20 min ved 37 °C.
Bemærk: PFA er giftig og skal håndteres med omhu. - Vask prøverne 3x med 200 μL PBS.
- Permeabilize prøverne ved at tilføje 50 μL 0,5% Triton X-100 for 30 s.
- Prøverne vaskes 3x med 200 μL PBS.
- Prøverne blokeres med 5% gede serum i PBS i 1 t ved 37 °C.
- Der tilsættes 300 μL primær kanin-anti humant neutrofilelastase i blokerende opløsning ved en fortynding på 1:500 til 90 min ved 37 °C.
- Prøverne vaskes 3x med 300 μL PBS.
- Tilsæt 300 μL sekundær ged anti-kanin fluorescerende antistof ved en fortynding på 1:1000 for 90 min ved 37 °C.
- Vask dæksedlerne 3x med 300 μL PBS.
- Fjern dæksedlerne fra brøndene og monter dæksedlen med 10 μL monterings medium, der indeholder DAPI. Opbevares natten over ved stuetemperatur i mørke for at tørre prøverne.
Bemærk: farvning af DNA med DAPI er helt sikkert et kritisk skridt i metoden. Brugerne kan også foretage fejlfinding ved at tilføje eksogene DAPI-opløsning i et endeligt koncentrationsområde på 0,1 \ u 20120.5 μg/mL for 2 \ u20123 min, efterfulgt af 3 vaske trin med 300 μL PBS. - Erhverve billeder med et bredt felt fluorescens mikroskop ved hjælp af en 20X mål.
4. analyse og kvantificering af net med NETQUANT
Bemærk: NETQUANT kan downloades ved at klikke på installationsfilen fundet på Zenodo GitHub Archive eller Nordenfelt Lab hjemmeside (https://Nordlab.med.lu.Se/?page_id=34).
- Import af datasæt til analyse, navngivning af kanaler og konvertering af billeder
- Åbn fanen Opsætning i NETQUANT.
- Vælg kildemappen til analyse ved at klikke på indstillingen Hent kurve i menuen kilde, og Vælg mappen med de billedsekvenser, der skal analyseres.
- Klik på indstillingen Hent kurve i menuen mål, og Vælg mappen til lagring af dataene efter billedanalysen.
- Navngiv kanalerne, så "DNA-kanalen" svarer til DNA-farvning (f. eks. DNA eller dapi) og "net-Channel" SKILDRER den netbundne protein farvning (f.eks. net, neutrofilelastase) i billederne. For en velfungerende software, (anbefales) navngive den mappe, der indeholder kontrol billedfiler som "Control".
Bemærk: netkanalen refererer kun til den netbundne granulat protein markør. - Feed billedets metadata i softwaren ved at klikke på knappen Indlæs billedoplysninger i undermenuen billedoplysninger .
- Vælg den korrekte kanalrækkefølge, der er indeholdt i billederne i undermenuen kanalrækkefølge . Denne mulighed er medtaget som en fejlsikker for at forhindre utilsigtede mismatch.
- Hent primære billedegenskaber fra RAW-dataene, og konverter billederne ved at klikke på knappen Forbered data. De konverterede billeder vises i undermenuen prøvetype . Klik på menuen eksempel type for at vise og vælge alle datasæt, som er anskaffet til analyse.
- Vælg et billede i undermenuen eksempel type , og klik på knappen Vis billeddata for at få vist de billeder, som er opdelt i henholdsvis DNA og net Channel.
- Segmentering af celler i DNA-kanalen og NETKANALEN
- Vælg segmenterings metoden ved at klikke på undermenuen metode i både DNA-kanalen og netkanalen.
Bemærk: standardmetoden for segmentering er indstillet til adaptiv og er den anbefalede indstilling. Andre muligheder er også tilgængelige, herunder global, Edge og Chan-Vese. En vandskel mulighed er også inkluderet for at hjælpe med at skelne mellem tæt placerede celler eller net. - Angiv fanen segmentering for at segmentere kontrol celler først i begge kanaler ved at klikke på indstillingen målgruppe kontrol eksempler .
- Vælg PMA i undermenuen eksempel type, og klik på indstillingen batch (anbefales) for at begynde segmentering af alle billeder, der er inkluderet i datasættet. Vælg billederne i menuen eksempel type, og klik på knappen Vis billeddata for at visualisere og validere de binære billed MASKER (DNA-MASKE og net mask), der genereres efter segmentering.
- Vælg segmenterings metoden ved at klikke på undermenuen metode i både DNA-kanalen og netkanalen.
- Enkelt celle analyse af identificerbare egenskaber
- Angiv fanen analyse, og analysér kontrol eksemplerne ved at klikke på knappen Bestem tærskel .
- Skift eksempeltypen til PMA, og klik på knappen Hent celleegenskaber for at fuldføre analysen af stimulerede prøver.
- Vælg et billede fra undermenuen eksempel type , og klik på knappen Vis billeddata for at få vist overlejringen og antallet af celler og netto dannende celler i billedet.
- Sammenligning af celleegenskaber for at identificere netto dannende celler
- Vælg eksempel i undermenuen eksempel type, og klik på knappen Analysér NETs for at fuldføre analysen. Individuelle billeder kan vælges fra undermenuen prøvetype til analyse eller hele batch af billeder kan analyseres ved at vælge batch option (anbefales).
- Juster netto kriterierne manuelt for at give optimale resultater for en given prøve. Sammenlign identificerede net med de originale billeder for at vurdere kvaliteten af identifikationen.
Bemærk: netto kriterierne kan derefter bruges på tværs af alle billeder i datasættet. Eventuelle ændringer i netto kriterierne anvendes samtidigt på tværs af alle kontrolprøver. Dette begrænser muligheden for eventuelle forskelle, der kan opstå som følge af over montering af netto parametrene. Indstillingerne i netto kriterierne kan justeres i henhold til brugerens krav. Forholdet mellem falske opdagelse satser og NETQUANT er blevet udforsket tidligere13. Typiske intervaller for arealforøgelse er 2 \ u20124, cirkularitet at være 0,7 \ u 20120.9 og DNA/netto forholdet til at være 0,6 – 2,0. - Undersøg dataoversigten i undermenuen celledata , hvor antallet af billeder, celletal pr. billede og procentdel af NETs pr. billede vises.
Bemærk: den samlede procentdel af NETs i hele datasættet vises med "NET-gauge". Det samlede antal billeder, celletal, andelen af garn i prøven (NETs%) og NETs% i kontrolprøven vises i oversigts statistiktabellen under netto måleren. Vi anbefaler, at kontroldataene rapporteres sammen med de data, der er indhentet fra stimulerede prøver.
- Resultat udgange
- Angiv fanen output for at vælge og få vist resultat output.
- Udforsk og Sammenlign de forskellige data output genereret fra analysen af kontrol og PMA ved at vælge formen af output og klikke på output resultater knappen.
Bemærk: alle data, der genereres efter analyse for både kontrolelementer og stimuleringer, gemmes i analyse mappen som valgt i målunder menuen. Data gemmes i enten. csv-eller. pdf-format. - Start metode filen for at hente den version af softwaren og de net-kriterier, der bruges til analysen (medtages i afsnittet metoder til publikations formål).
- Klik på resultatdata tabellen for at visualisere de enkelte datapunkter i en given prøve.
- Visualiser NET Area distribution og DNA: netto ratio i prøverne. Den røde linje angiver tærskelværdien i graferne.
- Bestem netto området versus form af DNA ved at klikke på den bivariate distribution fil.
- Indlæser tidligere analyse og batch alle trin
- Indlæs tidligere vellykkede analyseindstillinger i NETQUANT ved hjælp af knappen Indlæs forrige analyse .
- Brug knappen batch alle trin , der er inkluderet i opsætnings menuen, til at køretrin 5 \ u201212 (figur 1, figur 2, figur 3, figur 4, figur 5) direkte for at opnå det endelige output.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
5 x 105 neutrofiler/ml blev seedet på dæksedler anbragt i en 12-brønd plade og stimuleret med enten 20 Nm PMA eller venstre ustimuleret i 150 min. Prøverne blev derefter plettet ved hjælp af primære kanin anti-humane neutrofile elastase antistoffer, sekundær ged anti-kanin fluoroforet konjugeret antistoffer og dapi-en fluorescently mærket farvestof, der pletter DNA (Se tabellen over materialer for detaljer). Mindst 5 billeder blev derefter erhvervet ved hjælp af et epifluorescens mikroskop og en 20X (NA = 0,75) mål. Eksempeldata, der bruges til test analysen i manuskriptet, kan downloades ved at følge linket https://Nordlab.med.lu.Se/?page_id=34 og klikke på eksempel datasætikonet.
Her beskriver vi muligheden for NETQUANT workflow (figur 1) for at KVANTIFICERE netto dannelsen i en given prøve. Softwareværktøjet kan installeres som en app i MATLAB og kan bruges uden tidligere kendskab til denne grænseflade. GUI af NETQUANT blev brugt til at analysere datasæt som beskrevet ovenfor. Alle billeder, der bruges til analyse af NETQUANT, efterlades altid uændret i den overordnede mappe. GUI er opdelt i 4 faner-opsætning fanebladet, segmentering fanebladet analyse og resultater output fane. Prøverne blev forberedt til analyse under opsætningsfanen (figur 2). Filstierne (1), navngivningskonventionerne (2), billedoplysninger (3) og kanal ordrer (4) defineres af brugeren. Indstillingen Forbered data (5) sikrer, at konverteringen og organisationen på en standardiseret måde i hele eksperimentet. Segmenterings parametrene var angivet under fanen segmentering (figur 3) for at identificere individuelle celler i prøverne (6). Kontrolprøverne segmenteres altid først (7) før segmentering af stimulerede prøver (8). Alle anbefalede værdier for segmentering er angivet under fanen software. De egenskaber, der definerer ustimulerede kontrol celler, erhverves først (9) og derefter sammenlignet med PMA-stimulerede celler (10) (figur 4). NETs analyseres derefter i prøverne baseret på netto kriterierne (11) og vises med det samlede antal billed tællinger, celletal og tilsvarende NETs% i kontrolprøverne. De endelige data output fra analysen blev udvalgt og derefter visualiseret (figur 5). En indstilling til indlæsning og brug af en tidligere vellykket analyse, og en batch-All mulighed for at behandle grupper af trin 5-12 (figur 1, figur 2, figur 3, figur 4, figur 5) er også medtaget i setup fane.
I løbet af analysen blev i alt 2619 celler analyseret i forsøget. PMA-stimulerede neutrofiler var i stand til at generere 90,59% garn (NETs%) i modsætning til 25,87 NETs% i kontrolprøverne (figur 6). Billedanalysen blev gennemført inden for 10 minutter for at starte arbejdsprocessen på softwaren. Kort sagt, NETQUANT giver en hurtig og bekvem mulighed for at kvantificere netto dannelse i billeder, der er erhvervet ved hjælp af immunofluorescens mikroskopi.
Figur 1: oversigt over NETQUANT workflow. Fluorescerende mikrografer af humane neutrofiler, der er dobbelt farvede med anti-elastase og DAPI (DNA), behandles først og omdannes. Billederne segmenteret derefter, efterfulgt af analyse af celleegenskaber, detektering af net og resultat udgange. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: opsætnings fane indstillinger i NETQUANT. Filstier for de datasæt, der skal analyseres, og data output mapper indtastes først under fanen Opsætning (1). Navngivningskonventionerne udfyldes derefter for at definere kanalnavne og navnet på kontrol mappen (2). Billedinformationen erhverves derefter (3) efterfulgt af navngivning af den korrekte kanalrækkefølge (4). Den korrekte opsætning af alle felter anbefales før behandling af datasæt (5) for standardiseret Billedkonvertering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: segmenterings fane parametrene i NETQUANT. De parametre, der anvendes til segmentering af både DNA-kanal og NET-protein markør omfatter metode, følsomhed, iterationer, minimum område og vandskel (6). Det anbefales at anvende en adaptiv segmenterings metode og et vandskel. Andre indstillinger, der leveres som forudindstillinger i softwaren, kan også bruges uden ændringer til de fleste formål. Kontrolprøverne segmenteres først (7), og derefter segmenteres de stimulerede prøver (8). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: påvisning af net under fanen analyse. Celleegenskaberne, der definerer ustimulerede celler, analyseres og anskaffes fra kontrolprøver (9). Dette efterfølges af analysen af celleegenskaberne i forsøgs prøverne (10). NETTO definitionskriterierne (fold stigning i cellulært område, nuklear deformation (værdier 0 til 1) og DNA-farvnings område/NET-markør farvnings område) påføres både kontrol og stimulerede prøver for at definere netto dannelsen (11). Antallet af net, det samlede antal celler og antallet af billeder i begge prøver vises i oversigts statistik sektionen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: visualisering af resultat output filer i NETQUANT. De opnåede resultater efter analyse kan vælges af den enkelte bruger. Resultat outputtet, der kan genereres med NETQUANT, indeholder en. csv-fil, der indeholder datapunkter fra individuelle celler. Også histogrammer skildrer fordelingen af celler undergår stigning i NET (cellulære) område, deformation af kernen på grund af kromatin dekoncentration og DNA: NET-markør ratio, og en 3D graf af nettoareal versus nuklear deformation er også genereret i analysen. Alle udgange gemmes automatisk i den analyse mappe, der er valgt under fanen Opsætning som. csv-,. pdf-og. txt-filer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: analyse af netto dannelsen. A) de NETs%, det samlede antal celler og antallet af billeder fra testdata sættet, som er observeret i sammenfattende statistikker for kontroller og PMA-stimulerede (20 nm) neutrofiler. B) en side om side-sammenligning af histogrammer, der skildrer stigningen i arealet, nuklear deformation (værdier 0 til 1) og DNA/netto ratio i kontrol-og PMA-stimulerede prøver. Den røde linje i histogrammer-tærskelværdierne for netto definitionskriterierne. (C) sammenligning af 3D graf af nettoareal versus nuklear deformation genereret af NETQUANT analyse af kontrol og PMA-stimulerede prøver. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Netto dannelsen er en relativt nylig tilføjelse til det mangfoldige neutrofiltal,4 og der har været en mærkbar bølge af interesse for at studere virkningen af NETs i en bred vifte af forskningsområder5,7,14,15. Erhvervelse af billeder ved hjælp af immunofluorescens mikroskopi og efterfølgende billedbaserede kvantificering er en meget anvendt metode til kvantificering af NETs. Denne fremgangsmåde har den fordel, at det er muligt at påvise celler, der danner net på et enkelt celleniveau, og derfor bedre kan reducere baggrunds signalet. Manuelle metoder til kvantificering kan være udtømmende, langsom og underlagt bruger bias. Et par semi-automatiske muligheder findes, der har givet brugerne med pålidelig analyse11,12. Men, de kan kræve betydelige tekniske færdigheder for drift eller kan kræve flere manuelle trin til kvantificering. Dette er udfordrende især for tidligere ikke-erfarne brugere. I en nylig publikation er der anvendt en fuldautomatisk beregningsmetode til at kvantificere netto dannelsen ved hjælp af flowcytometry-baseret billeddannelse samt tynde vævs sektioner. Den kan dog kun anvendes på specifikke scenarier og kræver også en betydelig viden om programmering for operation16. I øjeblikket er fuldautomatiseret billed kvantificering software dedikeret til generel netto kvantificering, der er let at bruge og besidder enkelt celle opløsning kapacitet er utilgængelig for forskere.
Her præsenterer vi NETQUANT, en fuldt automatiseret netto kvantificering software, der er frit tilgængelige. Denne software er udviklet specifikt til at kvantificere netto dannelse med høj strenghed ved hjælp af immunofluorescens mikroskopi billeder, og med evnen til at udføre enkelt celle analyse og kvantificering. Ud over at betragte stigningen i farvnings området under garn tager NETQUANT også hensyn til nuklear deformation som følge af deformering af kromatin og en forøgelse af samlokaliseringen af DNA/NET-markør protein for at definere netto dannelsen i en given prøve. Dette giver mulighed for at skelne celler, der kun har undergået nuklear dekompensation fra celler, der har gennemgået fuldstændig netto dannelse. NETTO definitionskriterierne i NETQUANT-algoritmen giver mulighed for højere strenghed i kvantificering i forhold til mange tidligere kvantificerings tilgange, der udelukkende beror på en stigning i netto farvnings arealet.
GUI er beregnet til at være brugervenlig og enkel at bruge. Hvert trin i analysen nummereres for at sikre, at brugerne kan følge arbejdsprocessen. En af de vigtigste funktioner i softwaren er segmenterings værktøj/fane, der tillader NETQUANT at udføre enkelt celle analyse i billeder, hvilket er den højest mulige følsomhed, der kan opnås. Dette gør NETQUANT til en af de få tilgængelige muligheder, der kan udføre enkelt celle kvantificering for at kvantificere netto dannelsen. Desuden har Mohanty et al. vist, at softwaren også kan tilpasse sig billed variationer og anskaffelses parametre13. På grund af den fleksibilitet, der tilbydes i segmenterings-og netto definitionskriterierne, kan donor-og plade variationer imødekommes. NETQUANT kan håndtere store datasæt tilstrækkeligt og kan bruges til pålidelig billedanalyse med høj gennemløb13.
Selvom vi fandt arbejdsprocessen til at give solide resultater fra flere donorer, anbefaler vi, at brugeren beslutter sig for de relevante værdier baseret på de enkelte prøver. I teorien kunne de data, der genereres efter analysen, også påvirkes af høj celletæthed. Desuden kan overdreven aggregering af garn resultere i en reduktion af antallet af registrerede net. Dette skyldes, at segmenterings algoritmen ikke kan skelne mellem sammenfiltrede net og separate hændelser. Et lignende problem med segmentering kan også opstå, når ustimulerede neutrofiler er fanget i nettene. Brugen af billeder, der er erhvervet ved 20X og 40X, anbefales i øjeblikket, da NETQUANTS ydeevne ikke er blevet testet ved andre forstørrelsesniveauer. Men så længe pixelstørrelsen er indstillet korrekt (enten manuelt eller fra metadata i afsnittet Indlæs billedoplysninger), skal softwaren tilpasse område beregningerne nøjagtigt til højere eller lavere forstørrelser. Korrekt farvning af DNA og granulet markør er en kritisk faktor. Dårlig farvning eller dårlig billedkvalitet i begge kanaler vil resultere i suboptimale resultater. Derfor anbefales det, at brugeren fastlægger et passende celle nummer, farvnings procedure og antistoftiter for at give optimale resultater.
NETQUANT er kun blevet testet på net afledt af humane neutrofiler in vitro. Garn fra andre arter kan også kvantificeres med passende korrektioner i kriterierne. NETTO kvantificering kan udføres på faste prøver i kammer glider eller multi-brønd glasbund plader. Billeder af høj kvalitet af prøver farves for DNA og granulat protein markører er afgørende. NETQUANT kan også tilpasses til at kvantificere andre former for ekstracellulære fælder (ET)-Ose, f. eks, som udstillet af eosinofile. Kvantificering af ETs i ikke-granulocytter såsom monocytter er i øjeblikket ikke muligt som cytoplasmisk granulet farvning område er påkrævet for segmentering algoritme.
Afslutningsvis, NETQUANT er et simpelt, automatisk og hurtigt værktøj til præcist at identificere netto dannelse, der giver mulighed for en enkelt celle analyse og kvantificering. Vi mener, at denne software kan sænke barrieren for at udføre automatisk netto kvantificering, og at forskersamfundet vil drage fordel af denne frit tilgængelige app.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
TM og PN har et patentanmeldt i forbindelse med de algoritmer, der anvendes i NETQUANT.
Acknowledgments
Arbejdet blev finansieret af Crafoord Foundation (TM og PN), den svenske regerings forskningsbevilling (PN, TM), det svenske Forskningsråd (PN) og Groschinsky Foundation (TM, PN).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer Heparinised plastic tubes | BD Biosciences | 367885 | |
| Lymphoprep | Axis-Shield | 114547 | |
| RPMI-1640 with L-Glutamine | Gibco | 11835-030 | |
| 50mL conical flasks | Sarstedt | 62.547.004 | |
| 15mL conical flasks | Sarstedt | 62.554.002 | |
| 12-well Tissue culture plates | Falcon | 10626491 | |
| #1 Coverslips 10mm | Menzel Glaser | CS10100 | |
| Glass slides | Menzel Glaser | 631-0098 | |
| Primary anti-human elastase | DAKO | DAKO rabbit 1373, contract immunization | |
| Secondary fluorophore conjugated goat anti-rabbit | Life technologies | A-11072, A-11070 | |
| PROLONG-Gold Antifade reagent with DAPI | Life technologies | P36930 | Mounting medium |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | 79346 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Nikon Ti-E Epifluorescence microscope | Nikon | ||
| CCD camera | Andor Zyla | ||
| Plan Apochromat 20x, 40x objectives | Nikon | ||
| Windows 10 | Microsoft | Operating system | |
| macOS Sierra 10.12 | Apple | Operating system | |
| MATLAB | Mathworks |
References
- Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nature Immunology. 15 (7), 602-611 (2014).
- Borregaard, N., Cowland, J. B. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte. Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).
- Nordenfelt, P., Tapper, H. Phagosome dynamics during phagocytosis by neutrophils. Journal of Leukocyte Biology. 90 (2), 271-284 (2011).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Sorensen, O. E., Borregaard, N. Neutrophil extracellular traps - the dark side of neutrophils. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).
- Yipp, B. G., Kubes, P. NETosis: how vital is it? Blood. 122 (16), 2784-2794 (2013).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23 (3), 279-287 (2017).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
- Mohanty, T., et al. A novel mechanism for NETosis provides antimicrobial defense at the oral mucosa. Blood. 126 (18), 2128-2137 (2015).
- Hakkim, A., et al. Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation. Nature Chemical Biology. 7 (2), 75-77 (2011).
- Brinkmann, V., Goosmann, C., Kuhn, L. I., Zychlinsky, A. Automatic quantification of in vitro NET formation. Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).
- Coelho, L. P., et al. Automatic determination of NET (neutrophil extracellular traps) coverage in fluorescent microscopy images. Bioinformatics. 31 (14), 2364-2370 (2015).
- Mohanty, T., Sorensen, O. E., Nordenfelt, P. NETQUANT: Automated Quantification of Neutrophil Extracellular Traps. Frontiers in Immunology. 8, 1999 (2017).
- Kaplan, M. J., Radic, M. Neutrophil extracellular traps: double-edged swords of innate immunity. Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).
- Cedervall, J., Olsson, A. K. Immunity Gone Astray - NETs in Cancer. Trends in Cancer. 2 (11), 633-634 (2016).
- Ginley, B. G., et al. Computational detection and quantification of human and mouse neutrophil extracellular traps in flow cytometry and confocal microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 17755 (2017).
