Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Automatiseret billedbaseret kvantificering af neutrofile ekstracellulære fælder med NETQUANT
Chapters
Summary November 27th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Her præsenterer vi en protokol til generering af neutrofile ekstracellulære fælder (NETs) og operativ NETQUANT, en fuldautomatisk software option til kvantificering af net i immunofluorescens billeder.
Transcript
Her præsenterer vi NETQUANT, en fuldautomatisk tilgang til kvantificering nets og immunofluorescens billeder. Dette vil hjælpe forskere med at foretage sammenlignelige billedanalyser fra data genereret af flere brugere og betingelser. Fordelene ved denne teknik er brugervenligheden, enkeltcelledataanalyse, flere kriterier for at evaluere NET-formation og en upartisk analyse af flere billeder.
Installer og åbn analysesoftwaren. En opdateret version kan findes på Zenodo GitHub arkiv, eller Nordonfelt Lab hjemmeside. Vælg en kildemappe til analyse under fanen Opsætning ved at klikke på indstillingen hent sti i kildemenuen.
Vælg den mappe, der indeholder de billedsekvenser, der skal analyseres. Igen skal du klikke på indstillingen hent sti i målmenuen, og vælg destinationsmappen for at gemme dataene efter billedanalyse. Dernæst, når du bruger separate kanal billeder, navn kanalen mapper, således at DNA-kanal svarer til den nukleare DNA-pletten, og NET-kanalen skildrer neutrofil elastase plet i billederne.
Navnd også på den mappe, der indeholder kontrolfilerne, som kontrolelement. Klik derefter på knappen Indlæs billedoplysninger, og indlæs billedmetadataene i softwaren. Vælg derefter den korrekte kanalrækkefølge i kanalrækkefølgen i undermenuen.
Dette hjælper med at forhindre utilsigtede uoverensstemmelser. Klik nu på knappen Forbered data for at hente primære billedegenskaber fra de rå data og konvertere billederne. De konverterede billeder vises derefter i undermenuen for eksempeltyper.
Klik på eksempeltypemenuen, vælg et billede i undermenuen, og klik på vis billeddata for at få vist billederne opdelt i henholdsvis DNA og Neutrophil Extracellular Trap eller NET-kanalen. Hvis du vil segmentere cellerne i deres respektive kanaler, skal du vælge fanen segmenteringsmetode og vælge en metode i menuen metodeunder for både DNA- og NET-kanalerne. Standardsegmenteringsmetoden er indstillet til adaptiv og er den anbefalede indstilling.
Andre muligheder er tilgængelige i softwaren, herunder global kant og chanverse. Der er også medtaget en vandskelindstilling for at hjælpe med at skelne mellem tæt placerede celler eller NET'er. Klik også på indstillingen for segmentering af kontroleksempler.
Vælg derefter PMA fra eksempeltypeundermenuen, og klik på batchindstillingen for at begynde segmenteringen af alle billeder, der er inkluderet i datasættet. Vælg derefter billederne i eksempeltypemenuen, og klik på knappen vis billeddata for at visualisere og validere de binære billedmasker for både dna- og NET-masker, der er genereret efter segmentering. Klik nu på knappen af afgørende tærskel under analysefanen for at analysere kontroleksemplerne.
Derefter, på højre side, ændre prøven type til PMA og klik på get celle egenskaber knappen for at fuldføre analysen af de stimulerede prøver. Vælg derefter et billede i undermenuen af eksempeltypen, og klik på knappen vis billeddata for at få vist overlejringen og antallet af celler og NET-dannende celler i billedet. Begynd med at vælge eksemplet i undermenuen for eksempeltypen.
Individuelle billeder kan vælges fra prøvetypens undermenu til analyse, eller hele batchen af billeder kan analyseres ved at vælge batchindstillingen. Når du er valgt, skal du klikke på knappen Analysér NETs for at fuldføre analysen. Juster NET-kriterierne manuelt for at give optimale resultater for en given prøve.
Sammenlign identificerede NET'er med de originale billeder for at vurdere kvaliteten af identifikationen. Når dette trin er fuldført, kan NET-kriterierne anvendes på tværs af alle billeder i datasættet. Eventuelle ændringer af NET-kriterierne anvendes også samtidig på alle kontroleksempler.
Undersøg dataoversigten i undermenuen celledata, hvor antallet af billeder, celletal pr. billede og procentdelen af NET'er pr. billede vises. Angiv outputfanen for at vælge og få vist resultatudgangene. Udforsk og sammenlign de forskellige dataoutput, der genereres fra analysen af kontrol- og PMA-behandlede prøver, ved at vælge outputformen og klikke på outputresultatknappen.
Start derefter resultatdatatabelen CSV-fil for at udforske enkeltcelledata og klikke på resultaterne af PDF-filerne for at visualisere NET-områdefordelingen og DNA-forholdet i prøverne. Den røde linje angiver tærskelværdien i graferne. Endelig skal du klikke på resultaterne bivariate distributionsfil for at bestemme NET-området versus form af DNA.
Her blev 15 billeder af kontrol neutrofiler og 15 billeder af PMA-stimulerede neutrofiler analyseret på under ti minutter. Det samlede antal celler blev talt, og procentdelen af celler med Neutrofil ekstracellulære fælder blev bestemt ved hjælp af den automatiserede kvantificeringsmetode, der er beskrevet i denne artikel. Disse resultater viser, at PMA-stimulerede neutrofiler har et større område, en stigning i nuklear deformation, og en højere DNA til NET-forholdet end kontrol prøver.
Når de kombineres i en 3D-graf, har de PMA-stimulerede prøver tendens til at vise områder med stramme grupper end kontrolprøverne. Mens du forsøger proceduren, er det vigtigt at huske, at selvom arbejdsprocessen blev testet ved hjælp af flere donorer, anbefales det, at brugeren skal beslutte, om softwareparametrene er korrekt baseret på det enkelte datasæt.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
