Summary
Här presenterar vi en beprövad och testad protokoll för rening av kloroplast import proteinkomplex (TOC-TIC komplex) med TAP-taggen. One-step affinitet-isolering protokollet kan potentiellt tillämpas på något protein och används för att identifiera nya interaktion partners masspektrometri.
Abstract
Kloroplast biogenes kräver import av tusentals nucleus-kodade proteinerna i plastid. Import av dessa proteiner är beroende av translocon vid yttre (TOC) och inre (TIC) kloroplast membran. TOC och TIC komplexen är multimeric och innehåller förmodligen ännu okända komponenter. En av de viktigaste målen i fältet är att etablera en komplett inventering av TOC och TIC komponenter. För isolering av TOC-TIC komplex och identifiering av nya komponenter modifierade preprotein receptorn TOC159 har varit N-terminalt genom tillsats av taggen tandem affinitet rening (TAP) vilket resulterar i TAP-TOC159. TAP-etiketten är utformad för två sekventiella affinitet reningssteg (därav ”tandem affinity”). TAP-etiketten används i dessa studier består av en N-terminal IgG-bindande domän härrör från Staphylococcus aureus Protein en (ProtA) följt av en calmodulin-bindande peptid (CBP). Mellan dessa två affinitet taggar, etch en tobak virus (TEV) proteas klyvning webbplats har inkluderats. TEV proteas kan därför användas för skonsam eluering av TOC159-innehållande komplex efter bindning till IgG pärlor. I protokollet presenteras här, utelämnades den andra Calmodulin affinitet reningssteg. Rening protokollet börjar med förberedelser och lösbarhet av totala cellulära membran. Efter tvättmedel-behandlingen inkuberas de solubilized membranproteiner med IgG pärlor för immunoisolation av tryck-TOC159-innehållande komplex. Vid bindning och omfattande tvätt, är TAP-TOC159 som innehåller komplex klyvs och släppt från IgG pärlorna använder den TEV proteas whereby S. aureus IgG-bindande domänen tas bort. Western blotting av den isolerade TOC159-innehållande komplex kan användas för att bekräfta förekomsten av känd eller misstänkt TOC och TIC proteiner. Viktigare, har TOC159-innehållande komplexen använts framgångsrikt att identifiera nya komponenter av TOC och TIC komplexen av masspektrometri. Det protokoll som vi presenterar potentiellt tillåter effektiv isolering av något membran-bundna protein komplex som ska användas för identifiering av ännu okänd komponenter av masspektrometri.
Introduction
Växter är beroende av kloroplaster för fotosyntesen och photoautotrophic tillväxt1. Majoriteten av kloroplast proteinerna kodas i kärnan, syntetiseras i cytosolen och importeras till kloroplast via TIC och TOC komplexen i kuvert membran2. Kärnan i Innehållsförteckningen komplex består av Toc75 protein-ledande kanalen och två receptor GTPases Toc33 och Toc1593,4,5. TOC159 är viktigt för biogenes av kloroplaster och förmedlar massiv ackumulering av fotosyntes-associerade proteiner6. TIC anläggningen består av de TIC20 protein-bedriver kanal samt TIC110 och TIC407,8. Nyligen en 1MD protein flyttning komplexa på Innerkuvertet membranet var isolerad och innehöll tidigare oidentifierade komponenter9, varav den ena var TIC56. Vi isolerade nyligen Co TIC56 av 1 MDa komplexa använda protokollet TAP-TOC159 affinitet rening. Uppgifterna visade en strukturell överlappning mellan de ”kanoniska” TOC/TIC-komplex och 1 MDa komplexa10. Tidigare identifierades okända komponenter såsom KOC1 också som nya interaktion partners av TOC och TIC komplex med TAP-metoden beskrivs här10,11.
Således, TAP-tag rening är en effektiv metod för isolering av proteinkomplex och identifiering av samverkande partner med efterföljande massa spektrometriska analys12. Tryck på etiketten består av två IgG bindande repetitioner skild från en calmodulin-bindande peptid (CBP) av en tobak etch virus (TEV) proteas klyvning webbplats. Den ursprungliga metoden, bestående av en IgG-affinitet reningssteg följt av TEV klyvning och efterföljande calmodulin-affinitetskromatografi tillåtna infödda rening av stora och mycket ren protein komplex13,14 . Vi har förenklat förfarandet och visat att de TOC159-innehållande proteinkomplex också kan renas effektivt använder bara IgG-affinitet rening steget följt av TEV-klyvning för eluering15. Vår erfarenhet utelämnandet av steget calmodulin affinitet resulterade i högre avkastning och kan därför vara lämplig för låga överflöd proteiner.
Kort sagt, vi konstruerat stabil transgena A. thaliana rader uttrycka TAP-TOC159 i de ppi2 (toc159 KO mutant) bakgrund och etablerade den som en tillförlitlig källa för rening av TOC-TIC komplex. Protokollet för isolering av TOC-TIC anläggningen börjar med homogenisering av växtmaterial i en tvättmedel-fri buffert. Efter centrifugering kastas supernatanten. Den pellets som innehåller den totala membran fraktionen är solubilized använda ett tvättmedel som innehåller buffert. Efter en ultra-centrifugeringssteget tillämpas supernatanten innehållande solubilized TOC-TIC komplex IgG-kådan för affinitet rening. Efter flera tvättar steg, eluering utförs med en TEV proteas-innehållande buffert selektivt klyva nedströms av IgG-bindande domänerna och försiktigt släppa infödda TOC159-innehållande komplex. TEV eluatet kan analyseras direkt av Western blotting eller masspektrometri att identifiera den interaktiv partners TOC15910,11,15. Metoden har även använts för att identifiera post-translationella modifieringar av TOC15915. Infödda TOC159-innehållande komplex kan i framtiden användas för strukturella studier med cryoelectron mikroskopi.
Protocol
1. beredning av Arabidopsis växter
- Förbereda 1 L med halv styrka som Murashige och Skoog (MS) medium inklusive vitaminer med 1% sackaros och justera pH till 5,7 med kaliumhydroxid (KOH). Lägg till 0,8% av phytoagar och autoklavera i 20 min vid 120 ° C.
- Häll 75 mL MS medium per Petri platta (diameter 14,5 cm, höjd 3 cm) och tillåta solidificationen för 1 h.
- Lägga till 30 mg Arabidopsis thaliana frön i ett 1,5 mL mikrofugrör, och ytan sterilisera med 70% (v/v) etanol som innehåller 0,05% (v/v) Triton x-100 för 5 min, följt av 100% (v/v) etanol för 10 min. ta bort etanol.
- Överföra frön till sterila filterpapper för torkning. Strö steriliserad fröna jämnt på MS plåt (varje genotyp kräver minst 8-10 plattor) och försegla varje platta med kirurgisk tejp.
- Inkubera plattorna vid 4 ° C i två dagar i mörkret att synkronisera frögroning. Överföring till en tillväxt kammare med följande ljus cykel: 8 h 120 µmol m−2 s−1 ljus och 16 h av mörka vid 22-20 ° C.
2. förberedelse av HsIgG agaros pärlor
- Avbryta CNBr-aktiverat agaros pärlor (4 g) i 100 mL av 1 mM HCl och inkubera i 30 min i rumstemperatur.
- Överför agaros pärlorna till ett sintrat glas filter, tvätta under vakuum med 100 mL 100 mM HCl och upprepa 2 - 3 gånger.
Obs: Precool tvättlösningen till 4 ° C. - Återsuspendera av agaros pärlor i 1 mL kall 100 mM HCl och överföra till en 50 mL konisk centrifugrör. Tvätta filtret sintrat glas med 3 mL 100 mM HCl och överför vätskan till en och samma tub.
- Snurra vid 400 × g i 5 minuter vid 4 ° C och ta bort supernatanten med en pipett.
Obs: Inte Dekantera röret. - Återsuspendera pärlorna i 50 mL koppling buffert (tabell 1). Blanda kort, och sedan snurra vid 400 × g i 5 minuter vid 4 ° C.
- Lös 50 mg frystorkade Homo sapiens IgG (Hs-IgG) i 10 mL av koppling buffert, blanda agaros pärlorna försiktigt och inkubera i skakapparat över natten vid 4 ° C.
- Snurra vid 400 × g i 5 minuter vid 4 ° C och ta bort supernatanten med en pipett.
- Tvätta IgG-agaros pärlorna med 50 mL koppling buffert och spinn på 400 × g i 5 minuter vid 4 ° C.
- Återsuspendera IgG-agaros pärlorna med 50 mL blockerande buffert (tabell 1) och snurra på 400 × g i 5 minuter vid 4 ° C. Upprepa en gång.
- Återsuspendera IgG-agaros pärlor i 50 mL blockerande buffert, rotera blandningen för 2 h på RT och snurra på 400 × g i 5 minuter vid 4 ° C.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera IgG-agaros pärlorna i 200 mL NaCl koppling buffert (tabell 1).
- För att blockera eventuella återstående tvärbindande CNBr grupper, tvätta IgG-agaros pärlorna med 100 mL 0,1 M glycin-HCl, pH 2,8. Snurra vid 400 × g i 5 minuter vid 4 ° C och ta bort supernatanten. Tvätta med 0,2 M glycin-HCl, pH 2.8, spin vid 400 × g i 5 minuter vid 4 ° C och ta bort supernatanten. Slutligen, tvätta IgG-agaros pärlorna med 200 mL ultrarent vatten.
- Tvätta IgG-agaros pärlorna med 200 mL ultrarent vatten och sedan 200 mL PBS-bufferten (tabell 1).
- Återsuspendera IgG-agaros pärlorna i 20 mL PBS-bufferten med 0,01% NaN3 (natriumazid) och förvaras vid 4 ° C.
3. isolering och lösbarhet i bråket som membran
- Mal 10 g av tre veckor gamla A. thaliana plantor i flytande kväve med en kall mortel och stöt med sand.
- Tillsätt 20 mL kallt slipning buffert (tabell 1) till 10 g marken vävnad, blanda väl och Tina på is.
- Filtrera blandningen genom två lager av snabb filtrering material i en 50mL konisk centrifugrör. Njut av snabb filtrering materialet med slipning buffert före filtrering.
- Centrifugera filtratet i 10 min vid 1500 × g vid 4 ° C och överför supernatanten till ett kylt 50 mL koniskt centrifugrör, upprepa samma steg en gång och samla supernatanten. Behålla ett 200 µL prov av den ”totala fraktionen” och förvaras vid-80 ° C för senare analys
- Överför supernatanten till kalla 38,50 mL ultracentrifugen rör och topp upp till 35 mL med kall slipning buffert. Centrifugera i 1 h vid 100 000 × g vid 4 ° C i en ultracentrifugen.
- Överför supernatanten till en 50 mL konisk centrifugrör. Behålla ett 200 µL prov ”lösliga fraktionen” och förvaras vid-80 ° C för senare analys.
- Re centrifugerade grön med hjälp av ett glas teflon Homogenisatorer, i slipning buffert. Centrifugera i 1 h vid 100 000 × g vid 4 ° C i en ultracentrifugen och Kassera supernatanten.
- Återsuspendera grön pelleten i 18,75 mL 1 x slipning buffert med en glas teflon Homogenisatorer och tillsätt 9,375 mL 1 x slipning buffert.
- Lägg till 9,375 mL 4 x solubilisation lösning (tabell 1) (innehållande TX-100 tvättmedel) för att ge 37,5 mL och inkubera i 30 min på en ”roterande skakapparat” vid 4 ° C.
- Centrifugera i 1 h vid 100 000 × g vid 4 ° C i en ultracentrifugen. Överför supernatanten till en 50 mL konisk centrifugrör. Behålla ett 200 µL prov av supernatanten (framtid ”belastning bråkdel”) och förvaras vid-80 ° C för senare analys.
- Återsuspendera pelleten i 37,5 mL slipning buffert. Behålla provet av olösliga del och förvaras vid-80 ° C
4. Immunoprecipitation
- Temperera 100 µL packade IgG-agaros harts i buffert A (tabell 1) och snurra på 100 × g i 5 minuter vid 4 ° C.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera IgG-agaros kådan i 100 µL buffert A vid 4 ° C.
- Överföra den tvättade IgG-agaros hartsen till 37,5 mL av solubilized membran och inkubera över natten på en roterande skakapparat i en 50 mL konisk centrifugrör vid 4 ° C.
- Sediment IgG-Agarens harts vid 100 × g i 5 minuter vid 4 ° C och ta bort supernatanten med en pipett. Behålla ett 200 µL prov av ”flödet genom” och förvaras vid-80 ° C för senare analys.
- Tvätta IgG-agaros kådan i 37,5 mL buffert A och inkubera i 10 min på en roterande skakapparat.
- Sediment IgG-agaros kådan på 100 × g i 5 minuter vid 4 ° C, avlägsna supernatanten med en pipett, tillsätt 5 mL av slipning buffert A till en 15 mL centrifugrör och centrifugera vid 100 × g, 4 ° C, 5 min. Behåll ett 200 µL prov av den ”tvätten 1” och förvaras vid-80 ° C för senare analys.
- Upprepa de 5 mL tvätt steg tre gånger med buffert A.
- Genomföra de sista två stegen för tvätt utan hämmare (NaF, proteashämmare och PMSF)
Obs: Hämmare är inte längre behövs i detta skede och underlät att minska kostnaden. Behålla ett 200 µL prov sista tvätt steg ”sista tvättningen (W6)” och förvaras vid-80 ° C för senare analys. - Överföra IgG-agaros kådan till en 500 µL spin kolumn med 35 µm filter och tvätta pärlorna två gånger med 300 µL av TEV eluering buffert (tabell 1) (inte innehåller AcTEV) för Jämviktstiden. Stäng den spin kolumnen.
- Tillsätt 300 µL av TEV eluering buffert innehållande 50 enheter (10 µL) av AcTEV. Förbered blandningen i ett rör innan du lägger till harts.
- Inkubera kolumnen spin med pärlor i en thermomixer vid 16 ° C, 350 rpm för 2 h. Invertera kolumnen försiktigt flera gånger varje 30 min.
- Öppna den spin kolumnen, placera det i en ny ren 1,5 mL tub och spinn vid 100 × g i 5 minuter vid 4 ° C att samla in eluatet.
- Torka (till exempel) 10% (v/v) av eluerade provet (~ 25 µL) i en centrifugal förångare och använder masspektrometri eller andra ytterligare analys.
- Alikvotens återstående eluatet (~ 275 µL) indelade i elva 1,5 mL Centrifugera rören (25 µL varje), torka i en centrifugal förångare, och förvara vid-80 ° C.
- Analysera proverna behöll hela förfarandet samt eluat av standard SDS-PAGE följt av immunoblotting. För provberedning, förhastade 50 µg av totalt (T), tvätta belastning (L), flöde genom (FT), 1 (W1) och 200 µL tvätta 6 (W6) av kloroform/metanol utvinning16.
- Lägg till 10 µL av 2 x SDS-PAGE lastning buffert (tabell 1) till utfällda proverna och 25 µL av eluerade torkade provet. Vortex och koka i 10 min vid 95 ° C i en värme-block.
- Analysera belastning (L), flöde genom (FT), totalt (T), tvätta 1 (W1), tvätta 6 (W6) och eluering (E) av immunoblotting med anti-TOC159 antikroppar för att avgöra effektiviteten i förfarandet för isolering.
Representative Results
Vi här beskrivit ett protokoll för rening av en TAP-taggade kloroplast kuvertet protein komplex från transgena A. thaliana växter. Som visas i figur 1A, växter att uttrycka 35S:NTAP-TOC159 konstruktion användes för att isolera detta komplex medan växter att uttrycka den 35S:NTAP konstruktionen användes som kontroll. Figur 1 B visar detaljerade steg i reningen av TAP-TOC159 proteinkomplex följt av masspektrometri att tillåta identifiering av samverkande proteiner. Immunoblot analys (figur 2, höger) bekräftar att isolerade TAP-TOC159 interagerar med TOC75 och TOC33 av TOC komplexet. Den kloroplast yttre membran Kinas KOC1 känt att fosforylera TOC159 också Co isolerat med tryck-TOC159 komplexet (figur 2B, höger sida). Förekomsten av TIC110 avslöjar att isolerade TAP-TOC159 komplexet innehåller också delar av komplexet TIC. FBN1A antikroppen mot ett plastoglobule protein obesläktad till protein import inte kände igen tryck-TOC159 komplexet som indikerar frånvaro av föroreningar. I den negativa kontrollen, immunoprecipitated NTAP protein samtidig isolera inte med någon av TOC-TIC proteinerna (figur 2, vänster sida) och bekräftar specificitet TAP-TOC159 rening.
Figur 1 . Ordningen av konstruktioner och affinitet rening förfarande. (A). 35S:NTAP-TOC159 konstruktion, kodning NTAP-TOC159 var stabilt uttryckt i Arabidopsis thaliana. Negativa kontrollplantorna uttryckte den 35S:NTAP konstruktionen, kodning TAP-etiketten ensam. (B). steg vis affinitet rening protokollet består av membran isolering och lösbarhet, IgG agaros immuno-rening, tvättar, TEV proteas klyvning och eluering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Tandem affinitet rening av proteinet TOC159. N-terminalt TAP-taggade TOC159 renades från NTAP-TOC15:ppi2 Arabidopsis växter och TAP protein som renats från TAP: WT växter användes som en negativ kontroll. Total protein extrakt (T), solubilized membranproteiner = belastning bråkdel (L), flöde genom (FT), första och sista tvätta fraktioner (W1 och W6) och 10% av TEV eluatet analyserades av Western blotting. Membranet var utforskad med antikroppar mot TOC159 (AT4G02510), TOC75 (AT3G46740), TOC33 (AT1G02280), KOC1 (AT4G32250), TIC110 (AT1G06950), och FBN1A (AT4G04020). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Tabell över buffertar | ||
| Koppling buffert | NaHCO3 Justera till pH 8,5 Justera pH med 0,1 M Na2CO3 |
100 mM |
| Blockerande buffert | Tris-HCl Justera till pH 8 med HCl. |
100 mM |
| PBS-bufferten | Na2HPO4 KH2PO4 NaCl KCl Justera till pH 7,3 med HCl. |
4,3 mM 1.4 mM 137 2.7 |
| NaCl koppling buffert | Koppling buffert NaCl |
1 M |
| 2 x slipning buffert | Tris-HCl, pH 7.5 med HCl. NaCl NaF PMSF Anläggningen proteas hämmare cocktail |
100 mM 200 mM 5 mM 1 mM 0,20% |
| 4 x vävnadsupplösning lösning | Glycerol Triton-X100 |
40% 3% |
| Buffert A | 2 x slipning buffert 1 x slipning buffert 4 x vävnadsupplösning lösning |
100 ml 50 ml 25 ml 25% |
| TEV eluering buffert | Tris-HCl, pH 8 med HCl EDTA, pH 8 med HCl NaCl Glycerol Triton-X100 DTT |
50 mM 0,5 mM 100 mM 10% 0,75% 1 mM |
| 2 x SDS-PAGE lastning buffert | Tris-HCl pH 6,8 med HCl SDS Glycerol Bromophenol blå DTT |
0,1 M 4% 20% 0,20% 0,2 M |
Tabell 1. Buffert recept.
Discussion
Vi visade att ett enda steg tryck etiketten rening är en specifik och effektiv metod för rening av komplexet Arabidopsis TOC-TIC. Även om TAP-etiketten skulle tillåta två efterföljande reningssteg (IgG-följt av calmodulin affinitet rening efter TEV proteas-klyvning), anser vi att i många fall det första affinity steget följt av TEV proteas klyvning kommer att räcka. Vårt mål, TOC159, är låg rikligt och införandet av det andra calmodulin affinity steget överdrivet minskat protein avkastningen vilket var huvudskälet till att undanta den från vårt nuvarande protokoll. I TEV-eluering i sig är en mycket specifik och skonsam reningssteg som vilja bara frige TAP-taggade målet tillsammans med associerade interaktion partners medan kontaminerande proteinerna sticker icke-specifikt till IgG harts kommer att förbli där. Således, i kombination med IgG-affinitet steg, den TEV elueringen resulterar i en tillräckligt effektiv rening för våra och förmodligen många andra ändamål.
Vara måste försiktig att den TAP-taggade konstruktionen är fullt fungerande i vivo. TAP-taggning kan ha potentiellt skadliga effekter på proteinaktiviteten, stabilitet eller lokalisering. TOC159 består av tre domäner, N-terminala sura domänen, den centrala GTP-bindande domän och C-terminal membran domän, som förankrar TOC159 i yttre kloroplast membran2. För att undvika potentiella störningar med membran införande, smält vi TAP-taggen för att N-terminalen av TOC159. Fusion till N-terminalen är snarare undantag än regel. Många proteiner innehåller N-terminala målobjektet information och bör därför av etiketten på C-terminus. Vi säker på att TOC159 är funktionella i vivo genom komplettering av ppi2 mutant (en albino-muterat saknas TOC159) med tryck-TOC159. Räddning av green vildtyps fenotypen angav att TAP-TOC159 var funktionella15.
Rening protokollet användes för att identifiera nya interaktion partners av TOC159, som inkluderade KOC1 och TIC5610,11. Totalt var cirka 30 proteiner associerade med komplexet vilket tyder på att nya interaktion partners kommer att isoleras och kännetecknas i en nära framtid. Medan vi rekommenderar TAP-taggen för komplexa rening, skulle vi fortfarande vilja påpeka att ytterligare versioner den som presenteras här finns och kan vara mycket användbart för vissa program.
Disclosures
Författarna förklarar inget konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Arbetet stöddes genom bidrag från schweiziska National Science Foundation (31003A_156998 och 31003A_176191) och universitetet i Neuchâtel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaHCO3 | PanReac AppliChem | A0384 | |
| Tris | Biosolve | 0020092391BS | |
| Na2HPO4 | Sigma | S7909 | |
| KH2PO4 | PanReac AppliChem | A2946 | |
| NaCl | PanReac AppliChem | A2942 | |
| NaF | Sigma | S1509 | Toxic |
| PMSF | PanReac AppliChem | A0999 | Toxic |
| Plant protease inhibitor cocktail | Sigma | P9599 | |
| Glycerol | PanReac AppliChem | A0970 | |
| Triton X100 | Roche | 10789704001 | |
| Glycine | PanReac AppliChem | A1067 | |
| EDTA | Carl Roth | 8043 | |
| Dithiothreitol (DTT) | PanReac AppliChem | A1101 | |
| SDS | PanReac AppliChem | A0675 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B0126 | |
| HCl | VWR | 20252-290 | Corrosive |
| Sucrose | PanReac AppliChem | A3935 | |
| Murashige and Skoog medium with vitamins | Duchefa Biochemie | M0222 | |
| Phytoagar | Duchefa Biochemie | P1003 | |
| Petri plate | Greiner Bio-one | 639102 | |
| 1.5 mL microfuge tubes | Sarstedt | 72.706 | |
| Ethanol | Fisher chemical | E/0600DF/15 | |
| Filter paper | Whatman | 10311804 | |
| Surgical tape | 3M | 1530-1 | |
| CNBr-Activated agarose beads (sepharose 4B) | GE Healthcare | 17-0430-01 | |
| Sintered glass filter | DURAN | 2515703 | |
| Centrifuge tube 50 mL | TPP | 91050 | |
| Purified immunoglobulin G (HsIgG) | MP Biomedicals | 855908 | |
| Rotating shaker | IKA | 4016000 | |
| NaN3 (sodium azide) | Sigma | 71290 | Toxic |
| Quick filtration material (Miracloth) | Merk-Millipore | 475855 | |
| Ultracentrifube XNP-80 | Beckman Coulter | A99839 | |
| Rotor SW 32 Ti | Beckman Coulter | 369650 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| Glass teflon homogenizer (Potter) | Wheaton | 357426 | |
| Spin column (Mobicol) | Mo Bi Tec | M1003 | |
| Filter 35µm for spin column (Mobicol) | Mo Bi Tec | M513515 | |
| AcTEV | Invitrogen | 12575-015 | |
| Centrifugal evaporator (Speed Vac) | Eppendorf | 5305000100 | |
| FBN1A(PGL35) antibody | AgriSera | AS06 116 | RRID:AB_2247012 |
| Sand, Fontainebleau | VWR | 27460.295 |
References
- Jarvis, P., López-Juez, E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).
- Kessler, F., Schnell, D. Chloroplast biogenesis: diversity and regulation of the protein import apparatus. Current opinion in cell biology. 21 (4), 494-500 (2009).
- Schnell, D. J., Kessler, F., Blobel, G. Isolation of components of the chloroplast protein import machinery. Science. 266 (5187), 1007-1012 (1994).
- Kessler, F., Blobel, G., Patel, H. A., Schnell, D. J. Identification of two GTP-binding proteins in the chloroplast protein import machinery. Science. 266 (5187), 1035-1039 (1994).
- Jarvis, P., et al. An Arabidopsis mutant defective in the plastid general protein import apparatus. Science. 282 (5386), 100-103 (1998).
- Bauer, J., et al. Essential role of the G-domain in targeting of the protein import receptor atToc159 to the chloroplast outer membrane. The Journal of cell biology. 159 (5), 845-854 (2002).
- Kovacs-Bogdan, E., Soll, J., Bolter, B. Protein import into chloroplasts: the Tic complex and its regulation. Biochimica et biophysica acta. 1803 (6), 740-747 (2010).
- Nakai, M. The TIC complex uncovered: The alternative view on the molecular mechanism of protein translocation across the inner envelope membrane of chloroplasts. Biochimica et biophysica acta. 1847 (9), 957-967 (2015).
- Kikuchi, S., et al. Uncovering the protein translocon at the chloroplast inner envelope membrane. Science. 339 (6119), 571-574 (2013).
- Kohler, D., et al. Characterization of chloroplast protein import without Tic56, a component of the 1-megadalton translocon at the inner envelope membrane of chloroplasts. Plant physiology. 167 (3), 972-990 (2015).
- Zufferey, M., et al. The novel chloroplast outer membrane kinase KOC1 is a required component of the plastid protein import machinery. The Journal of biological chemistry. 292 (17), 6952-6964 (2017).
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nature biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).
- Rohila, J. S., Chen, M., Cerny, R., Fromm, M. E. Improved tandem affinity purification tag and methods for isolation of protein heterocomplexes from plants. The Plant journal. 38 (1), 172-181 (2004).
- Rohila, J. S., et al. Protein-protein interactions of tandem affinity purified protein kinases from rice. PloS one. 4 (8), 6685 (2009).
- Agne, B., et al. The acidic A-domain of Arabidopsis TOC159 occurs as a hyperphosphorylated protein. Plant physiology. 153 (3), 1016-1030 (2010).
- Wessel, D., Flugge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Analytical biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).
