निस्र्पक घावों के लिए एक माइक्रो-सीटी आधारित विधि और छोटे जानवर दिमाग में इलेक्ट्रोड का पता लगाने
Summary
यह लेख सूक्ष्म सीटी इमेजिंग, जिसमें घावों quantified और इलेक्ट्रोड पूरे मस्तिष्क के संदर्भ में उच्च परिशुद्धता के साथ स्थित किया जा सकता है के लिए छोटे जानवर दिमाग तैयार करने के लिए एक सीधी विधि का वर्णन करता है ।
Abstract
घाव और इलेक्ट्रोड स्थान सत्यापन परंपरागत रूप से दाग मस्तिष्क स्लाइस, एक समय लेने वाली प्रक्रिया है कि मैनुअल आकलन की आवश्यकता है की ऊतकवैज्ञानिक परीक्षा के माध्यम से किया जाता है । यहाँ, हम घावों को बढ़ाता है और मस्तिष्क में इलेक्ट्रोड का पता लगाने के लिए एक सरल, सीधी विधि का वर्णन है कि कम श्रमसाध्य है और अधिक विस्तृत परिणाम पैदावार. पूरे दिमाग आज़मियम tetroxide के साथ दाग, राल में एंबेडेड हैं, और एक माइक्रो सीटी स्कैनर के साथ छवि । संकल्प और आभासी धारा के साथ दिमाग के 3 डी डिजिटल संस्करणों में स्कैन परिणाम नमूना आकार पर निर्भर मोटाई (12-15 और 5-6 चूहे और ज़ेबरा फिंच दिमाग के लिए voxel प्रति µm, क्रमशः) । सतह और गहरे घावों विशेषता हो सकता है, और एकल tetrodes, tetrode arrays, इलेक्ट्रोलाइटिक घावों, और सिलिकॉन जांच भी स्थानीयकृत किया जा सकता है । नि: शुल्क और मालिकाना सॉफ्टवेयर प्रयोगकर्ता किसी भी विमान से नमूना मात्रा की जांच करने के लिए और खंड मैंयुअल रूप से या स्वचालित रूप से खंड की अनुमति देता है । इस विधि पूरे मस्तिष्क की मात्रा उत्पन्न करता है, क्योंकि घावों और इलेक्ट्रोड वर्तमान विधियों में से एक बहुत अधिक डिग्री करने के लिए quantified जा सकता है, जो भीतर और पढ़ाई के पार की तुलना मानकीकरण में मदद मिलेगी.
Introduction
Neuroscientists एक लंबे समय के लिए घावों पर भरोसा किया है ताकि मस्तिष्क में समारोह और स्थान के बीच संबंध को समझने के लिए । उदाहरण के लिए, हिप्पोकैम्पस की हमारी समझ सीखने और स्मृति और आवेग नियंत्रण के लिए महत्वपूर्ण होने के रूप में ललाट प्रांतस्था की के लिए अपरिहार्य होने के रूप में दोनों मनुष्यों में serendipitous घावों के उत्पादों रहे थे1,2. पशु मॉडलों के उपयोग, तथापि, neuroscientists नसीब से परे जा रहा द्वारा घावों की शक्ति का दोहन करने की अनुमति दी है, और अनगिनत मस्तिष्क क्षेत्रों के समारोह संरचना के माध्यम से समारोह संबंधों के व्यवस्थित अध्ययन के माध्यम से आविर्भाव किया गया है घावों3,4।
सही ढंग से एक संरचना के लिए समारोह असाइन करने के लिए, तथापि, घाव अध्ययन सटीक ठहराव प्रक्रियाओं, जो कि एक क्षेत्र में कमी आई है की आवश्यकता है । घावों को बढ़ाता है के लिए वर्तमान सोने के मानक खंड, पर्वत, और एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ छवि दिमाग के लिए है । imaged स्लाइस फिर एक एटलस पर निकटतम वर्गों के लिए मिलान कर रहे हैं, और विषय भर में घावों के अनुमानित निर्देशांक परोक्ष रूप से सूचित कर रहे हैं, अक्सर कैमरा ल्युसिडा छवियों या उदाहरण ऊतकवैज्ञानिक स्लाइस3,4 के उपयोग के माध्यम से ,5,6,7,8,9,10.
वर्तमान घावों ठहराव प्रक्रियाओं की अस्पष्टता से परे, इन तकनीकों समय लेने वाली और विफलता के लिए प्रवण हैं । मस्तिष्क कठोरता में छोटे परिवर्तन, ब्लेड तेज, और तापमान कच्ची, विकृत, या फटे वर्गों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । वर्गों को भी असमान दाग कर सकते है और क्योंकि बढ़ते माध्यम में बुलबुले के अनुचित छवि । महत्वपूर्ण बात, अनुभाग पर, मस्तिष्क में घाव के स्थान के तीन आयामी संदर्भ खो दिया है, मस्तिष्क चुनौतीपूर्ण में घाव के सटीक 3d पुनर्निर्माण कर रही है ।
घावों के लिए एक और आम आवेदन मस्तिष्क में एकल और कई इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग के स्थान का निर्धारण करने के लिए किया गया है. अंतिम रिकॉर्डिंग सत्र के अंत में, शोधकर्ताओं इलेक्ट्रोड टिप पर छोटे इलेक्ट्रोलाइटिक घावों को प्रेरित और मस्तिष्क histologically प्रक्रिया के रूप में एक पारंपरिक घावों का प्रयोग11में किया. यह तकनीक ऊपर वर्णित एक ही कमियां से ग्रस्त है, अतिरिक्त समस्याओं के साथ किया जा रहा है कि इलेक्ट्रोलाइटिक घावों आमतौर पर उन्हें बनाने के लिए इस्तेमाल किया इलेक्ट्रोड से बड़ा कर रहे हैं, लेकिन आम तौर पर काफी छोटे हैं कि वे histologically खोजने के लिए चुनौती दे रहे हैं. जब एकाधिक इलेक्ट्रोड सम्मिलित किए जाते हैं, एक tetrode सरणी के मामले में के रूप में, इलेक्ट्रोलाइटिक घावों के माध्यम से सत्यापन और भी चुनौतीपूर्ण है. इलेक्ट्रोलाइटिक घावों के लिए एक विकल्प इलेक्ट्रोड पर एक डाई के बाद histologically12सत्यापित करने के लिए उपयोग है, लेकिन इस तकनीक को एक ही कमियां है कि पारंपरिक प्रोटोकॉल के साथ आने से ग्रस्त है ।
यहाँ, हम में गहराई से वर्णन एक हाल ही में वर्णित विधि13 इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (EM) और एक्स-रे गणना टोमोग्राफी (माइक्रो सीटी) में धुंधला तकनीक पर आधारित है कि quantifies घावों और छोटे जानवर दिमाग में इलेक्ट्रोड रेखांकित वर्तमान से बेहतर विधियों. माइक्रो-सीटी एक इमेजिंग तकनीक है जिसमें एक्स-रे एक नमूना है कि ३६० ° घुमाया जाता है पर गोली मार दी जाती है, जबकि एक उपजिल्हाधिकारी ने नमूना द्वारा मोड़ा नहीं एक्स-रे इकट्ठा । परिणाम नमूना है कि किसी भी अभिविंयास में visualized किया जा सकता है और ठीक quantified के एक उच्च संकल्प डिजिटल 3 डी पुनर्निर्माण है । कई शैक्षणिक संस्थानों में माइक्रो-सीटी स्कैनर है, जो व्यावसायिक रूप से भी उपलब्ध हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
निंनलिखित प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण कदम हैं: पहला, पीएफए और GA के संयोजन का उपयोग करने के लिए पशु perfuse और बाद में मस्तिष्क को ठीक करने के बाद ऊतक के अनुरूप पूर्ण आज़मियम प्रवेश को प्राप्त करने के लिए सर्व?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक ग्रेग लिन और आर्थर McClelland के साथ अपनी विशेषज्ञता के लिए धंयवाद माइक्रो सीटी मशीन, डेविड रिचमंड और शिकारी इलियट छवि और डेटा विश्लेषण कोर (IDAC) में हार्वर्ड मेडिकल स्कूल में उनकी छवि प्रसंस्करण सलाह के लिए, और विलियम Liberti बोस्टन में कृपा से एक ज़ेबरा फिंच मस्तिष्क प्रदान करने के लिए विश्वविद्यालय । यह काम नेनो सिस्टम के लिए केंद्र (सीएनएस), राष्ट्रीय नैनो समंवित अवसंरचना नेटवर्क (NNCI), जो NSF पुरस्कार no १५४१९५९ के तहत राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित है के एक सदस्य में भाग में प्रदर्शन किया गया । सीएनएस हार्वर्ड यूनिवर्सिटी का एक हिस्सा है । यह काम रिचर्ड और सुसान स्मिथ परिवार फाउंडेशन और IARPA (अनुबंध #D16PC00002) द्वारा समर्थित किया गया था । S.B.E.W. मानव फ्रंटियर विज्ञान कार्यक्रम (HFSP से फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था; LT000514/2014) और यूरोपीय आणविक जीवविज्ञान संगठन (EMBO; ALTF1561-2013). G.G. को नेशनल साइंस फाउंडेशन (NSF) ग्रेजुएट रिसर्च फेलोशिप प्रोग्राम (GRFP) ने सपोर्ट किया था ।
Materials
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | 2% (w/v/) in 1X PBS |
| Glutaraldehyde (GA) | EMS | 16220 | 2.5% (w/v) GA in 1X PBS |
| OsO4 | EMS | 19190 | Work in fume hood |
| Ethanol | Decon Labs | Koptec | 140, 190, 200 proof |
| Acetone | EMS | 10015 | Glass-distilled |
| Durcupan ACM resin | Sigma-Aldrich | 44610 | A, B, C and D components, resin for embedding |
| Disposable molds | Ted Pella | 27114 | Suggested |
| milliQ water (ultrapure water) | Millipore Sigma | QGARD00R1 (or related purifier) | Suggested |
| Parafilm (paraffin film) | Millipore Sigma | P7793 | Suggested paraffin film |
| Micro-CT scanner | Nikon Metrology Ltd., Tring, UK | X-Tek HMS ST 225 | Used by authors |
| Software for visualizing and analyzing micro-CT scans: | |||
| Volume Graphics | VG Studio Max | Used by authors | |
| FEI / Thermo Scientific | Avizo | Used by authors | |
| FEI / Thermo Scientific | Amira | Similar to Avizo | |
| Mark Sutton & Russell Garwood | Spiers | Free, http://spiers-software.org/ | |
| Pixmeo Sarl | Osirix Lite | Free, https://www.osirix-viewer.com/ | |
| Open Source | FIJI | Free, https://fiji.sc/ | |
| Adobe | Photoshop | Good for analyzing one slice at a time |
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