Summary
מאמר זה מתאר שיטה פשוטה כדי להתכונן מוח בעל חיים קטן מיקרו-CT הדמיה, פצעים אשר ניתן לכמת, אלקטרודות הממוקם עם דיוק גבוהה בהקשר של המוח כולו.
Abstract
אימות מיקום הנגע, אלקטרודה נעשים באופן מסורתי באמצעות היסטולוגית בחינת פרוסות המוח מוכתם, הליך גוזלת זמן זה דורש הערכה ידנית. כאן, אנו מתארים שיטה פשוט, פשוט לכימות נגעים ואיתור אלקטרודות במוח פחות מייגעת, מניבה תוצאות מפורטות יותר. כל המוח הן מוכתמות אוסמיום ארבע-חמצני, המוטבעות שרף, עם תמונה עם סורק מיקרו-CT. הסריקות לגרום בכמויות דיגיטלית תלת-ממד של המוח עם רזולוציות, סעיף וירטואלי עוביים תלויים גודל המדגם (מיקרומטר 12-15 ו- 5 – 6 לכל voxel עכברוש, זברה פינק המוח, בהתאמה). נגעים משטח עמוק ניתן לאפיין, יחיד tetrodes, tetrode מערכים, נגעים electrolytic ואני גם יכול להיות מקומי סיליקון הגששים. תוכנה חופשית, הקניינית מאפשרת ניסויים לבחון האחסון מדגם של כל מטוס, קטע עוצמת הקול באופן ידני או אוטומטי. כי שיטה זו יוצרת נפח כל המוח, נגעים ואלקטרודות ניתן לכמת את רמה גבוהה יותר מאשר בשיטות הנוכחי, אשר יסייע לתקנן השוואות בתוך ועל -פני לימודי.
Introduction
מדעני מוח צריכים לסמוך על נגעים במשך זמן רב כדי להבין את הקשר בין פונקציית המיקום במוח. לדוגמה, ההבנה שלנו של ההיפוקמפוס כמו להיות הכרחית למידה וזיכרון ואת קליפת המוח הקדם חזיתית בתור מפתח עבור שליטה בדחפים היו שני המוצרים של נגעים החרס בני אדם1,2. השימוש במודלים, עם זאת, אפשרה מדעני מוח כדי לרתום את העוצמה של נגעים על ידי מעבר סרנדיפיות, הפונקציה של אזורים במוח אינספור יש כבר הובהר באמצעות מחקרים שיטתיים של מבנה פונקציה קשרים באמצעות נגעים3,4.
להקצאת כראוי של הפונקציה למבנה, אולם, הנגע מחקרים דורשות כימות מדויק נהלים, אשר הוא אזור יש שהיה חסר. תקן הזהב הנוכחי עבור לכימות נגעים היא סעיף, הר, והמוח תמונה עם מיקרוסקופ אור. הפרוסות שבעורך ואז מתאימים לסעיפים הקרוב ב אטלס, נקודות הציון המשוער של נגעים על פני נושאים באופן עקיף מדווחים, לעיתים קרובות באמצעות מצלמה lucida תמונות או דוגמה היסטולוגית פרוסות3,4 ,5,6,7,8,9,10.
מעבר העוסקת מההליכים כימות הנגע הנוכחי, טכניקות אלה הן זמן רב מועדת לכישלון. שינויים קטנים בתוך המוח נוקשות, חדות הלהב וטמפרטורה יכול להוביל מקטעים הכושלת, מעוותת או קרועה. מקטעים באפשרותך גם כתם לצר, לדימות כראוי בגלל בועות המדיום הרכבה. חשוב, על חלוקתה, ההקשר תלת מימדי של המיקום של הנגע במוח הוא הפסיד, ביצוע שחזור תלת-ממד מדויקות של הנגע מאתגרת המוח.
יישום נפוץ אחר לחבלות היה לקבוע את המיקום של יחיד, הקלטות מרובות אלקטרודה במוח. בסוף להקלטות הסופי, חוקרים זירוז נגעים electrolytic קטן בקצה האלקטרודה ולעבד המוח בהיסטולוגיה כפי שנעשה ניסוי11של הנגע קונבנציונלי. טכניקה זו סובל החסרונות באותו שתוארה לעיל, עם בעיות נוספות בכך נגעים electrolytic בדרך כלל גדולים יותר האלקטרודות נהגה להכין אותם. אבל הם בדרך כלל קטנים מספיק כי הם הם מאתגרים למצוא בהיסטולוגיה. כאשר מספר אלקטרודות מוכנסים, כמו במקרה של מערך tetrode, אימות דרך נגעים electrolytic הוא יותר מאתגר. אלטרנטיבה נגעים electrolytic הוא השימוש של צבע על האלקטרודה כדי מאוחר יותר לאמת בהיסטולוגיה12, אך טכניקה זו סובלת החסרונות אותו עם היסטולוגיה קונבנציונלי.
כאן, אנו מתארים מעמיק שיטת תיאר לאחרונה13 בהתבסס על צביעת טכניקות מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) ו רנטגן טומוגרפיה ממוחשבת (מיקרו-CT) מכמתת נגעים, מאתרת אלקטרודות במוח בעל חיים קטן יותר הנוכחי שיטות. מיקרו-CT היא טכניקת הדמיה שבו צילומי רנטגן הם ירו מדגם מסובבת 360° בזמן scintillator אוספת את צילומי הרנטגן לא מוסח על ידי המדגם. התוצאה היא שחזור תלת-ממד דיגיטלית ברזולוציה גבוהה של המדגם שניתן דמיינו בכיוון כלשהו או לכמת במדויק. מוסדות אקדמיים רבים יש מיקרו-CT סורקים, אשר הינם גם זמינים מסחרית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל מניפולציה ניסויית של בעלי חיים והטיפול היו נבדקו ואושר על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים הרווארד ועל שימוש הוועדה. זלוף המתוארים כאן הוא ספציפי חולדות, אבל ההליך הוא החלים על בעלי חיים עם מוח קטן או בגודל דומה.
1. זלוף
- להכין 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS). עבור מלשן (גיל: 0.5-1.5 בת, משקל: 250-600 גרם), 800-1000 מ ל אמור להספיק. השתמש 400 מ ל כדי perfuse בעלי חיים לבין אוטם 400 נוספים כדי לדלל את מקבע.
- הכינו את מקבע בהיקף של 2% (w/v) paraformaldehyde (PFA) ו- 2.5% (w/v) גלוטראלדהיד (ג'י אי) ב 1 x PBS. עבור מלשן, מספיקה 400 מ. לחסוך 50 מ ל 50 מ ל צינור חרוטי עבור קיבוע שאחרי של המוח לאחר זלוף.
- עזים ומתנגד העכברוש עם גז איזופלוריין 4 – 5% (ב 0.8 L/דקה O2 בר 1.0 ב 21 מעלות צלזיוס) למשך 15 דקות.
- תזריק מנה קטלנית של פנטל intraperitoneally (180 מ"ג/ק"ג).
- מבחן עבור אובדן רפלקס לחיה על ידי ביצוע בדיקת רפלקס הבוהן-קורט. לחכות כדי להתחיל את זלוף עד החיה איבדה את תגובתה רפלקס.
- בצע את intracardial שתואר לעיל זלוף והמוח החילוץ פרוטוקול14 עם הפתרונות הבאים: perfuse החיה עם 400 מ של PBS 1 x 125 מ"מ כספית כדי להסיר את הדם. לאחר כל הדם הוסר והוחלף 1 x PBS, להתחיל מה קורה עם 400 מ של פתרון של 2%, כדורגלן ו- 2.5% GA מומס 1 x PBS 125 מ"מ כספית.
הערה: אם ההליך זה מתבצע בחיה זה לא עכברוש, הרכיבים החשוב היחיד של ההליך זלוף הם השימוש 1-PBS ו- 2% מחברים, 2.5% GA ב- 1 x PBS. פתרון אחסון ואת הלחץ זלוף עשוי להיות מותאם על פי המין.
2. קיבוע שאחרי
- למקם את המוח שחולצו 2% מחברים, GA 2.5% 1 x PBS פתרון (באותו פתרון נהגה perfuse החיה בעבר). ודא כי אמצעי האחסון פתרון לפחות 10 x הנפח של המוח. על חולדות, מקום במוח צינור חרוטי 50 מ עם 50 מ של פתרון. לאחסן את הדגימה קיבוע שאחרי 2-3 ימים, רועדת קלות ב 4 º C.
הערה: אם המדגם הוא צינור חרוטי 50 מ ל, הנחתה אופקית על תפקודי לב / נשימה יבטיח את התוצאות הטובות ביותר. - לאחר המדגם שלאחר תוקנה זמן רב מספיק, לשטוף את דגימת מים מזוקק פעמיים (ddH2O), מים מיוננים (לשכפל2O) או מים הנדסה גנטית (ראה טבלה של חומרים) ארבע פעמים עבור משכי הזמן הבאים: 1, 1, 1 ו- 15 דקות.
הערה: עבור פרוטוקול זה, ddH2O, לשכפל2O או הנדסה גנטית המים צריך להיות להחלפה. פשטות, ddH2O ישמש כדי להפנות מים מורתחים מעתה ואילך.
3. צביעת
התראה: בשלב זה, התנהגות כל ההכנות פתרון ברדס תוך שימוש בכפפות.
- להכין לפחות 10 x נפח המוח של צביעת פתרון. עבור המוח עכברוש, להכין 50 מ של 2% (w/v) אוסמיום ארבע-חמצני (OsO4) ב- ddH2O על ידי שילוב של 25 mL בפתרון4 OsO 4% מניות ו- 25 מ של ddH2O.
התראה: אוסמיום ארבע-חמצני הוא הפכפך, עלולה לגרום עיוורון זמני ובעיות בדרכי הנשימה אם לא מטופל כראוי. למחוק את כל החומרים לפנות אוסמיום ארבע-חמצני במיכל סיכון כימי המתאים בתוך גורם מכיל משנית. - למקם את המוח צינור חרוטי 50 מ"ל ולהוסיף את הפתרון4 OsO. המוח יתחיל להיות חומים כמו OsO4 מגיב עם שומנים ברקמות.
- לסגור את הצינור, לאטום אותו ביסודיות עם פרפין סרט (ראה טבלה של חומרים) כדי להבטיח כי שהיא אינה דולפת במהלך הדגירה.
הערה: אוסמיום הוא תנודתי, יגיב במתינות עם הפלסטיק של הרכבת התחתית, אז איטום הצינור כראוי חשוב מאוד. הצינור עשוי להיות עטוף ברדיד אלומיניום, כדי לספק הגנה נוספת. - אחסן את הצינור אטום ב 4 ° C, רועדת קלות על תפקודי לב / נשימה ב-50 סל ד 2 שבועות. הצב צינור אופקי כדי להבטיח ערבוב הטוב ביותר. ודא כי המדגם באופן מלא שקוע בפתרון תוך טלטול.
הערה: אם אוסמיום אסורה לזרום ללא הרף, היא אולי לא באופן מלא לחדור המדגם, אז מיקום אופקי על ניעור הוא חשוב מאוד.
4. הטמעת
- לאחר המדגם מודגרות OsO4 2 שבועות, לשטוף אותו עם ddH2O 5 פעמים בטמפרטורת החדר (RT) עבור משכי הזמן הבאים: 1, 1, 1, 15, ו- 60 דקות כדי להסיר את כל ה לא מאוגד OsO4 במדגם.
הערה: החילופים מרובות, כולל החלפת 60 דקות האחרונות, נחוצים לאפשר את כל אוסמיום במערכת הדם לנטרל את החוצה. - לשטוף את הדגימה עם ddH2O למשך 30 דקות ב 4 º C.
הערה: אוסמיום עלולה להמשיך לפזר מתוך המדגם, אך הכמות שלו צריך להיות מופחת באופן משמעותי מהשלב הקודם. - מייבשים את הדגימה עם אתנול לחדור אותה בסופו של דבר עם שרף. מייבשים, להחליף את ddH2O 10 – 20 מ של אתנול מדילולים (למשך 30 דקות כל ב 4 ° C): 20% (v/v) אתנול ו- 80% (v/v) ddH2O; אתנול 50% (v/v) ו- 50% (v/v) ddH2O; אתנול 70% (v/v) ו- 30% (v/v) ddH2O; אתנול 90% (v/v) ו- 10% (v/v) ddH2O; 100% אתנול.
- הכינו את דילולים אצטון/שרף כדלקמן.
- היכונו 100 מ של השרף הטבעה (ראה טבלה של חומרים) לפי הוראות היצרן.
- כדי להפוך 33% (v/v) שרף - 67% פתרון אצטון, שופכים 15 מ"ל של שרף לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל ולהוסיף 30 מ של 100% מזוקק זכוכית אצטון.
- כדי להפוך אצטון שרף - 50% 50% (v/v), שופכים 22.5 מ של שרף לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל ולהוסיף 22.5 מ ל 100% מזוקק זכוכית אצטון.
- כדי להפוך 67 (v/v) שרף - 33% פתרון אצטון, למזוג 30 מ של שרף לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל ולהוסיף 15 מ"ל של 100% מזוקק זכוכית אצטון.
- השתמש mL 32.5 הנותרים של שרף כפתרון הראשון של 100% שרף להלן.
- להתחיל את תהליך הסתננות שרף על-ידי הזזת את הדגימה דרך 10-20 מ של אצטון, אצטון/שרף מדילולים: אצטון 100% למשך 30 דקות ב 4 ° C; אצטון 100% למשך 30 דקות ב 4 ° C; אצטון 100% למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
הערה: שאר תהליך הסתננות יתקיים ב- RT. - לטבול את הדגימה ב 33% (v/v) שרף 67% אצטון עבור 3 h ב- RT, אז אצטון שרף - 50% 50% (v/v) עבור 3 h ב- RT, 67% (v/v) שרף אצטון 33% עבור 3 h ב- RT, ושרף 100% עבור 12 h RT.
- הפוך אצווה מ"ל של שרף ועקוב אחר ההוראות על הבקבוק. להעביר את הדגימה אל המיכל שבו ניתן לרפא (למשל., תבניות חד פעמיות המתוארות בטבלה של חומרים). להשרות את הדגימה עם שרף 100% טרי למשך 4 שעות ב- RT.
הערה: אם לא משמש טרי שרף, השרף את היום הקודם יתחיל להקשיח בטרם עת ולאחר המדגם יהיה קשה לתמרן. - דגה המדגם בתנור ואקום למשך 15 דקות ב 45 º C.
הערה: שלב זה יעזור להסיר את כל הבועות אוויר לכוד בתוך המדגם, אבל זה הטפל לא ישפיעו על איכות הנתונים. - לבסוף, לרפא את הדגימה בתנור במשך 48 שעות ב 60 מעלות צלזיוס.
5. מיקרו-CT
- פעם אחת כבר נרפא את הדגימה, לקלף את התבנית חד פעמיות ולסרוק אותו עם המכונה מיקרו-CT.
הערה: בהתאם המכונה בשימוש בהגדרות יהיה שונה. עבור הסורק בשימוש על ידי המחברים המופיעים בטבלה של חומרים, ההגדרות המומלצות הן 130 kV, 135 µA עם מסנן 0.1 מ מ נחושת, מוליבדן מקור, חשיפה שניה אחת של ממוצע של 4 מסגרות הקרנה. עם זאת, ניסויים צריך לכייל את הסורק בנפרד, כמו גורמים רבים ישפיעו על ההגדרות האופטימליות במהלך הפעלה מסוימת. - עם סיום הסריקה, לשחזר את הדגימה עם הפרמטרים מומלצים לשילוב של הנסיין סורק/תוכנה במחשב עם שתוכנת הסורק.
- לבסוף, להמחיש ולנתח האחסון הדיגיטלי המשוחזרת באמצעות התוכנה של הנסיין של בחירה (ראו טבלה של חומרים דוגמאות).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באופן מסורתי, המוח למחלקה, צבעונית על מנת לכמת נגעים ולאתר אלקטרודות, אך שיטה זו מועדת לשגיאות שדורשת, בדרך כלל דורש הערכה של התוצאות. על-ידי הכנת כל המוח עבור מיקרו-CT הדמיה, הקטינה באופן משמעותי ההסתברות של פגיעה הדגימות, תכונות של הריבית עשויה להיות מנותח בהקשר של המוח כולו, השיטה משאיל את עצמו כדי עיבוד מקבילי של דגימות רבות, במידה ניכרת זירוז הכנת הדוגמא.
השיטה כוללת ארבעה שלבים עיקריים: (1) צביעת מוח perfused עם אוסמיום ארבע-חמצני (2) הטבעה את המוח שרף, (3) הדמיה את המוח עם סורק מיקרו-CT, (4) ניתוח אמצעי האחסון הדיגיטלי שנוצר (איור 1). במאמר זה, מתוארים רק שלבים 1-3, כמו שלב 4 (הניתוח) משתנה במידה ניכרת בהתאם לצרכים הספציפיים של הפרויקט.
בעוד ב מסורתי חלוקתה שבו כיוון אופטים חייבים לבחור מראש, האחסון הדיגיטלי שנוצר משיטה זו עשויה להיות מניפולציות בשלושה ממדים כמעט פרוסים לרוחב כל (איור 2a-2b). המשתמש יכול לסרוק גם סעיף משנה של המדגם ברזולוציה גבוהה יותר, אם רצונך בכך, כמו פקעת הריח של מוח עכברוש, כאשר סיבי עצב ו glomeruli בודדים הם גלויים (איור 2c). השיטה זו גם בהרחבה החלים מוח בעל חיים קטן. כדי לאמת זאת, מוח זברה פינק הוכנה באמצעות באותו פרוטוקול המשמש את השכל עכברוש וכתוצאה אמצעי אחסון דיגיטלי מוצלח (איור 2e). סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM) של מדגם שהוכנו עבור מיקרו-CT אישר כי הרקמה לא נפגע עד בסדר גודל ברזולוציה מעבר הרזולוציה של ה-micro-CT (איור 2d). עם זאת, יש לציין שהיה שם נזק ניכר ultrastructural, ביצוע טכניקה זו מצוייה מיקרוסקופ אלקטרונים (EM).
הטכניקה עשוי לשמש כדי למצוא נגעים פני השטח (איור 3) נגעים עמוק בתוך המוח (איור 4). הטכניקה מאפשרת גם את איתור של tetrodes יחיד ב באתרו, נגעים electrolytic, מסילות אלקטרודה בקוטר מספיק, tetrode מערכים בתוך באתרו, וסיליקון רגשים בחיי עיר (איור 5).
ההכנות כושל שתרכיב לא שלם מינרליזציה של הרקמה, אשר עלול להתרחש גם אם שגוי מאגרי משמשים (איור 6). עם זאת, אם רק תכונות פני השטח הדרוש, לדוגמה, ואז מכתים השטח בלבד מדגם עשוי להיות מספיק עבור הנסיין.
איור 1 : שיטה סקירה. סקירה של כל השלבים הדרושים כדי להכין ולנתח מוח שלם באמצעות מיקרו-CT הדמיה. איור בשימוש באישורו של מחברים13. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : היכולות של הנגע אפיון באמצעות מיקרו-CT הדמיה- () Manipulatable תלת-ממד האחסון ו- (b) וירטואלי פרוסות (13.9 מיקרומטר voxels)-אוריינטציות שרירותי של מיקרו-סריקה של חולדה לונג-אוונס. (ג) הנורה הריח סריקה ברזולוציה גבוהה יותר (4.9 voxels מיקרומטר) חשיפת glomeruli (חץ לבן) סיבי עצב בודדים (חץ כחול). (ד) לסרוק בעזרת מיקרוסקופ אלקטרון (SEM) תמונה (nm 10 לפיקסל) של קליפת הראיה של מוח עכברוש שהוכנו עבור מיקרו-CT הדמיה. המוח (e) זברה פינק (Taeniopygia guttata) שהוכנו עבור מיקרו-CT הדמיה; נפח 3D ו- 2D פרוסות (5.6 מיקרומטר voxels) הפרונטליים, אופקי ולאחר sagittal מטוסים. איור בשימוש באישורו של מחברים13. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : קליפת הנגע אפיון באמצעות מיקרו-טי () לוויזואליזציה תלת-ממדית של מוח עכברוש lesioned של קליפת הראיה עם חומצה quinolinic. החלונית השמאלית מציגה את נפח הנגע בהקשר של המוח (המוח גרם מעט שקופים כדי לאפשר גישה ויזואלית הנגע). הלוח נכון מציג נפח הנגע מבודד. (b) פרוסות 2D של הנגע הפרונטליים, אופקי ולאחר sagittal מטוסים (12.8 מיקרומטר voxels). הלוחות 3 העליון הצג את הסעיפים unsegmented, ולהראות הלוחות התחתון 3 חלקים עם ביאור הנגע הלשונית. זה היה באופן ידני מבואר בכיוון הילתית כל פרוסות 2. אמצעי האחסון נוצר לאחר מכן באמצעות אינטרפולציה. איור בשימוש באישורו של מחברים13. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: השוואה של dorso-לרוחב סטריאטום הנגע אפיון באמצעות מיקרו-CT והיסטולוגיה. () Sagittal, אופקי, הילתית ונופים של השמאל חצי מהמוח"1" מעובד עבור מיקרו-CT הדמיה (13.5 voxels מיקרומטר). הלוחות 3 העליון הצג סעיפים unsegmented, הלוחות התחתון 3 הצג את הנגע מוערת על הנוכשה. הנגע היה באופן ידני מקוטע בתוך המטוס sagittal כל 2 סעיפים, לאחר מכן אינטרפולציה. (b) הקרוב ביותר בסעיף הילתית תואמות של הזכות חצי מהמוח"1" מעובד בהיסטולוגיה עבור מיקרוסקופ אור. פאנלים (c, d) דומים (a, b) אבל שיתאימו "מוח 2". הנגע המוח 2 היה מקוטע ידנית במטוס הילתית כל סעיפים 8. (e) הנגע אפיון שטופלו היסטולוגיה נכון חצאי המוח 1 (אפור כהה) ו-2 (אפור בהיר). המספרים (b, d, e) מתחת הלוחות תואמות עמדות ביחס bregma. (f) אפיון הנגע של השמאל חצי מהמוח 1 מעובד עבור מיקרו-טי הפאנל הראשון מראה הנגע מבודד. הלוחות השני והשלישי להראות הנגע בהקשר של המוח מתוך שתי נקודות מבט. (g) זהה (נ) אבל המתאימים במוח 2. (h) כיסוי של נגעים ב (f, g) הממחישות את יכולת השוואה של הנגע אפיון עם אמצעי אחסון דיגיטלי המוח. הנגע ב (נ) נרשמה על הנגע ב (g), שתיהן מוצגות בהקשר של החצי השמאלי של המוח 2. איור בשימוש באישורו של מחברים13. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : לוקליזציה אלקטרודה דרך מיקרו-CT הדמיה- () יחיד tetrode השמאלי בחיי עיר (14.0 מיקרומטר voxels). החלונית השמאלית העליונה: מקס-עוצמת הקרנה סעיפים הילתית וירטואלי המציג את המיקום של tetrode nichrome נסיעה דרך קליפת הראיה לתוך כפיס המוח של חולדה; למעלה מימין: תקריב של התמונה המוצגת בחלונית השמאלית העליונה של (א) (מלבן לבן). ימין למטה: הווריד; הימנית התחתונה: נופים אופקי של האלקטרודה מושתל (חץ לבן מציין מיקום tetrode). (b) אלקטרוליטי הנגע, אלקטרודה לעקוב אחר באזור הקדמי של מוח עכברוש (13.9 מיקרומטר voxels). למעלה משמאל: עיבוד תלת-ממד של מוח עם הנגע electrolytic מקוטע החוצה (חץ לבן המציין הנגע סגול); למעלה מימין: ניתן לומר. ימין למטה: הווריד; הימנית התחתונה: סעיפים האופקי המציין electrolytic הנגע (החצים הלבנים) מיוצר עם אלקטרודה טונגסטן בקוטר 75 מיקרומטר. בנוסף, חתיכת מתכת שהופקדו על ידי האלקטרודה על הכחשה מוצגת לאורך המסלול בתצוגה הסאגיטלי (חץ לבן). (ג) 16-tetrode שתל עזב ב באתרו בקליפה של המוח חולדה. למעלה משמאל: עיבוד תלת-ממד של מוח שלם עם מערך 16-tetrode מושתל נשאר; למעלה מימין: ניתן לומר. ימין למטה: הווריד; הימנית התחתונה: סעיפים האופקי המציין שתל 16-tetrode (voxels מיקרומטר 8.9). בדיקה (d) סיליקון (shank 10 מ מ, 32 אתרי) עזב ב באתרו עוברת קליפת המוח האחורי, ההיפוקמפוס והמבנים subcortical (מיקרומטר 13.9 voxels). למעלה משמאל: עיבוד תלת-ממד של מוח שלם גשש מקוטע סיליקון (חץ לבן אנלוגיים ירוק העצמית); למעלה מימין: ניתן לומר. ימין למטה: הווריד; הימנית התחתונה: נופים אופקי של סיליקון בדיקה במוח. בנוסף, האתר הפניה על החללית הסיליקון הוא גלוי בסעיפים הילתית הסאגיטלי (קצה החצים הלבנים). איור בשימוש באישורו של מחברים13. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6 : השפעת הממס אוסמיום ארבע-חמצני על חדירה אוסמיום. החלונית השמאלית (): מוח עכברוש מודגרות באוסמיום ארבע-חמצני ddH2O במשך שבוע. לוח נכון: מוח עכברוש מודגרות באוסמיום ארבע-חמצני ddH2O 2 שבועות. (b) שני עכברים המוח מתפשט באוסמיום ארבע-חמצני במאגר cacodylate נתרן במשך ששה שבועות. איור בשימוש באישורו של מחברים13. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
להלן השלבים הקריטיים לפרוטוקול: ראשית, השימוש בשילוב של כדורגלן GA perfuse החיה, לאחר מכן שלאחר ולתקן את המוח היה בעל חשיבות עליונה כדי להשיג חדירה עקבית אוסמיום מלא של הרקמה. למרות שאנחנו? לא לבדוק את זה במפורש, הסבר מתקבל על הדעת הוא כדורגלן קיבעון הוא הפיך15, ואילו קיבוע GA אינו הפיך16,17. כי דגירה שבועיים באוסמיום ארבע-חמצני נדרשת עבור חדירה מלאה של הרקמה, זה אפשרי כי מחברים הפנים של המוח מפזרת את ופוגם הרקמה במהלך צביעה. אוסמיום ולכן לא יכול לשמור על המבנים הפנימיים.
השימוש של אוסמיום מימית, בניגוד אוסמיום מומס מאגר (קרי, נתרן cacodylate), היה הכרחי להבטיח חדירה לרקמות מלא על-ידי אוסמיום. גם לאחר דגירה שבוע 6, אוסמיום מומס נתרן cacodylate לא לחדור את הרקמה לחלוטין והופיעה למפגש מחסום דיפוזיה (איור 6). אוסמיום מאוד תגובתי ל שומנים, חשבתי לקשור את קרום התא18,19,20. אם הרקמה לא permeabilized מספיק, כפי שאולי במקרה של מאגר עדין כמו נתרן cacodylate, זה אפשרי כי קרום התא יכול להרוות עם אוסמיום ולמנוע sterically אוסמיום יותר לשדר לתוך הרקמה. לחזות, עם זאת, מים הפשר אוסמיום פועל כמו חומר ניקוי קל, permeabilizes הרקמה מספיק כדי לאפשר דיפוזיה עמוק לתוך הרקמה.
אם ניסויים מכינים מוח קטן יותר, כמו זה של עכבר, זמן הדגירה באוסמיום יכול סביר להיות מופחת. באופן דומה, זמן הדגירה צריך להיות מוגברת בדגימות גדול יותר. ניתן לבדוק כדי לקבוע את הזמן המינימלי עבור צביעת עקבי במוח בגודל שונה מזה של חולדה. אם ניסויים נתקל בבעיות עם חדירה מלאה אוסמיום, הבעיות סביר שלא משתמשים מחברים והן GA במהלך זלוף, קיבוע שאחרי, לא באמצעות מים כמו הממס אוסמיום (כמתואר לעיל), אין די עצבנות במהלך אוסמיום הדגירה. מצאנו, למשל, כי כאשר המקננת צינורות חרוט 50 מ ל, הנחת הצינורות בצד שלהם (בניגוד ל אנכית על בעל), מילוים הכתם, ומניח אותם על תפקודי לב / נשימה ב-50 סל ד עבור הדגירה כולו מובטחת נקודה נכונה הסתננות.
שיטה זו מוגבל במספר דרכים. ראשית, ההכנה אינו משמר ultrastructure טוב מאוד, כך לא צריכה להשתמש עבור מיקרוסקופ אלקטרונים. בשיטה זו אין אפשרות לשלב עם היסטולוגיה נוסף או immunofluorescence. הרזולוציה של אמצעי האחסון הדיגיטלי של נקבעת לפי גודל המדגם (דוגמאות קטנות ניתן לסרוק ברזולוציות גבוהות יותר) ועל -ידי הצורה הגיאומטרית של הסורק, אם זה מסתמך על ההגדלה גיאומטריים; עם זאת, ניתן לסרוק סעיפים קטנים של המדגם ברזולוציות גבוהות יותר, אם רצונך בכך.
שיטה חדשה המשלבת טיפול רקמות מיקרוסקופ אלקטרונים בסגנון עם מיקרו-CT הדמיה לחבלות לכימות, לוקליזציה אלקטרודות במוח בעלי חיים קטנים הוצגו. בשיטה זו ניתן לטעון פחות מייגעת, דורש מומחיות פחות, מניבה תוצאות ניתנות למדידה בקלות רבה יותר מאשר תקן הזהב הנוכחי חלוקתה, צביעת מוח. בעבר, מדענים תיארו פרוטוקול לחדירה אוסמיום אפילו במוח העכבר שנועדה לשמר את ultrastructure מיקרוסקופ אלקטרונים21,22. פרוטוקול זה, אולם, הוא מורכב למדי. במחקר זה, המחברים שמטרתו לפתח שיטה הרבה יותר פשוטה עבור מיקרו-CT הדמיה במקום מיקרוסקופ אלקטרונים. היו מחקרים אחרים החלת מיקרו-CT הדמיה המוח למטרות שונות. חקירה קודמות ארנבים ועכברים בהם מיקרו-CT כדי למצוא גידולים, חריגות אחרים23. החקירה הזאת עשתה שימוש של סוכנים בניגוד MRI קניינית, אך החוקרים לחזות התועלת פוטנציאלי של מיקרו-CT במחקרים הנגע. מחקר אחר בעכברים שמטרתו מציאת הבדלים מורפולוגיים ברוטו עבור מסך סמים מעורב ההכתמה של מוח העכבר עם יוד בגולגולת, אבל המחברים בפני הצטמקות רקמה לא אחידה, העדיפו להטביע את הרקמה הידרוג24. מחקרים אחרים בעכברים כיוונת כדי למצוא את מוחי מומים חלול, הפרעה של נימים גדולה באופן חריג ולא סדירות, עשו שימוש אוסמיום ארבע-חמצני יוד מימית כמו כתמים; עם זאת, אלה בוצעו בדגימות הרבה יותר קטן (העכבר מנותקת hindbrains) ממה שמתואר כאן26,25,27. שיטות אלטרנטיביות ליצירת אמצעי אחסון המוח 3D הם µMRI28 מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה episcopic31. הרזולוציה של µMRI הוא עניים (~ 25 מיקרומטר voxels עבור מדגמים דומים28), הטכניקה היא23,יקרים יותר30. מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה episcopic פונה גם אתגרים: כי זאת שיטה הרסנית, מנגנון בלוק-הפנים ומאפשר שלם-מוח חלוקתה היה צריך להיות מיוצר. העבודה המוצגת כאן גם מרחיב הקודם מאמצים לאתר את אלקטרודות במוח. עם צילומי רנטגן32,33,34 על-ידי לכידה שני האלקטרודה של הרקמה שמסביב. יתר על כן, הטכניקה מאפשרת איתור אלקטרודות יחיד, tetrode מערכים, נגעים electrolytic, רצועות אלקטרודה וזונדים סיליקון.
כיוון עתידי יקר היה יצירה של אטלס "המוח הממוצע" אשר הנגע מחקרים יכול להיות שיתוף רשום לתקנן כימות הגודל והמיקום של הנגע. שיטה זו עשויה גם להיות מורחבת אחרים מודל של אורגניזמים שאינם-דגם, למשל, היישום שלה מיידית למוח זברה פינק (איור 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים תודה גרג לין, ארתור מק'קללנד על המומחיות שלהם עם מכונת מיקרו-CT, דיויד ריצ'מונד, צייד אליוט על התמונה ו- Core ניתוח נתונים (IDAC) בבית הספר לרפואה בהרווארד לעיבוד עצה תמונה שלהם, ויליאם ליברטי בבוסטון אוניברסיטת למתן באדיבות מוח זברה פינק. העבודה בוצעה באופן חלקי במרכז עבור ננו מערכות (CNS), חבר של נבחרת ננוטכנולוגיה מתואמת תשתית רשת (NNCI), אשר נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע תחת ה-NSF פרס 1541959 מס. מערכת העצבים המרכזית היא חלק של אוניברסיטת הרווארד. עבודה זו נתמכה על ידי ריצ'ארד, קרן משפחת סמית סוזן IARPA (חוזה #D16PC00002). S.B.E.W. נתמך על ידי מלגות מתוך התוכנית המדע הגבול האנושי (HFSP; LT000514/2014), בארגון האירופי לביולוגיה מולקולרית (EMBO; ALTF1561-2013). מטרות נעלות נתמכה על ידי קרן המדע הלאומית (NSF) לתואר שני מחקר מלגת התוכנית (GRFP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | 2% (w/v/) in 1X PBS |
| Glutaraldehyde (GA) | EMS | 16220 | 2.5% (w/v) GA in 1x PBS |
| OsO4 | EMS | 19190 | Work in fume hood |
| Ethanol | Decon Labs | Koptec | 140, 190, 200 proof |
| Acetone | EMS | 10015 | Glass-distilled |
| Durcupan ACM resin | Sigma-Aldrich | 44610 | A, B, C and D components, resin for embedding |
| Disposable molds | Ted Pella | 27114 | Suggested |
| milliQ water (ultrapure water) | Millipore Sigma | QGARD00R1 (or related purifier) | Suggested |
| Parafilm (paraffin film) | Millipore Sigma | P7793 | Suggested paraffin film |
| Micro-CT scanner | Nikon Metrology Ltd., Tring, UK | X-Tek HMS ST 225 | Used by authors |
| Software for visualizing and analyzing micro-CT scans: | |||
| Volume Graphics | VG Studio Max | Used by authors | |
| FEI / Thermo Scientific | Avizo | Used by authors | |
| FEI / Thermo Scientific | Amira | Similar to Avizo | |
| Mark Sutton & Russell Garwood | Spiers | Free, http://spiers-software.org/ | |
| Pixmeo Sarl | Osirix Lite | Free, https://www.osirix-viewer.com/ | |
| Open Source | FIJI | Free, https://fiji.sc/ | |
| Adobe | Photoshop | Good for analyzing one slice at a time |
References
- Scoville, W., Milner, B. Loss of recent memory after bilateral hippocampal lesions. Journal of Neuropsychiatry and Clinical Neuroscience. 12, 103-113 (2000).
- Damasio, H., Grabowski, T., Frank, R., Galaburda, A. M., Damasio, A. R. The return of Phineas Gage: clues about the brain from the skull of a famous patient. Science. 264 (5162), 1102-1105 (1994).
- Kawai, R., et al. Motor cortex is required for learning but not for executing a motor skill. Neuron. 86, 800-812 (2015).
- Otchy, T., et al. Acute off-target effects of neural circuit manipulations. Nature. 528, 358-363 (2015).
- Wright, N., Vann, S., Aggleton, J., Nelson, A. A critical role for the anterior thalamus in directing attention to task-relevant stimuli. Journal of Neuroscience. 35, 5480-5488 (2015).
- Kapgal, V., Prem, N., Hegde, P., Laxmi, T., Kutty, B. Long term exposure to combination paradigm of environmental enrichment, physical exercise and diet reverses the spatial memory deficits and restores hippocampal neurogenesis in ventral subicular lesioned rats. Neurobiology of Learning and Memory. 130, 61-70 (2016).
- Hosseini, N., Alaei, H., Reisi, P., Radahmadi, M. The effects of NBM- lesion on synaptic plasticity in rats. Brain Research. 1655, 122-127 (2017).
- Palagina, G., Meyer, J., Smirnakis, S. Complex visual motion representation in mouse area V1. Journal of Neuroscience. 37, 164-183 (2017).
- Ranjbar, H., Radahmadi, M., Reisi, P., Alaei, H. Effects of electrical lesion of basolateral amygdala nucleus on rat anxiety-like behavior under acute, sub-chronic, and chronic stresses. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. , (2017).
- Wood, R., et al. The honeycomb maze provides a novel test to study hippocampal-dependent spatial navigation. Nature. , (2018).
- Vermaercke, B., et al. Functional specialization in rat occipital and temporal visual cortex. Journal of Neurophysiology. 112, 1963-1983 (2014).
- Jun, J. J., et al. Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity. Nature. 551, 232-236 (2017).
- Masís, J., et al. micro-CT-based method for quantitative brain lesion characterization and electrode localization. Scientific Reports. 8, 5184 (2018).
- Gage, G., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. 65, 3564 (2012).
- Helander, K. Kinetic studies of formaldehyde binding in tissue. Biotechnic & Histochemistry. , (1994).
- Paljärvi, L., Garcia, J., Kalimo, H. The efficiency of aldehyde fixation for electron microscopy: stabilization of rat brain tissue to withstand osmotic stress. Histochemical Journal. , (1979).
- Okuda, K., Urabe, I., Yamada, Y., Okada, H. Reaction of glutaraldehyde with amino and thiol compounds. Journal of Fermentation and Bioengineering. 71, (1991).
- Bahr, G. Osmium tetroxide and ruthenium tetroxide and their reactions with biologically important substances: electron stains III. Experimental Cell Research. , (1954).
- Khan, A. A., Riemersma, J. C., Booij, H. L. The reactions of osmium tetroxide with lipids and other compounds. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 9, 560-563 (1961).
- Riemersma, J. Osmium tetroxide fixation of lipids for electron microscopy a possible reaction mechanism. Biochimica et Biophysica Acta. 152, (1968).
- Mikula, S., Binding, J., Denk, W. Staining and embedding the whole mouse brain for electron microscopy. Nature Methods. 9, 1198-1201 (2012).
- Mikula, S., Denk, W. High-resolution whole-brain staining for electron microscopic circuit reconstruction. Nature Methods. 12, 541-546 (2015).
- Crespigny, A., et al. 3D micro-CT imaging of the postmortem brain. Journal of Neuroscience Methods. 171, 207-213 (2008).
- Anderson, R., Maga, A. A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with MicroCT using Iodine-Based contrast. PLoS One. 10, 0142974 (2015).
- Zhou, Z., et al. Cerebral cavernous malformations arise from endothelial gain of MEKK3-KLF2/4 signalling. Nature. 532, 122-126 (2016).
- Choi, J., et al. Micro-CT imaging reveals mekk3 heterozygosity prevents cerebral cavernous malformations in Ccm2-Deficient mice. PloS One. 11, 0160833 (2016).
- Choi, J., Yang, X., Foley, M., Wang, X., Zheng, X. Induction and Micro-CT imaging of cerebral cavernous malformations in mouse model. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Benveniste, H., Kim, K., Zhang, L., Johnson, G. Magnetic resonance microscopy of the C57BL mouse brain. Neuroimage. 11, 601-611 (2000).
- Weninger, W. J., et al. High-resolution episcopic microscopy: a rapid technique for high detailed 3D analysis of gene activity in the context of tissue architecture and morphology. Anat Embryol. 211, 213-221 (2006).
- Schneider, J. E., et al. high-throughput magnetic paragraph sign resonance imaging of mouse embryonic paragraph sign anatomy using a fast gradient-echo sequence. MAGMA. 16, 43-51 (2003).
- Sharpe, J.
- Cox, D. D., Papanastassiou, A., Oreper, D., Andken, B., James, D. High-Resolution Three-Dimensional microelectrode brain mapping using stereo microfocal x-ray imaging. Journal of Neurophysiology. 100, 2966-2976 (2008).
- Borg, J. S., et al. Localization of metal electrodes in the intact rat brain using registration of 3D microcomputed tomography images to a magnetic resonance histology atlas. eNeuro. 2, (2015).
- Fu, T. -M., et al. Stable long-term chronic brain mapping at the single-neuron level. Nature Methods. 13, 875-882 (2016).
