Summary
Dit artikel beschrijft een eenvoudige methode ter voorbereiding van kleine dierlijke hersenen van micro-CT beeldvorming, in welke letsels kunnen worden gekwantificeerd en elektroden gelegen met hoge precisie in de context van de hele hersenen.
Abstract
Laesie en elektrode locatie verificatie zijn traditioneel gedaan via histopathologisch onderzoek van gebeitst hersenen segmenten, een tijdrovende procedure waarvoor handmatige schatting. Hier beschrijven we een eenvoudige methode voor de kwantificering van de laesies en lokaliseren van elektroden in de hersenen die is minder moeizaam en meer gedetailleerde resultaten oplevert. Hele hersenen zijn gekleurd met osmium tetroxide, ingebed in hars en beeld met een micro-CT-scanner. De scans resulteren in 3D digitale delen van de hersenen met resoluties en virtuele sectie diktes afhankelijk van de grootte van de steekproef (12-15 en 5-6 µm per voxel voor rat en Zebravink hersenen, respectievelijk). Dagbouw of diepe letsels kunnen gekarakteriseerd worden, en enkele schutterijofficieren, tetrode arrays, elektrolytische laesies en silicium sondes kunnen ook worden gelokaliseerd. Vrije en propriëtaire software kan onderzoekers te onderzoeken het monstervolume van een vliegtuig en segment het volume handmatig of automatisch. Omdat deze methode hele hersenvolume genereert, kunnen laesies en elektroden worden gekwantificeerd om een veel hogere mate dan in de huidige methoden, die zal helpen bij het standaardiseren van vergelijkingen binnen en tussen studies.
Introduction
Neurowetenschappers hebben vertrouwd op laesies voor een lange tijd om te begrijpen van de relatie tussen functie en locatie in de hersenen. Bijvoorbeeld, waren ons begrip van de hippocampus als onmisbaar voor leren en geheugen en van de prefrontale cortex als sleutel voor impuls controle beide producten van serendipitous laesies in mensen1,2. Het gebruik van diermodellen, echter neurowetenschappers om de kracht van letsels door verder te gaan dan serendipity heeft toegestaan, en de functie van talloze hersengebieden heeft zijn toegelicht door middel van systematische studies van de structuur-functie relaties door middel van laesies3,4.
Correct toewijzen functie naar een structuur, echter laesie studies precieze kwantificering procedures, die is een gebied dat heeft ontbroken. De huidige gouden standaard voor het kwantificeren van de laesies is sectie, mount en afbeelding hersenen met een lichte Microscoop. De verbeelde segmenten worden vervolgens vergeleken de dichtstbijzijnde secties op een atlas en de geschatte coördinaten van de laesies over onderwerpen worden niet indirect gerapporteerd, vaak door het gebruik van de camera lucida afbeeldingen of voorbeeld histologische segmenten3,4 ,5,6,7,8,9,10.
Deze technieken zijn buiten de onnauwkeurigheid van de huidige laesie kwantificering procedures, tijdrovend en gevoelig voor storing. Kleine veranderingen in de hersenen stijfheid, blade scherpte en temperatuur kan leiden tot mislukte, kromgetrokken of gescheurde secties. Secties kunnen ook ongelijk vlek en worden onjuist beeld vanwege de bubbels in het medium van de montage. Nog belangrijker is, is de driedimensionale context van de laesie in de locatie in de hersenen op afdelen, verloren, waardoor nauwkeurige 3D-reconstructie van de laesie in de hersenen uitdagend.
Een andere gemeenschappelijke toepassing voor laesies is geweest om de locatie van de single en meerdere opnamen van de elektrode in de hersenen. Aan het einde van de laatste opname-sessie, onderzoekers veroorzaken kleine elektrolytische laesies op het puntje van de elektrode en histologisch zoals gedaan in een conventionele lesion experiment11de hersenen verwerken. Deze techniek lijden onder de dezelfde nadelen hierboven beschreven, met bijkomende problemen is dat de elektrolytische laesies zijn meestal groter dan de elektroden gebruikt om ze te maken, maar meestal klein genoeg zijn dat ze zijn uitdagend vinden histologisch. Wanneer meerdere elektroden worden ingevoegd, zoals in het geval van een matrix van tetrode, is keuring door middel van elektrolytisch laesies zelfs moeilijker. Een alternatief voor elektrolytische laesies is het gebruik van een kleurstof op de elektrode later controleren histologisch12, maar deze techniek lijdt de dezelfde nadelen die met conventionele histologie komen.
Hier beschrijven we diepgaande een recent beschreven methode13 gebaseerd op kleuring technieken in elektronenmicroscopie (EM) en X-ray berekend tomografie (micro-CT) kwantificeert laesies en lokaliseert elektroden in kleine dierlijke hersenen beter dan huidige methoden. Micro-CT is een beeldvormende techniek waarin x-stralen zijn schot op een monster dat is 360° gedraaid, terwijl een scintillator de x-stralen niet afgebogen door het monster verzamelt. Het resultaat is een hoge resolutie digitale 3D reconstructie van het monster die kan worden gevisualiseerd in elke oriëntatie en gekwantificeerd juist. Veel onderwijsinstellingen hebben micro-CT-scanners, die ook commercieel beschikbaar zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle zorg en experimentele manipulatie van dieren werden herzien en goedgekeurd door het Harvard institutionele dier zorg en gebruik Comité. De perfusie hier beschreven is specifiek voor ratten, maar de procedure is van toepassing op alle dieren met kleinere of vergelijkbaar formaat hersenen.
1. perfusie
- Bereiden 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Voor een rat (leeftijd: 0,5-1,5 jaar oud, gewicht: 250 en 600 g), 800 – 1000 mL zou voldoende moeten zijn. Hiermee kunt u dat 400 mL perfuse het dier en een extra 400 mL, Verdun de fixeerspray.
- De bestaande uit 2% (g/v) paraformaldehyde (PFA) en 2,5% (m/v) Glutaaraldehyde (GA) in 1 x PBS fixeerspray voor te bereiden. Voor een rat is 400 mL voldoende. 50 mL in een conische tube van 50 mL voor fixatie van de post van de hersenen na perfusie opslaan.
- Anesthetize de rat met 4-5% Isofluraan gas (bij 0.8 L/min O2 in 1,0 bar bij 21 ° C) gedurende 15 minuten.
- Injecteren van een dodelijke dosis natrium pentobarbital intraperitoneally (180 mg/kg).
- Test voor reflex verlies in het dier door het uitvoeren van een teen-snuifje reflex examen. Wachten om te beginnen de perfusie totdat het dier heeft verloren haar reflex reactie.
- Volg de eerder beschreven intracardial perfusie en hersenen extractie protocol14 met de volgende oplossingen: perfuse van het dier met 400 mL 1 x PBS op 125 mm Hg te verwijderen van het bloed. Zodra alle bloed is verwijderd en vervangen door 1 x PBS, beginnen met 400 mL van een oplossing van 2% zoogdierlevercellen PFA en 2,5% GA opgelost in 1 x PBS op 125 mm Hg.
Opmerking: Als de procedure wordt uitgevoerd in een dier dat is niet een rat, de enige belangrijke onderdelen van de perfusie-procedure zijn het gebruik van 1 x PBS en 2% PFA, 2,5% GA in 1 x PBS. De volumes van de oplossing en perfusie druk kunnen worden aangepast volgens de soort.
2. na fixatie
- Plaats de uitgepakte hersenen in 2% PFA, 2,5% GA in 1 x PBS oplossing (dezelfde gebruikt om het dier eerder perfuse). Zorg ervoor dat het volume van de oplossing ten minste 10 x het volume van de hersenen. Voor ratten, plaatst u de hersenen in een conische buis van 50 mL met 50 mL van de oplossing. Opslaan van het monster in na fixatie voor 2-3 dagen, schudden licht bij 4 ° C.
Opmerking: Als het monster zich in een kegelvormig tube van 50 mL, horizontaal plaatsen op een roteerschudapparaat zorgt voor de beste resultaten. - Nadat het monster is na bevestigd voor lang genoeg, was het monster in tweemaal gedestilleerd water (ddH2van O), de geïoniseerd water (diH2van O) of ultrazuiver water (Zie Tabel van materialen) vier keer voor de volgende duur: 1, 1, 1 en 15 min.
Opmerking: Voor dit protocol, ddH2O, diH2O of ultrazuiver water moet uitwisselbaar. Om redenen van eenvoud zal ddH2O worden gebruikt om te verwijzen naar het gezuiverde water voortaan.
3. kleuring
Let op: Voor deze stap, voeren alle oplossing preparaten onder een motorkap tijdens het gebruik van handschoenen.
- Minstens 10 x het hersenvolume van de kleurstofoplossing voor te bereiden. Voor de rat hersenen, 50 mL 2% (g/v) osmium tetroxide (OsO4) in ddH2O bereiden door het combineren van 25 mL van 4% OsO4 stockoplossing en 25 mL ddH2O.
Let op: Osmium tetroxide is vluchtig en tijdelijke blindheid en ademhalingsproblemen kan veroorzaken als niet correct afgehandeld. Gooi alle materialen die contact maken met de osmium-tetroxide in een container van de juiste chemische gevaren in een secundaire container. - Plaats van de hersenen in een nieuwe conische tube van 50 mL en voeg de OsO4 oplossing. De hersenen moet beginnen te verkleuren en worden bruin als OsO4 met lipiden in het weefsel reageert.
- Sluit de tube en verzegel het grondig met parafin film (Zie Tabel van materialen) om ervoor te zorgen dat het niet tijdens de incubatie lekken doet.
Opmerking: De osmium is vluchtig en mild zal reageren met de kunststof van de buis, dus goed afdichten van de buis erg belangrijk is. De buis kan worden verpakt met aluminiumfolie voor extra bescherming. - Bewaar de verzegelde buis bij 4 ° C, licht schudden op een roteerschudapparaat 50 rpm voor 2 weken. Plaats de buis horizontaal om ervoor te zorgen het beste mengen. Zorg ervoor dat het monster volledig is ondergedompeld in de oplossing, terwijl het schudden.
Opmerking: Als de osmium mag niet voortdurend circuleren, het kan niet volledig doordringen het monster, dus horizontale plaatsing op het schudapparaat zeer belangrijk is.
4. insluiten
- Nadat het monster heeft geweest ge¨ uncubeerd OsO,4 2 weken, wassen met ddH2O 5 keer bij kamertemperatuur (RT) voor de volgende duur: 1, 1, 1, 15 en 60 min voor het verwijderen van alle de niet-afhankelijke OsO4 in de steekproef.
Opmerking: De meerdere uitwisselingen, inclusief de laatste 60 min uitwisseling, zijn nodig om alle de osmium toestaan in de bloedsomloop te verspreiden uit. - Wassen van het monster met ddH2O gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
Opmerking: Osmium kan blijven verspreiden uit de steekproef, maar de hoeveelheid sterk moet worden verminderd in de vorige stap. - Uitdrogen van het monster met ethanol te infiltreren het uiteindelijk met hars. Als u wilt uitdrogen, vervangen door de ddH2O 10-20 mL van de volgende verdunningen van het ethanol (voor 30 min elke bij 4 ° C): 20% (v/v) ethanol en 80% (v/v) ddH2O; 50% (v/v) ethanol en 50% (v/v) ddH2O; ethanol 70% (v/v) en 30% (v/v) ddH2O; ethanol 90% (v/v) en 10% (v/v) ddH2O; 100% ethanol.
- Maak de aceton/hars verdunningen als volgt.
- Voorbereiden op 100 mL van de hars inbedding (Zie Tabel van materialen) volgens instructies van de fabrikant.
- Om de 33% (v/v) hars - 67% aceton oplossing, 15 mL hars giet in een conische tube van 50 mL en voeg toe 30 mL 100% glas-gedistilleerd aceton.
- Om de 50% (v/v) hars - 50% aceton, 22.5 mL hars giet in een conische tube van 50 mL en voeg 22.5 mL 100% glas-gedistilleerd aceton.
- Om de 67% (v/v) hars - 33% aceton oplossing, giet 30 mL van de hars in een conische tube van 50 mL en 15 mL 100% glas-gedistilleerd aceton toevoegen.
- Gebruik van hars de resterende 32,5 mL als de eerste oplossing van 100% hars hieronder.
- Beginnen met het proces van hars infiltratie door het bewegen van het monster door 10-20 mL van de volgende verdunningen van aceton en aceton/hars: 100% aceton gedurende 30 minuten bij 4 ° C; 100% aceton gedurende 30 minuten bij 4 ° C; en 100% aceton gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT).
Opmerking: De rest van de infiltratie-proces zal plaatsvinden op RT. - Dompel het monster in 33% (v/v) hars 67% aceton voor 3U op RT, dan 50% (v/v) hars - 50% aceton voor 3U op RT, 67% (v/v) hars 33% aceton gedurende 3 uur bij RT en 100% hars voor 12u op RT.
- Maak een batch van de verse 50 mL hars, volg de instructies op de fles. Het monster overbrengen in de container waarin het zal worden uitgehard (bv., de wegwerp mallen beschreven in Tabel van materialen). Infusie van het monster met verse 100% hars voor 4 uur op RT.
Opmerking: Verse hars niet wordt gebruikt, de hars gemaakt van de vorige dag zal beginnen te harden voortijdig als het monster zal moeilijk zijn om te manipuleren. - Degas het monster in een vacuüm oven gedurende 15 minuten staan bij 45 ° C.
Opmerking: Deze stap zal helpen verwijderen van alle gevangen luchtbellen in de steekproef, maar het is van niet-essentiële en zal geen invloed op de kwaliteit van de gegevens. - Tot slot, het genezen van het monster in de oven gedurende 48 uur bij 60 ° C.
5. micro-CT
- Zodra het monster is gedroogd, afschilferen van de beschikbare schimmel en scannen met de micro-CT-machine.
Opmerking: Afhankelijk van de machine gebruikt, de instellingen zullen afwijken. Voor het scannermodel dat is gebruikt door de auteurs vermeld in de Tabel van de materialen, de aanbevolen instellingen zijn 130 kV, 135 µA met een filter van 0.1 mm koper en een bron van molybdeen, een 1 seconde blootstelling en een gemiddelde van 4 beelden per projectie. Echter, onderzoekers moeten kalibreren de scanner afzonderlijk, zoals vele factoren zullen van invloed zijn op optimale instellingen tijdens een bepaalde sessie. - Zodra het aftasten wordt voltooid, reconstrueren het monster met de aanbevolen parameters voor de de experimentator scanner/software combinatie op een computer met software van de scanner.
- Ten slotte, visualiseren en analyseren van het gereconstrueerde digitale volume met behulp van de experimentator software van keuze (Zie Tabel van materialen voor voorbeelden).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Traditioneel, hersenen zijn gesegmenteerd en gekleurd om te kwantificeren laesies en zoek elektroden, maar deze methode is foutgevoelig, arbeidsintensief, en meestal vereist een schatting van de resultaten. Door de gehele hersenen voorbereiden micro-CT beeldvorming, de kans op beschadiging van de monsters is sterk verminderd, kenmerken van belang in de context van de gehele hersenen kunnen worden geanalyseerd en de methode leent zich voor parallelle verwerking van vele monsters, aanzienlijk het versnellen van de bereiding van de monsters.
De methode bestaat uit vier belangrijke stappen: (1) kleuring een perfused hersenen met osmium tetroxide, (2) het insluiten van de hersenen in hars (3) beeldvorming van de hersenen met een micro-CT-scanner en (4) het analyseren van de resulterende digitale volume (Figuur 1). In dit artikel, worden alleen 1 – 3 stappen beschreven, zoals stap 4 (de analyse) aanzienlijk afhankelijk van de specifieke behoeften van het project variëren zal.
Overwegende dat in de traditionele afdelen waarin een vectorafbeeldingsbestanden oriëntatie moet vooraf worden gekozen, de resulterende digitale volume van deze methode kan worden gemanipuleerd in drie dimensies en vrijwel in elke oriëntatie gesneden (Figuur 2a-2b). De gebruiker kan ook scannen een subsectie van het monster met een hogere resolutie, indien gewenst, zoals de bulbus olfactorius van de hersenen van een rat, waar zenuwvezels en individuele glomeruli zichtbaar (Figuur 2c zijn). De methode is ook breed toepasbare naar kleine dierlijke hersenen. Om dit te controleren, werd een Zebravink brein opgesteld op basis van hetzelfde protocol gebruikt voor de rat hersenen en resulteerde in een succesvolle digitale volume (Figuur 2e). Scanning elektronen microscopie (SEM) van een monster dat is bereid voor micro-CT bevestigd dat het weefsel niet beschadigd was tot een orde van grootte in resolutie dan de micro-CT's resolutie (Figuur 2d). Echter moet worden opgemerkt dat er aanzienlijke ultrastructurele schade was, waardoor deze techniek ongeschikt voor elektronenmicroscopie (EM).
De techniek kan worden gebruikt om te vinden van de oppervlakte laesies (Figuur 3) en letsels die diep binnen de hersenen (Figuur 4). De techniek maakt ook het lokaliseren van interne schutterijofficieren in situ, elektrolytische laesies, elektrode tracks van voldoende diameter, tetrode arrays in situ, en silicium sondes in situ (Figuur 5).
Mislukte preparaten zal bestaan uit onvolledige mineralisatie van het weefsel, die ook optreden kan als er onjuiste buffers worden gebruikt (Figuur 6). Echter, als alleen oppervlaktekenmerken nodig zijn, bijvoorbeeld, dan alleen-oppervlak kleuring van het monster kan volstaan voor de experimentator.
Figuur 1 : Methode overzicht. Overzicht van de stappen die nodig zijn voor te bereiden en analyseren een hele hersenen met behulp van micro-CT beeldvorming. Figuur gebruikt met toestemming van de auteurs13. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Mogelijkheden van laesie karakterisatie door middel van micro-CT beeldvorming. (een) Manipulatable 3D volume en (b) virtuele segmenten (13.9 µm voxels) op willekeurige oriëntaties van een micro-CT-scan van een lange-Evans rat. (c) bulbus olfactorius gescand met een hogere resolutie (4.9 µm voxels) onthullen glomeruli (witte pijlpunt) en individuele zenuwvezels (blauwe pijlpunt). (d) scannende elektronen microscoop (SEM) afbeelding (10 nm/pixel) van de visuele cortex van de hersenen van een rat voorbereid van micro-CT beeldvorming. (e) Zebravink (Taeniopygia guttata) hersenen voorbereid van micro-CT imaging; 2D en 3D-volume plakjes (5.6 µm voxels) in de coronale, horizontaal en sagittale vlakken. Figuur gebruikt met toestemming van de auteurs13. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Visuele cortex laesie karakterisering met behulp van micro-CT. (een) 3D visualisatie van een rat hersenen lesioned in de visuele cortex met quinolinic zuur. Het linkerdeel bevat laesie volume in het kader van de hersenen (hersenen iets transparant zodat visuele toegang krijgt tot de laesie gemaakt). Het rechterpaneel bevat geïsoleerde laesie volume. (b) 2D segmenten van de laesie in de coronale, horizontaal en sagittale vlakken (12,8 µm voxels). De top 3 panelen de niet-gesegmenteerde secties tonen, en de onderste 3 panelen secties met overlay laesie aantekening tonen. Deze laesie was handmatig geannoteerd in de richting van coronale elk 2 plakjes. Het volume werd vervolgens gemaakt door middel van interpolatie. Figuur gebruikt met toestemming van de auteurs13. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: vergelijking van dorso-laterale striatum laesie karakterisering met behulp van micro-CT en histologie. (een) sagittale, horizontale, en coronale uitzicht van de linker helft van "hersenen 1" verwerkt voor micro-CT beeldvorming (13,5 µm voxels). De top 3 panelen niet-gesegmenteerde secties tonen, en de onderste 3 panelen Toon de geannoteerde laesie op dezelfde baanvakken. De laesie was handmatig gesegmenteerd in het sagittale vlak elke 2 secties en vervolgens geïnterpoleerd. (b) naaste overeenkomende coronale deel van het recht dat de helft van de "hersenen 1" histologisch voor de lichte microscopie verwerkt. Panelen (c, d) zijn vergelijkbaar (a, b), maar komen overeen met "brein 2". De laesie van de hersenen 2 was handmatig gesegmenteerd in de coronale vlak elke 8 secties. (e) laesie karakterisering van histologie behandeld juiste helften van hersenen 1 (donker grijs) en 2 (lichtgrijs). De getallen in (b, d, e) onder de panelen komen overeen met de posities ten opzichte van bregma. (f) laesie karakterisering van de linker helft van de hersenen 1 voor micro-CT. verwerkt Het eerste paneel toont de geïsoleerde laesie. De tweede en derde panelen weergeven de laesie in de context van de hersenen vanuit twee gezichtspunten. (g) zelfde als (f) maar die overeenkomt met de hersenen 2. (h) een overlay van de laesies in (f, g) ter illustratie van de mogelijkheden voor een vergelijking van de karakterisering van de laesie digitale hersenen trainingsvolume. De laesie in (f) werd geregistreerd aan de laesie in (g), en beide worden weergegeven in het kader van de linkerhelft van de hersenen 2. Figuur gebruikt met toestemming van de auteurs13. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Elektrode lokalisatie via micro-CT beeldvorming. (een) Single tetrode links in situ (14.0 µm voxels). Bovenste linker paneel: max-intensiteit projectie van virtuele coronale gedeelten met de locatie van een Nichroom tetrode reizen door de visuele cortex in het corpus callosum van een rat; rechtsboven: close-up van een afbeelding die wordt weergegeven in het bovenste linker gedeelte van (een) (witte rechthoek). Linksonder: Sagittaal; rechtsonder: horizontale weergaven van de geïmplanteerde elektrode (witte pijl geeft de locatie van de tetrode). (b) elektrolytische laesie en elektrode bijhouden in de voorste regio van de hersenen van een rat (13.9 µm voxels). Linksboven: 3D weergave van een brein met de elektrolytische laesie gesegmenteerd uit (witte pijl die aangeeft paarse laesie); rechtsboven: coronale. Linksonder: Sagittaal; rechtsonder: horizontale secties die aangeeft elektrolytische laesie (witte pijlen) geproduceerd met een 75 µm diameter wolfraam elektrode. Bovendien, is sommige metaal gestort door de elektrode op retractie zichtbaar langs het spoor in de Sagittaal weergave (witte pijlpunten). (c) 16-tetrode implantaat verliet in situ in de voorste cortex van de hersenen van een rat. Linksboven: 3D weergave van een hele brein met een array van de 16-tetrode links geïmplanteerd; rechtsboven: coronale. Linksonder: Sagittaal; rechtsonder: horizontale secties die aangeeft van een 16-tetrode implantaat (8.9 µm voxels). (d) silicium sonde (10 mm schacht, 32 sites) liet in situ reizen door het posterieure cortex, hippocampus en subcorticale structuren (13.9 µm voxels). Linksboven: 3D weergave van een hele brein met een gesegmenteerde silicium-sonde (witte pijl die aangeeft groene sonde); rechtsboven: coronale. Linksonder: Sagittaal; rechtsonder: horizontale weergaven van een silicium sonde in de hersenen. Daarnaast is de referentie-site op de silicium-sonde zichtbaar in de secties coronale en Sagittaal (tip van witte pijlen). Figuur gebruikt met toestemming van de auteurs13. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6 : Effect van osmium tetroxide oplosmiddel op osmium penetratie. (een) linker paneel: rat hersenen geïncubeerd in osmium tetroxide in ddH2O voor 1 week. Rechter paneel: rat hersenen geïncubeerd in osmium tetroxide in ddH2O voor 2 weken. (b) twee rat hersenen geïncubeerd in osmium tetroxide in natrium cacodylate buffer voor 6 weken. Figuur gebruikt met toestemming van de auteurs13. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De volgende kritische stappen bij het protocol zijn: ten eerste, het gebruik van een combinatie van PFA en GA naar de perfuse van het dier en vervolgens na het monteren van de hersenen was primordiaal voor het bereiken van overeenstemming volledige osmium penetratie van het weefsel. Hoewel wij dit niet expliciet testen, is een plausibele verklaring dat PFA fixatie omkeerbare15, overwegende dat GA fixatie niet omkeerbaar16,17 is. Omdat een twee weken durende incubatie in osmium tetroxide vereist voor volledige infiltratie van het weefsel is, is het mogelijk dat de PFA in het interieur van de hersenen diffundeert uit en het weefsel tijdens de kleuring degradeert. De osmium kan niet dus de inwendige structuren behouden.
Het gebruik van waterige osmium, in tegenstelling tot osmium opgelost in een buffer (dat wil zeggen, natrium cacodylate), was absoluut noodzakelijk om te zorgen voor een volledige weefsel penetratie door de osmium. Zelfs na een incubatie van 6 weken, osmium opgelost in natrium cacodylate het weefsel niet volledig heeft infiltreren en bleek tegenkomen een diffusie-barrière (Figuur 6). Osmium is uiterst reactief aan lipiden en dacht te binden die in celmembranen18,19,20. Als het weefsel is niet voldoende permeabel, als misschien wel het geval is met een zachte buffer zoals natrium cacodylate, is het mogelijk dat de celmembranen kunnen met osmium verzadigen en sterically meer osmium verhinderen verspreiden in het weefsel. Wij veronderstellen, echter dat water als oplosmiddel voor de osmium fungeert als een licht sopje en permeabilizes van het weefsel voldoende zodat diepe diffusie in het weefsel.
Onderzoekers zijn het opstellen van een kleinere hersenen, zoals die van een muis, kan de incubatietijd in osmium waarschijnlijk worden verminderd. Evenzo moet de incubatietijd in grotere monsters worden verhoogd. Dit kan worden getest om te bepalen van de minimale tijd voor consistente kleuring in een brein dat is verschillend in grootte dan die van een rat. Als onderzoekers problemen met volledige osmium infiltratie ondervindt, de waarschijnlijk problemen niet gebruikt zowel PFA en GA tijdens perfusie en na fixatie, niet met behulp van water als het oplosmiddel voor osmium (zoals hierboven), en onvoldoende agitatie tijdens osmium incubatie. Vonden we, bijvoorbeeld, dat wanneer het broeden in 50 mL conische buisjes, tot vaststelling van de buizen aan hun kant (in tegenstelling tot verticaal aan een veehouder), vullen met een vlek, en plaatsen ze op een roteerschudapparaat 50 rpm voor de gehele incubatie periode gewaarborgd juiste infiltratie.
Deze methode is op verschillende manieren beperkt. Ten eerste, de voorbereiding niet behouden ultrastructuur heel goed, dus het moet niet worden gebruikt voor elektronenmicroscopie. Deze methode kan niet worden gecombineerd met eventuele verdere histologie of immunofluorescentie. De resolutie van de digitale volume wordt bepaald door de grootte van de steekproef (kleinere monsters kunnen worden gescand met hogere resoluties) en door de geometrie van de scanner, als zij beroept zich op de vergroting van het geometrische; echter is dat de subsecties van het monster kunnen worden gescand op hogere resoluties, indien gewenst.
Een nieuwe methode elektronenmicroscopie-stijl weefsel behandeling combineren met micro-CT beeldvorming voor quantifying laesies en lokaliseren van elektroden in kleine dierlijke hersenen heeft voorgelegd. Deze methode is misschien wel minder moeizaam, vereist minder expertise en gemakkelijker dan de huidige gouden standaard voor segmenteren en kleuring een brein kwantificeerbare resultaten oplevert. Eerder, hebben de wetenschappers een protocol voor zelfs osmium penetratie in de hersenen van de muis die is bedoeld voor het behoud van ultrastructuur voor elektronenmicroscopie21,22beschreven. Dit protocol is echter vrij complex. In deze studie, de auteurs gericht op het ontwikkelen van een veel eenvoudiger methode voor micro-CT beeldvorming in plaats van elektronenmicroscopie. Zijn er andere studies micro-CT op de beeldvorming van de hersenen voor diverse doeleinden toe te passen. Een vorig onderzoek bij konijnen en muizen gebruikt micro-CT tumoren en andere afwijkingen23te vinden. Dit onderzoek maakte gebruik van propriëtaire MRI-contrastmiddelen, maar de onderzoekers micro-CT's potentiële nut in de laesie studies voorspellen. Een andere studie bij muizen gericht op het vinden van de bruto morfologische verschillen voor een drug-scherm betrokken de kleuring van muis hersenen met jodium in de schedel, maar de auteurs geconfronteerd ongelijke weefsel krimp en koos voor het insluiten van het weefsel in een hydrogel24. Andere studies in muizen hebben gericht op het vinden van cerebrale cavernous misvormingen, een aandoening van de abnormaal grote en onregelmatige haarvaten, en heb gebruik van osmium tetroxide en waterige jodium als vlekken; echter, deze werden uitgevoerd in veel kleinere monsters (vrijstaand muis hindbrains) dan hier beschreven25,26,27. Alternatieve methoden voor het genereren van 3D hersenen volumes zijn µMRI28 en hoge resolutie episcopic microscopie31. De resolutie van µMRI is armer (~ 25 µm voxels voor soortgelijke monsters28), en de techniek is duurder23,30. High-Resolution episcopic microscopie gezichten ook uitdagingen: het is een destructieve techniek, waardoor een blok-gezicht apparaat waardoor geheel-hersenen afdelen zou moeten worden geproduceerd. Het gepresenteerde werk strekt zich ook uit eerdere pogingen te vinden van elektroden in de hersenen met x-stralen32,33,34 door het vastleggen van zowel de elektrode en het omliggende weefsel. Voorts staat de techniek voor het lokaliseren van interne elektroden, tetrode arrays, elektrolytische laesies, elektrode tracks en silicium sondes.
Een waardevolle toekomstige richting zou de oprichting van een "gemiddelde brein" atlas waarnaar laesie studies kunnen mede worden geregistreerd om te standaardiseren laesie locatie en grootte kwantificering. Deze methode kan ook worden uitgebreid tot andere model en niet-modelorganismen, zoals door de onmiddellijke toepassing ervan op de Zebravink hersenen (Figuur 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Greg Lin en Arthur McClelland voor hun expertise met de micro-CT machine, David Richmond Hunter Elliott ter naar de spiegelbeeld en Data analyse Core (IDAC) aan de Harvard Medical School voor hun advies voor beeldverwerking en William Liberti in Boston Universiteit genadig voorzien van een Zebravink hersenen. Dit werk werd uitgevoerd onder in het midden voor nanoschaal systemen (CNS), een lid van de nationale nanotechnologie gecoördineerde infrastructuur netwerk (NNCI), die wordt ondersteund door de National Science Foundation onder NSF award nr. 1541959. CNS is een onderdeel van de Harvard-universiteit. Dit werk werd gesteund door de Richard en Susan Smith Family Foundation en IARPA (contract #D16PC00002). S.B.E.W. werd gesteund door beurzen van het Human Frontier Science Program (HFSP; LT000514/2014) en de organisatie van de European Molecular Biology (EMBO; ALTF1561-2013). G.G. werd gesteund door de National Science Foundation (NSF) Graduate Research Fellowship Program (GRFP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | 2% (w/v/) in 1X PBS |
| Glutaraldehyde (GA) | EMS | 16220 | 2.5% (w/v) GA in 1x PBS |
| OsO4 | EMS | 19190 | Work in fume hood |
| Ethanol | Decon Labs | Koptec | 140, 190, 200 proof |
| Acetone | EMS | 10015 | Glass-distilled |
| Durcupan ACM resin | Sigma-Aldrich | 44610 | A, B, C and D components, resin for embedding |
| Disposable molds | Ted Pella | 27114 | Suggested |
| milliQ water (ultrapure water) | Millipore Sigma | QGARD00R1 (or related purifier) | Suggested |
| Parafilm (paraffin film) | Millipore Sigma | P7793 | Suggested paraffin film |
| Micro-CT scanner | Nikon Metrology Ltd., Tring, UK | X-Tek HMS ST 225 | Used by authors |
| Software for visualizing and analyzing micro-CT scans: | |||
| Volume Graphics | VG Studio Max | Used by authors | |
| FEI / Thermo Scientific | Avizo | Used by authors | |
| FEI / Thermo Scientific | Amira | Similar to Avizo | |
| Mark Sutton & Russell Garwood | Spiers | Free, http://spiers-software.org/ | |
| Pixmeo Sarl | Osirix Lite | Free, https://www.osirix-viewer.com/ | |
| Open Source | FIJI | Free, https://fiji.sc/ | |
| Adobe | Photoshop | Good for analyzing one slice at a time |
References
- Scoville, W., Milner, B. Loss of recent memory after bilateral hippocampal lesions. Journal of Neuropsychiatry and Clinical Neuroscience. 12, 103-113 (2000).
- Damasio, H., Grabowski, T., Frank, R., Galaburda, A. M., Damasio, A. R. The return of Phineas Gage: clues about the brain from the skull of a famous patient. Science. 264 (5162), 1102-1105 (1994).
- Kawai, R., et al. Motor cortex is required for learning but not for executing a motor skill. Neuron. 86, 800-812 (2015).
- Otchy, T., et al. Acute off-target effects of neural circuit manipulations. Nature. 528, 358-363 (2015).
- Wright, N., Vann, S., Aggleton, J., Nelson, A. A critical role for the anterior thalamus in directing attention to task-relevant stimuli. Journal of Neuroscience. 35, 5480-5488 (2015).
- Kapgal, V., Prem, N., Hegde, P., Laxmi, T., Kutty, B. Long term exposure to combination paradigm of environmental enrichment, physical exercise and diet reverses the spatial memory deficits and restores hippocampal neurogenesis in ventral subicular lesioned rats. Neurobiology of Learning and Memory. 130, 61-70 (2016).
- Hosseini, N., Alaei, H., Reisi, P., Radahmadi, M. The effects of NBM- lesion on synaptic plasticity in rats. Brain Research. 1655, 122-127 (2017).
- Palagina, G., Meyer, J., Smirnakis, S. Complex visual motion representation in mouse area V1. Journal of Neuroscience. 37, 164-183 (2017).
- Ranjbar, H., Radahmadi, M., Reisi, P., Alaei, H. Effects of electrical lesion of basolateral amygdala nucleus on rat anxiety-like behavior under acute, sub-chronic, and chronic stresses. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. , (2017).
- Wood, R., et al. The honeycomb maze provides a novel test to study hippocampal-dependent spatial navigation. Nature. , (2018).
- Vermaercke, B., et al. Functional specialization in rat occipital and temporal visual cortex. Journal of Neurophysiology. 112, 1963-1983 (2014).
- Jun, J. J., et al. Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity. Nature. 551, 232-236 (2017).
- Masís, J., et al. micro-CT-based method for quantitative brain lesion characterization and electrode localization. Scientific Reports. 8, 5184 (2018).
- Gage, G., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. 65, 3564 (2012).
- Helander, K. Kinetic studies of formaldehyde binding in tissue. Biotechnic & Histochemistry. , (1994).
- Paljärvi, L., Garcia, J., Kalimo, H. The efficiency of aldehyde fixation for electron microscopy: stabilization of rat brain tissue to withstand osmotic stress. Histochemical Journal. , (1979).
- Okuda, K., Urabe, I., Yamada, Y., Okada, H. Reaction of glutaraldehyde with amino and thiol compounds. Journal of Fermentation and Bioengineering. 71, (1991).
- Bahr, G. Osmium tetroxide and ruthenium tetroxide and their reactions with biologically important substances: electron stains III. Experimental Cell Research. , (1954).
- Khan, A. A., Riemersma, J. C., Booij, H. L. The reactions of osmium tetroxide with lipids and other compounds. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 9, 560-563 (1961).
- Riemersma, J. Osmium tetroxide fixation of lipids for electron microscopy a possible reaction mechanism. Biochimica et Biophysica Acta. 152, (1968).
- Mikula, S., Binding, J., Denk, W. Staining and embedding the whole mouse brain for electron microscopy. Nature Methods. 9, 1198-1201 (2012).
- Mikula, S., Denk, W. High-resolution whole-brain staining for electron microscopic circuit reconstruction. Nature Methods. 12, 541-546 (2015).
- Crespigny, A., et al. 3D micro-CT imaging of the postmortem brain. Journal of Neuroscience Methods. 171, 207-213 (2008).
- Anderson, R., Maga, A. A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with MicroCT using Iodine-Based contrast. PLoS One. 10, 0142974 (2015).
- Zhou, Z., et al. Cerebral cavernous malformations arise from endothelial gain of MEKK3-KLF2/4 signalling. Nature. 532, 122-126 (2016).
- Choi, J., et al. Micro-CT imaging reveals mekk3 heterozygosity prevents cerebral cavernous malformations in Ccm2-Deficient mice. PloS One. 11, 0160833 (2016).
- Choi, J., Yang, X., Foley, M., Wang, X., Zheng, X. Induction and Micro-CT imaging of cerebral cavernous malformations in mouse model. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Benveniste, H., Kim, K., Zhang, L., Johnson, G. Magnetic resonance microscopy of the C57BL mouse brain. Neuroimage. 11, 601-611 (2000).
- Weninger, W. J., et al. High-resolution episcopic microscopy: a rapid technique for high detailed 3D analysis of gene activity in the context of tissue architecture and morphology. Anat Embryol. 211, 213-221 (2006).
- Schneider, J. E., et al. high-throughput magnetic paragraph sign resonance imaging of mouse embryonic paragraph sign anatomy using a fast gradient-echo sequence. MAGMA. 16, 43-51 (2003).
- Sharpe, J.
- Cox, D. D., Papanastassiou, A., Oreper, D., Andken, B., James, D. High-Resolution Three-Dimensional microelectrode brain mapping using stereo microfocal x-ray imaging. Journal of Neurophysiology. 100, 2966-2976 (2008).
- Borg, J. S., et al. Localization of metal electrodes in the intact rat brain using registration of 3D microcomputed tomography images to a magnetic resonance histology atlas. eNeuro. 2, (2015).
- Fu, T. -M., et al. Stable long-term chronic brain mapping at the single-neuron level. Nature Methods. 13, 875-882 (2016).
