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Neuroscience

Une méthode à base de Micro-CT pour caractériser les lésions et la localisation des électrodes dans le cerveau Animal petit

Published: November 8, 2018 doi: 10.3791/58585
Automatic Translation
1,2, 2, 2,3, 1,2, 4, 1,2
1Department of Molecular and Cellular Biology, Harvard University, 2Center for Brain Science, Harvard University, 3Department of Organismic and Evolutionary Biology, Harvard University, 4Institute of Science and Technology Austria

Summary

Cet article décrit une méthode simple pour préparer des petits cerveaux animaux pour l’imagerie micro-CT, dont les lésions peuvent être quantifiées et électrodes situés avec une grande précision dans le cadre de tout le cerveau.

Abstract

Lésion et électrode de vérification d’emplacement sont traditionnellement fait par l’examen histologique des tranches de cerveau tachées, une procédure longue nécessitant manuelle estimation. Nous décrivons ici une méthode simple et directe pour quantifier les lésions et la localisation des électrodes dans le cerveau qui est moins laborieux et donne des résultats plus détaillés. Cerveau entier est colorées au tétroxyde d’osmium, incorporé en résine et photographié avec un micro-tomodensitomètre. Les scans entraînent des volumes 3D numériques des cerveaux avec des résolutions et des épaisseurs de section virtuel dépendantes de la taille de l’échantillon (12 – 15 et 5 – 6 µm par voxel pour rat et zebra finch brains, respectivement). Les lésions superficielles et profondes peuvent être caractérisées et seul tétrodes, baies de tétrode, lésions électrolytiques, et silicium sondes peuvent également être localisées. Logiciels libres et propriétaires permet aux expérimentateurs d’examiner le volume de l’échantillon de n’importe quel avion et segment le volume manuellement ou automatiquement. Parce que cette méthode génère le volume du cerveau, des lésions et des électrodes peuvent être quantifiées à une beaucoup plus grande que les méthodes actuelles, qui aidera à normaliser les comparaisons au sein et entre les études.

Introduction

Les neuroscientifiques ont compté sur les lésions pendant une longue période afin de comprendre la relation entre la fonction et l’emplacement dans le cerveau. Par exemple, notre compréhension de l’hippocampe comme étant indispensable pour l’apprentissage et la mémoire et du cortex préfrontal comme étant la clé pour le contrôle des impulsions était les deux produits de lésions fortuites dans les humains1,2. L’utilisation de modèles animaux, cependant, a permis des neuroscientifiques d’exploiter la puissance des lésions en allant au-delà des serendipity, et la fonction de nombreuses zones du cerveau a été élucidée par le biais des études systématiques des relations structure-fonction à travers lésions3,4.

Pour affecter correctement fonction vers une structure, cependant, les études de lésion exigent des procédures de quantification précise, qui est une région qui a fait défaut. L’étalon-or pour quantifier les lésions actuel est de section, Mont et cerveaux d’image avec un microscope optique. Les tranches imagés sont ensuite mis en correspondance avec les sections plus proche de vous sur un atlas, et les coordonnées approximatives des lésions dans l’ensemble des sujets sont rapportées indirectement, souvent grâce à l’utilisation des images de caméra lucida ou exemple histologique tranches3,4 ,5,6,7,8,9,10.

Au-delà de l’imprécision des procédures de quantification des lésions actuelles, ces techniques sont fastidieuses et sujettes à l’échec. Petits changements dans la rigidité du cerveau, netteté de la lame et la température peut conduire aux sections bâclées, déformées ou déchirées. Les sections peuvent tacher aussi inégalement et être mal photographiées à cause des bulles d’air dans le milieu de montage. Ce qui est important, à la découpe, le contexte en trois dimensions de l’emplacement de la lésion dans le cerveau est perdu, faire une reconstruction 3D précise de la lésion dans le cerveau des difficiles.

Une autre application courante pour des lésions a été de déterminer l’emplacement des simples et multiples enregistrements d’électrodes dans le cerveau. À la fin de la séance d’enregistrement final, chercheurs provoquent des petites lésions électrolytiques à l’extrémité de l’électrode et processus du cerveau histologiquement comme fait dans une expérience de lésion classique11. Cette technique souffre les mêmes inconvénients décrits ci-dessus, avec des problèmes supplémentaires étant que les lésions électrolytiques sont généralement plus grandes que les électrodes utilisées pour les rendre, mais sont généralement assez petites qu’ils sont difficiles à trouver sur le plan histologique. Lorsque plusieurs électrodes sont insérés, comme dans le cas d’un tableau de la tétrode, vérification par le biais de lésions électrolytiques est encore plus difficile. Une alternative aux lésions électrolytiques est l’utilisation d’un colorant sur l’électrode pour plus tard vérifier histologiquement12, mais cette technique souffre des mêmes inconvénients qui viennent avec l’histologie conventionnelle.

Nous décrivons ici approfondie une méthode décrite récemment13 basé sur la coloration des techniques de microscopie électronique (me) et la radiographie tomodensitométrie (micro-CT) qui quantifie les lésions et localise les électrodes dans le cerveau animal petit mieux que courant Méthodes. Micro-CT est une technique d’imagerie dans lequel les rayons x est tournés en un échantillon qui est orientable à 360° pendant qu’un scintillateur recueille les rayons x n’a ne pas déviés de l’échantillon. Il en résulte une reconstruction 3D numérique à haute résolution de l’échantillon qui peut être visualisée dans n’importe quelle orientation et quantifié précisément. De nombreux établissements universitaires ont micro-tomodensitomètres, qui sont également disponibles dans le commerce.

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Protocol

Tous les soins et la manipulation expérimentale d’animaux ont été examinées et approuvées par la Harvard Institutional Animal Care et utilisation. La perfusion décrite ici est spécifique pour les rats, mais la procédure est applicable à tous les animaux avec des cerveaux plus petits ou de taille similaire.

1. la perfusion

  1. Préparer 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Pour un rat (âge : 0,5 – 1,5 ans, poids : 250 à 600 g), 800 – 1000 mL devrait suffire. 400 mL permet de perfuse l’animal et une autre 400 mL à diluer le fixateur.
  2. Préparer le fixateur consistant de paraformaldéhyde à 2 % (p/v) (PFA) et de 2,5 % (p/v) de glutaraldéhyde (GA) dans du PBS 1 x. Pour un rat, 400 mL est suffisante. Économisez 50 mL dans un tube conique de 50 mL pour après fixation du cerveau après la perfusion.
  3. Anesthésier le rat avec 4 à 5 % isoflurane gaz (à 0,8 L/min O2 à 1,0 bar à 21 ° C) pendant 15 min.
  4. Injecter une dose létale de pentobarbital de sodium par voie intrapéritonéale (180 mg/kg).
  5. Test pour la perte de réflexe chez l’animal en procédant à un examen de réflexe orteil-pincée. Attendre pour commencer la perfusion jusqu'à ce que l’animal a perdu sa réponse réflexe.
  6. Suivez l’intracardial décrite précédemment la perfusion et le cerveau extraction protocole14 avec les solutions suivantes : perfuse l’animal avec 400 mL de PBS 1 x 125 mm Hg pour enlever le sang. Une fois que tout le sang a été supprimé et remplacé par 1 x PBS, commencer perfusant avec 400 mL d’une solution de 2 %, PFA et 2,5 % GA dissous dans la solution de 1 PBS x 125 mm Hg.
    Remarque : Si la procédure est menée à un animal qui n’est pas un rat, les composants seulement importants de la procédure de perfusion sont l’utilisation de 1 x PBS et 2 % PFA, GA de 2,5 % dans du PBS 1 x. Les volumes de la solution et la pression de perfusion peuvent être réglés selon les espèces.

2. après fixation

  1. Placer le cerveau extrait chez 2 % PFA, 2,5 % GA dans 1 x solution de PBS (même solution utilisée pour perfuse l’animal précédemment). Assurez-vous que le volume de la solution est au moins 10 x le volume du cerveau. Pour les rats, placer le cerveau dans un tube conique de 50 mL avec 50 mL de solution. Conserver l’échantillon dans après fixation pendant 2 – 3 jours, en secouant légèrement à 4 ° C.
    Remarque : Si l’échantillon est dans un tube conique de 50 mL, le placer horizontalement dans un agitateur orbital assurera les meilleurs résultats.
  2. Après que l’échantillon a été post fixé pour longtemps assez, laver l’échantillon dans l’eau bidistillée (ddH2O), de l’eau désionisée (diH2O) ou l’eau ultrapure (voir Table des matières) de quatre fois les durées suivantes : 1, 1, 1 et 15 min.
    Remarque : Pour ce protocole, ddH2O, diH2O ou eau ultrapure devrait être interchangeable. Pour plus de simplicité, ddH2O servira pour désigner désormais l’eau purifiée.

3. coloration

ATTENTION : Pour cette étape, procéder à toutes les préparations de solution sous un capot tout en utilisant des gants.

  1. Préparer au moins 10 x le volume du cerveau de la solution de coloration. Cerveau de rat, préparer 50 mL de 2 % (p/v) le tétroxyde d’osmium (OsO4) FD2O en combinant 25 mL de solution mère de4 OsO de 4 % et de 25 mL de ddH2O.
    ATTENTION : tétroxyde d’Osmium est volatile et peut provoquer une cécité temporaire et des problèmes respiratoires si n’est pas manipulé convenablement. Jeter tous les matériaux qui en contact avec le tétroxyde d’osmium dans un récipient approprié risque chimique dans un conteneur secondaire.
  2. Placer le cerveau dans un nouveau tube conique de 50 mL et ajouter la solution de4 OsO. Le cerveau devrait commencer à virer au brun comme OsO4 réagit avec des lipides dans les tissus.
  3. Fermer le tube et sceller soigneusement avec paraffine film (voir Table des matières) pour s’assurer qu’il ne fuit pas durant l’incubation.
    Remarque : L’osmium est volatile et réagira légèrement avec le plastique du tube, le tube d’étanchéité correctement est donc très important. Les tubes peuvent être enroulées avec du papier d’aluminium pour une protection supplémentaire.
  4. Rangez le tuyau fermé à 4 ° C, secouant légèrement dans un agitateur orbital à 50 tr/min pendant 2 semaines. Placer le tube horizontalement pour assurer le meilleur mélange. S’assurer que l’échantillon est entièrement immergée dans la solution et en agitant.
    Remarque : Si l’osmium n’est pas autorisé à circuler en permanence, il ne peut pas pleinement pénétrer l’échantillon, positionnement horizontal sur le shaker est donc très important.

4. incorporation

  1. Après que l’échantillon a été incubé à l’OsO4 pendant 2 semaines, lavez-le avec FD2O 5 fois à température ambiante (RT) pour les durées suivantes : 1, 1, 1, 15 et 60 min pour enlever tous les indépendant OsO4 dans l’échantillon.
    Remarque : Les échanges multiples, y compris le dernier échange de 60 min, sont nécessaires pour permettre à tous de l’osmium dans le système circulatoire à diffuser sur.
  2. Laver l’échantillon avec les ddH2O pendant 30 min à 4 ° C.
    NOTE : Osmium peut continuer à diffuser de l’échantillon, mais sa quantité devrait être considérablement réduite à l’étape précédente.
  3. Déshydrater l’échantillon avec de l’éthanol pour finalement il infiltrer avec de la résine. Pour déshydrater, remplacer la ddH2O avec 10 à 20 mL de dilutions suivantes d’éthanol (de 30 min chacun à 4 ° C) : 20 % (v/v) d’éthanol et de 80 % (v/v) FD2O ; éthanol à 50 % (v/v) et 50 % (v/v) FD2O ; l’éthanol à 70 % (v/v) et 30 % (v/v) FD2O ; éthanol à 90 % (v/v) et 10 % (v/v) FD2O ; 100 % d’éthanol.
  4. Préparer des dilutions de l’acétone/résine comme suit.
    1. Préparer 100 mL de la résine pour l’enrobage (voir Table des matières) selon les instructions du fabricant.
    2. Pour rendre la résine 33 % (v/v) - 67 % solution d’acétone, versez 15 mL de résine dans un tube conique de 50 mL et ajouter 30 mL d’acétone distillée à verre de 100 %.
    3. Pour rendre l’acétone de résine - 50 % 50 % (v/v), verser 22,5 mL de résine dans un tube conique de 50 mL et ajouter 22,5 mL d’acétone distillée à verre de 100 %.
    4. Pour rendre la résine 67 % (v/v) - 33 % solution d’acétone, verser 30 mL de résine dans un tube conique de 50 mL et ajouter 15 mL d’acétone distillée à verre de 100 %.
    5. Utiliser le mL 32,5 restant de résine pour la première solution de résine 100 % ci-dessous.
  5. Commencer le processus d’infiltration de résine en déplaçant l’échantillon dans 10-20 mL d’acétone et l’acétone/résine dilutions suivantes : acétone 100 % pendant 30 min à 4 ° C ; acétone à 100 % pendant 30 min à 4 ° C ; et l’acétone à 100 % pendant 30 min à température ambiante (RT).
    NOTE : Le reste du processus d’infiltration aura lieu à température ambiante.
  6. Immergez l’échantillon à 33 % (v/v) 67 % de résine acétone pendant 3 h à RT, puis acétone résine - 50 % 50 % (v/v) pendant 3 h à RT, acétone 33 % 67 % (v/v) de résine pendant 3 h à RT et 100 % de résine pendant 12 h à température ambiante.
  7. Faire un lot de frais 50 mL de résine en suivant les instructions sur la bouteille. Transférer l’échantillon dans le récipient dans lequel il sera guéri (e.g., les moules jetables décrits dans la Table des matières). Faire infuser l’échantillon avec une résine 100 % frais pendant 4 heures à température ambiante.
    Remarque : Si la résine fraîche n’est pas utilisée, la résine faite le jour précédent commencera à durcir prématurément, et l’échantillon sera difficile à manipuler.
  8. Une solution contenant l’échantillon dans une étuve à vide pendant 15 min à 45 ° C.
    Remarque : Cette étape permettra d’éliminer les bulles d’air piégées dans l’échantillon, mais il n’est pas essentiel et n’affectera pas la qualité des données.
  9. Enfin, guérir l’échantillon dans un four pendant 48 h à 60 ° C.

5. micro-CT

  1. Une fois que l’échantillon a été guérie, décoller le moule jetable et Scannez-le avec la machine de micro-CT.
    Remarque : Selon l’appareil utilisé, les réglages seront différents. Pour le scanner utilisé par les auteurs énumérés dans la Table des matières, les paramètres recommandés sont 130 kV, µA 135 avec un filtre de 0,1 mm en cuivre et une source de molybdène, une exposition de 1 seconde et une moyenne de 4 images par projection. Cependant, expérimentateurs doivent étalonner le scanner individuellement, car de nombreux facteurs affectera les réglages optimaux au cours d’une session particulière.
  2. Une fois le scan terminé, reconstruire l’échantillon avec les paramètres recommandés pour combinaison scanner/logiciels de l’expérimentateur sur un ordinateur avec le logiciel du scanner.
  3. Enfin, visualiser et analyser le volume numérique reconstitué à l’aide du logiciel de l’expérimentateur de choix (voir Table des matières par exemple).

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Representative Results

Traditionnellement, les cerveaux est sectionnés et colorés pour quantifier les lésions et de localiser les électrodes, mais cette méthode est sujette aux erreurs, il y a beaucoup de travail et nécessite généralement l’estimation des résultats. En préparant toute cervelle d’imagerie micro-CT, la probabilité d’endommager les échantillons est considérablement réduite, caractéristiques d’intérêt peuvent être analysées dans le contexte de l’ensemble du cerveau, et la méthode se prête au traitement en parallèle de plusieurs échantillons, considérablement accélérer la préparation des échantillons.

La méthode comprend quatre étapes principales : (1) coloration d’un cerveau perfusé avec le tétroxyde d’osmium, (2) incorporation du cerveau en résine, (3) d’imagerie du cerveau avec un micro-CT scanner et (4) analyse le volume numérique qui en résulte (Figure 1). Dans cet article, seulement les étapes 1 à 3 sont décrits, comme étape 4 (analyse) variera considérablement selon les besoins spécifiques du projet.

Considérant que dans les traditionnelles coupes dans lesquelles une orientation de sectionnement doit être choisie au préalable, le volume numérique résultant de cette méthode peut être manipulé en trois dimensions et tranché pratiquement dans n’importe quelle orientation (Figure 2 a-2 b). L’utilisateur peut également rechercher un paragraphe de l’échantillon à une résolution plus élevée si vous le souhaitez, tels que le bulbe olfactif d’un cerveau de rat, où les fibres nerveuses et les glomérules sont visibles (Figure 2c). La méthode est également applicable à petits cerveaux animaux. Pour ce faire, un cerveau de zebra finch a été préparé en utilisant le même protocole utilisé pour le cerveau de rat et a donné lieu à un volume numérique réussi (Figure 2e). Microscopie électronique (MEB) d’un échantillon préparé pour micro-CT a confirmé que le tissu n’était pas endommagé jusqu'à un ordre de grandeur dans la résolution au-delà de la résolution (Figure 2d) de la micro-CT. Toutefois, il est à noter qu’il y avait des dégâts considérables et ultrastructurales, ce qui rend cette technique impropres à la microscopie électronique (me).

La technique peut être utilisée pour rechercher des lésions de surface (Figure 3) et des lésions profondes dans le cerveau (Figure 4). La technique permet également la localisation des tétrodes unique in situ, lésions électrolytiques, des pistes d’électrode de diamètre suffisant, tétrode tableaux in situ et silicium sondes in situ (Figure 5).

Préparations infructueuses comprendra la minéralisation incomplète du tissu, qui peut également se produire si on utilise des tampons incorrectes (Figure 6). Toutefois, si seulement les caractéristiques de surface sont nécessaires, par exemple, puis seule surface de coloration de l’échantillon peut suffire pour l’expérimentateur.

Figure 1
Figure 1 : Vue d’ensemble de la méthode. Vue d’ensemble des étapes requises pour préparer et analyser un cerveau entier à l’aide de l’imagerie micro-CT. Figure utilisée avec la permission des auteurs13. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Fonctionnalités de caractérisation de la lésion par le biais de l’imagerie micro-CT. (un) Manipulatable 3D volume et (b) virtuels tranches (13,9 µm voxels) à orientation arbitraire d’un micro-CT scan d’un rat Long-Evans. (c) bulbe olfactif numérisées à une résolution plus élevée (4,9 µm voxels) révélant des glomérules (flèche blanche) et des fibres nerveuses individuelles (flèche bleue). (d), microscope électronique à balayage (SEM) image (10 nm/pixel) du cortex visuel d’un cerveau de rat préparé pour l’imagerie micro-CT. cerveau (e), Zebra finch (Taeniopygia guttata) préparé pour micro-CT d’imagerie ; Volume 3D et 2D tranches (5,6 µm voxels) dans le coronal, horizontal et les plans sagittal. Figure utilisée avec la permission des auteurs13. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Caractérisation de lésion de cortex visuel à l’aide de micro-CT. (un) visualisation 3D d’un cerveau de rat lésé dans le cortex visuel avec l’acide quinolinique. Le panneau de gauche montre le volume de la lésion dans le contexte du cerveau (le cerveau fait légèrement transparent pour permettre un accès visuel à la lésion). Le panneau de droite montre une lésion isolée volume. (b) les tranches 2D de lésion dans le coronal, horizontal et sagittal avions (12,8 µm voxels). Les 3 panneaux albums montrent les sections non segmentées, et les panneaux de fond 3 montrent sections avec annotation de lésion superposées. Cette lésion a été manuellement annoté dans l’orientation coronaire chaque 2 tranches. Le volume a ensuite été créé par interpolation. Figure utilisée avec la permission des auteurs13. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Comparaison de caractérisation de lésion striatum dorso-latérale à l’aide de micro-CT et histologie. (un) Sagittal, horizontale et coronale une vue sur la gauche la moitié du « cerveau 1 » transformée pour micro-CT d’imagerie (13,5 µm voxels). Les top 3 panneaux montrent des sections non segmentées, et les panneaux de fond 3 montrent la lésion annotée sur les mêmes sections. La lésion a été manuellement segmenté dans le plan sagittal chaque 2 sections et par la suite interpolés. (b) le plus proche correspondante section coronale du droit la moitié du « cerveau 1 » traitée sur le plan histologique pour la microscopie. Panneaux (c, d) est similaires à (a, b), mais correspond à « cerveau 2 ». La lésion du cerveau 2 a été segmentée manuellement dans le plan coronal de chaque 8 sections. (e) caractérisation de la lésion des moitiés droite imprégnées d’histologie des cerveaux 1 (gris foncé) et 2 (gris clair). Les numéros sous les panneaux (b, d, e) correspondent aux positions par rapport au bregma. (f), à la caractérisation de la lésion de la gauche la moitié du cerveau 1 traitée pour micro-CT. Le premier panneau montre la lésion isolée. Les panneaux de deuxième et troisième montrent la lésion dans le contexte du cerveau sous deux aspects. (g) identique à (f) mais correspondant au cerveau 2. (h), une superposition des lésions en (f, g) illustrant la capacité pour la comparaison de caractérisation de la lésion avec volumes numériques de cerveau. La lésion en (f) a été enregistrée à la lésion (g), et les deux sont indiqués dans le contexte de la moitié gauche du cerveau 2. Figure utilisée avec la permission des auteurs13. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Localisation d’électrode par imagerie micro-CT. (un) seul tétrode gauche in situ (14,0 µm voxels). Plateau supérieur gauche : max-intensité projection virtuelle sections coronale montrant l’emplacement d’une tétrode de nichrome voyageant à travers le cortex visuel dans le corps calleux d’un rat ; en haut à droite : gros plan d’une image affichée dans le volet supérieur gauche (a) (rectangle blanc). Bas à gauche : sagittal ; en bas à droite : vue horizontale de l’électrode implantée (flèche blanche indique la localisation de la tétrode). électrode et (b) électrolytique lésion la voie ferrée dans la région antérieure d’un cerveau de rat (13,9 µm voxels). En haut à gauche : rendu 3D de l’encéphale avec la lésion électrolytique segmentés sur (flèche blanche indiquant une lésion violette) ; en haut à droite : coronal. Bas à gauche : sagittal ; en bas à droite : les sections horizontales indiquant la lésion électrolytique (flèches blanches) produit avec une électrode de tungstène de 75 µm de diamètre. En outre, certains métaux déposé par l’électrode à la rétraction est visible le long de la piste dans la vue sagittale (flèches blanches). (c) implant de 16-tétrode laissé in situ dans le cortex antérieur d’un cerveau de rat. En haut à gauche : rendu 3D d’un cerveau entier avec un tableau de 16-tétrode implanté à gauche ; en haut à droite : coronal. Bas à gauche : sagittal ; en bas à droite : les sections horizontales indiquant un implant 16-tétrode (8,9 µm voxels). sonde (d), silicium (tige de 10 mm, 32 sites) laissé in situ voyageant à travers le cortex postérieur, hippocampe et structures sous-corticales (voxels 13,9 µm). En haut à gauche : rendu 3D d’un cerveau entier avec une sonde de silicium segmenté (sonde verte indiquant de flèche blanche) ; en haut à droite : coronal. Bas à gauche : sagittal ; en bas à droite : une vue horizontale un silicium sonde dans le cerveau. En outre, le site de référence sur la sonde de silicium est visible dans les sections coronales et sagittales (pointe de flèches blanches). Figure utilisée avec la permission des auteurs13. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Effet du tétroxyde d’osmium solvant sur la pénétration de l’osmium. (un) panneau de gauche : le cerveau de rat incubés dans le tétroxyde d’osmium dans ddH2O pendant 1 semaine. Panneau de droite : le cerveau de rat incubés dans le tétroxyde d’osmium ddH2O pendant 2 semaines. cerveau de rat deux (b) incubés dans le tétroxyde d’osmium dans le tampon de cacodylate de sodium pendant 6 semaines. Figure utilisée avec la permission des auteurs13. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Voici les étapes critiques du protocole : tout d’abord, l’utilisation d’une combinaison de PFA et GA perfuse l’animal et ensuite fixer le cerveau a été primordiale à la réalisation de pénétration d’osmium pleinement cohérente du tissu. Bien que nous n’ai pas tester cela explicitement, une explication plausible est que la fixation de la PFA est réversible15, alors que la fixation GA n’est pas réversible16,17. Parce qu’une période d’incubation de deux semaines dans le tétroxyde d’osmium est requis pour toute infiltration des tissus, il est possible que la PFA à l’intérieur du cerveau diffuse sur et le tissu se dégrade pendant la coloration. L’osmium donc ne peut pas préserver les structures intérieures.

L’utilisation de l’osmium aqueuse, par opposition à l’osmium dissoute dans un tampon (c.-à-d., cacodylate de sodium), était absolument nécessaire pour assurer une pénétration tissulaire complète par l’osmium. Même après une incubation de 6 semaines, osmium dissous dans cacodylate de sodium ne pas s’infiltrer dans le tissu complètement et semblait rencontrer une barrière de diffusion (Figure 6). L’osmium est extrêmement réactive aux lipides et pensé pour lier les membranes cellulaires18,19,20. Si le tissu n’est pas suffisamment perméabilisé, comme peut être le cas avec un tampon doux comme cacodylate de sodium, il est possible que les membranes cellulaires peuvent saturer avec l’osmium et stériquement empêcher l’osmium plus diffuser dans les tissus. Nous émettons l’hypothèse, toutefois, que l’eau comme solvant pour l’osmium agit comme un détergent léger et permeabilizes le tissu suffisamment pour permettre la diffusion profondément dans le tissu.

Si les expérimentateurs sont préparent à un cerveau plus petit, comme celle d’une souris, le temps d’incubation en osmium peut probablement être réduit. De même, le temps d’incubation doit être augmentée dans les plus grands échantillons. Cela peut être testé pour déterminer la durée minimale pour une coloration uniforme dans un cerveau qui est différent en taille que celle d’un rat. Si expérimentateurs rencontrent des problèmes avec une infiltration osmium complet, les problèmes susceptibles de n’utilisent pas les PFA et GA au cours de la perfusion et après fixation, ne pas utiliser l’eau comme solvant pour l’osmium (tel que discuté ci-dessus) et une agitation insuffisante durant l’osmium incubation. Nous avons constaté, par exemple, que lors de l’incubation en tubes de 50 mL conique, portant les tubes de leur côté (par opposition à verticalement sur un support), les remplir avec la tache et en les plaçant dans un agitateur orbital à 50 tr/min pour l’incubation toute période assurée propre infiltration.

Cette méthode est limitée de plusieurs manières. Tout d’abord, la préparation ne conserve pas l’ultrastructure très bien, donc il ne devrait pas être utilisé pour la microscopie électronique. Cette méthode ne peut être combinée avec d’autres histologie ou immunofluorescence. La résolution du volume numérique est déterminée par la taille de l’échantillon (les plus petits échantillons peuvent être analysés à des résolutions plus élevées) et par la géométrie du scanner, si elle s’appuie sur le rapport optique géométrique ; Toutefois, les paragraphes de l’échantillon peuvent être numérisés à des résolutions plus élevées, si vous le souhaitez.

Une nouvelle méthode combinant traitement tissulaire de microscopie électronique-style avec imagerie micro-CT pour quantifier les lésions et la localisation des électrodes dans le cerveau animal petit a été présentée. Cette méthode est sans doute moins laborieuse et nécessite moins d’expertise donne des résultats quantifiables plus facilement que l’étalon-or actuel pour coupes et coloration d’un cerveau. Auparavant, les scientifiques ont décrit un protocole pour la pénétration même l’osmium dans les cerveaux de souris qui vise à préserver l’ultrastructure de la microscopie électronique21,22. Ce protocole, cependant, est assez complex. Dans cette étude, les auteurs visant à élaborer une méthode beaucoup plus simple pour l’imagerie micro-CT plutôt qu’au microscope électronique. Il y a eu d’autres études application micro-CT aux cerveaux d’imagerie à des fins diverses. Une enquête précédente chez les lapins et les souris permettant de trouver des tumeurs et autres anomalies23micro-CT. Cette enquête faite utilisation d’agents de contraste MRI propriétaires, mais les chercheurs n’ont prédit l’utilité potentielle de micro-CT dans les études de la lésion. Une autre étude chez la souris visant à trouver des différences morphologiques bruts pour un dépistage de drogues en cause la coloration des cerveaux de souris avec de l’iode dans le crâne, mais les auteurs face à rétraction tissulaire inégale et opté pour incorporer le tissu dans un hydrogel24. Autres études sur les souris ont visant à trouver des malformations caverneuses cérébrales, un trouble des capillaires anormalement large et irréguliers et ont fait usage du tétroxyde d’osmium et iode aqueux comme taches ; Toutefois, ceux-ci ont été réalisés dans des échantillons beaucoup plus petits (hindbrains souris détaché) que celle décrite ici25,26,27. Méthodes alternatives pour générer des volumes 3D de cerveau sont µMRI28 et de la microscopie à haute résolution diascopique31. La résolution de µMRI est plus faible (~ 25 µm voxels pour semblable échantillons28), et la technique est plus cher23,30. Microscopie à haute résolution diascopique également des défis : que c’est une technique destructrice, et un appareil d’îlot permettant ensemble-cerveau sectionnement devra être produit. Le travail présenté ici s’étend également à des efforts antérieurs pour localiser des électrodes dans le cerveau avec des rayons x32,33,34 en capturant les deux l’électrode et les tissus environnants. En outre, la technique permet pour localiser les électrodes unique, tableaux tétrode, lésions électrolytiques, électrode pistes et sondes de silicium.

Une précieuse orientation future serait la création d’un atlas de « cerveau moyen » auquel des études de lésion pouvaient être enregistrées conjointement afin de normaliser la localisation de la lésion et de la quantification de la taille. Cette méthode peut également être étendue à d’autres modèle et organismes non-modèles, comme en témoigne son application immédiate au cerveau zebra finch (Figure 2).

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs remercient Greg Lin et Arthur McClelland pour leur expertise avec la machine micro-CT, David Richmond et Hunter Elliott à l’Image et analyse de données Core (IDAC) à la Harvard Medical School pour leur conseils de traitement d’image et William Liberti à Boston Université de fournir gracieusement un cerveau zebra finch. Ce travail a été réalisé en partie au Centre pour le systèmes nanométriques (CNS), un membre de la National Nanotechnology coordonnée Infrastructure réseau (NNCI), qui est soutenu par la National Science Foundation sous award NSF n ° 1541959. CNS est une partie de l’Université Harvard. Ce travail a été soutenu par Richard et Susan Smith Family Foundation et IARPA (contrat #D16PC00002). S.B.E.W. a été soutenu par les bourses de l’Human Frontier Science Program (HFSP ; LT000514/2014) et l’European Molecular Biology Organization (EMBO ; ALTF1561-2013). G.G. a été soutenue par la National Science Foundation (NSF) Graduate Research Fellowship programme (GRFP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Sciences (EMS) 15710 2% (w/v/) in 1X PBS
Glutaraldehyde (GA) EMS 16220 2.5% (w/v) GA in 1x PBS
OsO4 EMS 19190 Work in fume hood
Ethanol Decon Labs Koptec 140, 190, 200 proof
Acetone EMS 10015 Glass-distilled
Durcupan ACM resin Sigma-Aldrich 44610 A, B, C and D components, resin for embedding
Disposable molds Ted Pella 27114 Suggested
milliQ water (ultrapure water) Millipore Sigma QGARD00R1 (or related purifier) Suggested
Parafilm (paraffin film) Millipore Sigma P7793 Suggested paraffin film
Micro-CT scanner Nikon Metrology Ltd., Tring, UK X-Tek HMS ST 225 Used by authors
Software for visualizing and analyzing micro-CT scans:
Volume Graphics VG Studio Max Used by authors
FEI / Thermo Scientific Avizo Used by authors
FEI / Thermo Scientific Amira Similar to Avizo
Mark Sutton & Russell Garwood Spiers Free, http://spiers-software.org/
Pixmeo Sarl Osirix Lite Free, https://www.osirix-viewer.com/
Open Source FIJI Free, https://fiji.sc/
Adobe Photoshop Good for analyzing one slice at a time

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References

  1. Scoville, W., Milner, B. Loss of recent memory after bilateral hippocampal lesions. Journal of Neuropsychiatry and Clinical Neuroscience. 12, 103-113 (2000).
  2. Damasio, H., Grabowski, T., Frank, R., Galaburda, A. M., Damasio, A. R. The return of Phineas Gage: clues about the brain from the skull of a famous patient. Science. 264 (5162), 1102-1105 (1994).
  3. Kawai, R., et al. Motor cortex is required for learning but not for executing a motor skill. Neuron. 86, 800-812 (2015).
  4. Otchy, T., et al. Acute off-target effects of neural circuit manipulations. Nature. 528, 358-363 (2015).
  5. Wright, N., Vann, S., Aggleton, J., Nelson, A. A critical role for the anterior thalamus in directing attention to task-relevant stimuli. Journal of Neuroscience. 35, 5480-5488 (2015).
  6. Kapgal, V., Prem, N., Hegde, P., Laxmi, T., Kutty, B. Long term exposure to combination paradigm of environmental enrichment, physical exercise and diet reverses the spatial memory deficits and restores hippocampal neurogenesis in ventral subicular lesioned rats. Neurobiology of Learning and Memory. 130, 61-70 (2016).
  7. Hosseini, N., Alaei, H., Reisi, P., Radahmadi, M. The effects of NBM- lesion on synaptic plasticity in rats. Brain Research. 1655, 122-127 (2017).
  8. Palagina, G., Meyer, J., Smirnakis, S. Complex visual motion representation in mouse area V1. Journal of Neuroscience. 37, 164-183 (2017).
  9. Ranjbar, H., Radahmadi, M., Reisi, P., Alaei, H. Effects of electrical lesion of basolateral amygdala nucleus on rat anxiety-like behavior under acute, sub-chronic, and chronic stresses. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. , (2017).
  10. Wood, R., et al. The honeycomb maze provides a novel test to study hippocampal-dependent spatial navigation. Nature. , (2018).
  11. Vermaercke, B., et al. Functional specialization in rat occipital and temporal visual cortex. Journal of Neurophysiology. 112, 1963-1983 (2014).
  12. Jun, J. J., et al. Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity. Nature. 551, 232-236 (2017).
  13. Masís, J., et al. micro-CT-based method for quantitative brain lesion characterization and electrode localization. Scientific Reports. 8, 5184 (2018).
  14. Gage, G., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. 65, 3564 (2012).
  15. Helander, K. Kinetic studies of formaldehyde binding in tissue. Biotechnic & Histochemistry. , (1994).
  16. Paljärvi, L., Garcia, J., Kalimo, H. The efficiency of aldehyde fixation for electron microscopy: stabilization of rat brain tissue to withstand osmotic stress. Histochemical Journal. , (1979).
  17. Okuda, K., Urabe, I., Yamada, Y., Okada, H. Reaction of glutaraldehyde with amino and thiol compounds. Journal of Fermentation and Bioengineering. 71, (1991).
  18. Bahr, G. Osmium tetroxide and ruthenium tetroxide and their reactions with biologically important substances: electron stains III. Experimental Cell Research. , (1954).
  19. Khan, A. A., Riemersma, J. C., Booij, H. L. The reactions of osmium tetroxide with lipids and other compounds. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 9, 560-563 (1961).
  20. Riemersma, J. Osmium tetroxide fixation of lipids for electron microscopy a possible reaction mechanism. Biochimica et Biophysica Acta. 152, (1968).
  21. Mikula, S., Binding, J., Denk, W. Staining and embedding the whole mouse brain for electron microscopy. Nature Methods. 9, 1198-1201 (2012).
  22. Mikula, S., Denk, W. High-resolution whole-brain staining for electron microscopic circuit reconstruction. Nature Methods. 12, 541-546 (2015).
  23. Crespigny, A., et al. 3D micro-CT imaging of the postmortem brain. Journal of Neuroscience Methods. 171, 207-213 (2008).
  24. Anderson, R., Maga, A. A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with MicroCT using Iodine-Based contrast. PLoS One. 10, 0142974 (2015).
  25. Zhou, Z., et al. Cerebral cavernous malformations arise from endothelial gain of MEKK3-KLF2/4 signalling. Nature. 532, 122-126 (2016).
  26. Choi, J., et al. Micro-CT imaging reveals mekk3 heterozygosity prevents cerebral cavernous malformations in Ccm2-Deficient mice. PloS One. 11, 0160833 (2016).
  27. Choi, J., Yang, X., Foley, M., Wang, X., Zheng, X. Induction and Micro-CT imaging of cerebral cavernous malformations in mouse model. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
  28. Benveniste, H., Kim, K., Zhang, L., Johnson, G. Magnetic resonance microscopy of the C57BL mouse brain. Neuroimage. 11, 601-611 (2000).
  29. Weninger, W. J., et al. High-resolution episcopic microscopy: a rapid technique for high detailed 3D analysis of gene activity in the context of tissue architecture and morphology. Anat Embryol. 211, 213-221 (2006).
  30. Schneider, J. E., et al. high-throughput magnetic paragraph sign resonance imaging of mouse embryonic paragraph sign anatomy using a fast gradient-echo sequence. MAGMA. 16, 43-51 (2003).
  31. Sharpe, J. Optical projection tomography. Annual Review of Biomedical Engineering. 6, 209-228 (2004).
  32. Cox, D. D., Papanastassiou, A., Oreper, D., Andken, B., James, D. High-Resolution Three-Dimensional microelectrode brain mapping using stereo microfocal x-ray imaging. Journal of Neurophysiology. 100, 2966-2976 (2008).
  33. Borg, J. S., et al. Localization of metal electrodes in the intact rat brain using registration of 3D microcomputed tomography images to a magnetic resonance histology atlas. eNeuro. 2, (2015).
  34. Fu, T. -M., et al. Stable long-term chronic brain mapping at the single-neuron level. Nature Methods. 13, 875-882 (2016).

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Neurosciences numéro 141 micro-CT lésion électrode neuroscience rat rongeur zebra finch
Une méthode à base de Micro-CT pour caractériser les lésions et la localisation des électrodes dans le cerveau Animal petit
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Masis, J., Mankus, D., Wolff, S. B.… More

Masis, J., Mankus, D., Wolff, S. B. E., Guitchounts, G., Joesch, M., Cox, D. D. A Micro-CT-based Method for Characterizing Lesions and Locating Electrodes in Small Animal Brains. J. Vis. Exp. (141), e58585, doi:10.3791/58585 (2018).

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