Summary
Questo articolo viene descritto un metodo semplice per preparare piccoli cervelli animali per l'imaging di micro-CT, in quale le lesioni possono essere quantificate ed elettrodi che si trova con alta precisione nel contesto dell'intero cervello.
Abstract
Verifica posizione di lesione e l'elettrodo sono tradizionalmente fatto tramite esame istologico di fettine di cervello macchiato, una procedura che richiede tempo che richiede la valutazione manuale. Qui, descriviamo un metodo semplice e diretto per quantificare le lesioni e l'individuazione di elettrodi nel cervello che è meno faticoso e produce risultati più dettagliati. Cervello intero è macchiati con tetrossido di osmio, incorporata in resina e imaged con uno scanner di micro-CT. Le scansioni si tradurrà in volumi 3D digitale dei cervelli con risoluzioni e spessori virtuale dipende la dimensione del campione (12 – 15 e 5 – 6 µm a voxel per ratto e zebra finch cervelli, rispettivamente). Lesioni superficiali e profonde possono essere caratterizzate e singolo tetrodi, matrici tetrodo, lesioni elettrolitiche, e sonde di silicio possono anche essere localizzati. Software libero e proprietario permette sperimentatori esaminare il volume del campione da qualsiasi aereo e segmento il volume manualmente o automaticamente. Perché questo metodo genera volume intero cervello, lesioni e gli elettrodi possono essere quantificati a un grado molto più alto rispetto a metodi attuali, che vi aiuterà a standardizzare i confronti all'interno e attraverso gli studi.
Introduction
I neuroscienziati hanno contato sulle lesioni per lungo tempo al fine di comprendere la relazione tra funzione e posizione nel cervello. Per esempio, la nostra comprensione dell'ippocampo come essendo indispensabile per l'apprendimento e memoria e della corteccia prefrontale come chiave per il controllo degli impulsi era entrambi i prodotti di serendipitous lesioni in esseri umani1,2. L'utilizzo di modelli animali, tuttavia, ha permesso neuroscienziati sfruttare la potenza delle lesioni andando oltre serendipity, e la funzione delle innumerevoli zone del cervello è stata delucidata attraverso studi sistematici delle relazioni struttura-funzione attraverso lesioni3,4.
Per assegnare correttamente la funzione di una struttura, tuttavia, studi lesionali richiedono procedure di quantificazione precisa, che è una zona che è stata carente. Il gold standard attuale per quantificare le lesioni è a sezione, Monte e il cervello di immagine con un microscopio ottico. Le fette imaged sono poi abbinate alle sezioni più vicini su un Atlante e le coordinate approssimative delle lesioni attraverso gli oggetti vengono segnalate indirettamente, spesso attraverso l'uso di immagini macchina fotografica lucida o esempio fette istologico3,4 ,5,6,7,8,9,10.
Di là dell'imprecisione delle attuali procedure di quantificazione di lesione, queste tecniche sono che richiede tempo e incline al fallimento. Piccoli cambiamenti nel cervello rigidità, acutezza della lamierina e temperatura può portare a sezioni raffazzonate, deformate o lacerate. Sezioni possono anche macchiare in modo non uniforme ed essere imaged in modo non corretto a causa di bolle nel liquido di montaggio. Importante, al momento di sezionamento, contesto tridimensionale della posizione della lesione nel cervello è perduto, facendo puntuale ricostruzione 3D della lesione nel cervello impegnativo.
Un'altra applicazione comune per le lesioni è stato quello di determinare la posizione del singolo e le registrazioni multiple di elettrodi nel cervello. Alla fine della sessione di registrazione finale, ricercatori inducono piccole lesioni elettrolitiche presso la punta dell'elettrodo ed elaborano il cervello istologicamente come fatto in un esperimento di lesione convenzionali11. Questa tecnica soffre le stesse controindicazioni descritte sopra, con ulteriori problemi è che le lesioni elettrolitiche sono solitamente più grandi degli elettrodi utilizzati per la loro ma sono solitamente abbastanza piccole che essi sono difficili da trovare istologicamente. Quando vengono inseriti elettrodi multipli, come nel caso di una matrice di tetrodo, verifica attraverso lesioni elettrolitiche è ancora più difficile. Un'alternativa alle lesioni elettrolitiche è l'uso di un colorante sull'elettrodo per poi verificare istologicamente12, ma questa tecnica soffre le stesse controindicazioni che vengono con istologia convenzionale.
Qui, descriviamo approfondita un metodo recentemente descritto13 basato su tecniche a raggi x e microscopia elettronica (EM) di colorazione la tomografia computata (micro-CT che quantifica le lesioni e individua gli elettrodi nel cervello degli animali piccoli meglio di corrente) metodi. Micro-CT è una tecnica di imaging in cui i raggi x sono sparato un campione che viene ruotato di 360° mentre uno scintillatore raccoglie i raggi x non ha deviato dal campione. Il risultato è una ricostruzione 3D digitale ad alta risoluzione del campione che possa essere visualizzato in qualsiasi orientamento e quantificato con precisione. Molte istituzioni accademiche hanno micro-CT scanner, che sono anche disponibili in commercio.
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Protocol
Tutte le cure e manipolazione sperimentale di animali erano esaminati e approvati dal comitato di uso e Harvard istituzionale Animal Care. La perfusione descritta qui è specifica per i ratti, ma la procedura è applicabile a tutti gli animali con i cervelli più piccoli o di dimensioni simili.
1. aspersione
- Preparare 1 x tampone fosfato salino (PBS). Per un ratto (età: 0,5 – 1,5 anni, peso: 250 – 600 g), 800 – 1.000 mL dovrebbe essere sufficiente. Utilizzare 400ml per irrorare l'animale e un ulteriore 400 mL per diluire il fissativo.
- Preparare il fissativo costituito da 2% (p/v) paraformaldeide (PFA) e glutaraldeide al 2,5% (p/v) (GA) in PBS 1X. Per un ratto, 400 mL è sufficiente. Salvare 50 mL in una provetta conica 50 mL per post-fissazione del cervello dopo aspersione.
- Anestetizzare il topo con 4 – 5% gas isoflurano (a 0,8 L/min O2 a 1.0 bar a 21 ° C) per 15 min.
- Iniettare una dose letale di sodio pentobarbital intraperitonealmente (180 mg/kg).
- Prova per la perdita di riflessivo nell'animale effettuando un esame riflesso toe-pizzico. L'ora di iniziare la perfusione fino a quando l'animale ha perso la sua risposta riflessa.
- Seguire la precedentemente descritti intracardiaca aspersione e cervello estrazione protocollo14 con le seguenti soluzioni: irrorare l'animale con 400 mL di PBS 1X a 125 mm Hg per rimuovere il sangue. Una volta che tutto il sangue è stato rimosso e sostituito con 1x PBS, iniziare che irrora con 400 mL di una soluzione di 2% PFA e 2,5% GA disciolto in 1X PBS a 125 mm Hg.
Nota: Se la procedura viene condotto in un animale che non è un topo, i componenti solo importanti della procedura perfusione sono l'uso di 1X PBS e 2% PFA, GA di 2,5% in PBS 1X. I volumi di soluzione e la pressione di perfusione può essere regolate secondo la specie.
2. post-fissazione
- Posizionare il cervello Estratto nel 2% PFA, 2,5% GA 1 x soluzione PBS (stessa soluzione utilizzata per irrorare l'animale in precedenza). Assicurarsi che il volume di soluzione è almeno 10 volte il volume del cervello. Per ratti, mettere il cervello in una provetta conica da 50 mL con 50 mL di soluzione. Conservare il campione in post-fissazione per 2 – 3 giorni, agitando leggermente a 4 ° C.
Nota: Se il campione in una provetta conica da 50 mL, ponendolo in orizzontale su un agitatore orbitale garantisce i migliori risultati. - Dopo che il campione è stato post-fissato a lungo abbastanza, lavare il campione in acqua bidistillata (ddH2O), acqua deionizzata (diH2O) o acqua ultrapura (Vedi Tabella materiali) quattro volte per le seguenti durate: 1, 1, 1 e 15 min.
Nota: Per questo protocollo, ddH2O, diH2O o acqua ultrapura dovrebbero essere intercambiabile. Per semplicità, ddH2O sarà utilizzato per fare riferimento a acqua purificata d'ora in poi.
3. colorazione
Attenzione: Per questo passaggio, condurre tutte le preparazioni di soluzione sotto una cappa durante l'utilizzo di guanti.
- Preparare almeno 10 volte il volume del cervello di soluzione di colorazione. Per i cervelli di ratto, preparare 50 mL di 2% (p/v) tetrossido di osmio (OsO4) ddH2O dalla combinazione di 25 mL di soluzione di riserva 4% OsO4 e 25 mL di ddH2O.
Attenzione: tetrossido di osmio è volatile e può causare problemi respiratori e cecità temporanea se non gestiti correttamente. Gettare tutto il materiale che a contatto con il tetrossido di osmio in un contenitore appropriato rischio chimico all'interno di un contenitore secondario. - Mettere il cervello in una nuova provetta conica 50 mL e aggiungere la soluzione4 OsO. Il cervello dovrebbe iniziare a girare il colore marrone come OsO4 reagisce con i lipidi nel tessuto.
- Tappare la provetta e sigillare accuratamente con paraffina film (Vedi Tabella materiali) per garantire che non ci siano perdite durante l'incubazione.
Nota: L'osmio è volatile e reagirà leggermente con la plastica del tubo, quindi il tubo di tenuta correttamente è molto importante. Il tubo può essere avvolto con foglio di alluminio per una maggiore protezione. - Conservare il tubo chiuso a 4 ° C, agitando leggermente su agitatore orbitale a 50 giri/min per 2 settimane. Posizionare il tubo orizzontale per garantire la migliore miscelazione. Garantire che il campione è completamente immersa nella soluzione agitando.
Nota: Se l'osmio non è consentito far circolare continuamente, esso potrebbe non penetrare completamente il campione, quindi posizionamento orizzontale sull'agitatore è molto importante.
4. incorporare
- Dopo che il campione è stato incubato in OsO4 per 2 settimane, lavarlo con ddH2O 5 volte a temperatura ambiente (TA) per le seguenti durate: 1, 1, 1, 15 e 60 min per rimuovere tutte le non associato OsO4 nel campione.
Nota: Gli scambi multipli, compreso l'ultimo scambio di 60 min, sono necessari per consentire a tutti l'osmio nel sistema circolatorio per diffondere fuori. - Lavare il campione con ddH2O per 30 min a 4 ° C.
Nota: Osmio può continuare a diffondere fuori il campione, ma la quantità deve essere notevolmente ridotta dal passaggio precedente. - Disidratare il campione con etanolo a superarlo alla fine con resina. Per disidratare, sostituire la ddH2O con 10 – 20 mL delle seguenti diluizioni di etanolo (per 30 min a 4 ° C): etanolo al 20% (v/v) e 80% (v/v) ddH2O; etanolo al 50% (v/v) e 50% (v/v) ddH2O; etanolo al 70% (v/v) e 30% (v/v) ddH2O; etanolo al 90% (v/v) e 10% (v/v) ddH2O; etanolo al 100%.
- Preparare le diluizioni di acetone/resina come segue.
- Preparare 100 mL di resina per l'incorporamento (Vedi Tabella materiali) secondo le istruzioni del produttore.
- Per rendere il 33% (v/v) resina - 67% soluzione di acetone, versare 15 mL di resina in una provetta conica da 50 mL e aggiungere 30 mL di acetone distillato di vetro 100%.
- Per rendere l'acetone di resina - 50% di 50% (v/v), versare 22,5 mL di resina in una provetta conica da 50 mL e aggiungere 22,5 mL di acetone distillato di vetro 100%.
- Per rendere il 67% (v/v) resina - 33% soluzione di acetone, versare 30 mL di resina in una provetta conica da 50 mL e aggiungere 15 mL di acetone distillato di vetro 100%.
- Utilizzare i restanti 32,5 mL di resina come la prima soluzione di resina 100% qui sotto.
- Iniziare il processo di infiltrazione di resina spostando il campione attraverso 10-20 mL delle seguenti diluizioni di acetone e acetone/resina: 100% di acetone per 30 min a 4 ° C; 100% di acetone per 30 min a 4 ° C; e 100% di acetone per 30 min a temperatura ambiente (TA).
Nota: Il resto del processo di infiltrazione si svolgerà a TA. - Immergere il campione nel 33% (v/v) resina 67% acetone per 3 h a RT, quindi 50% (v/v) resina - 50% di acetone per 3 h a RT, 67% (v/v) resina 33% di acetone per 3 h a RT e 100% resina per 12 h a TA.
- Fare un lotto fresco 50 mL di resina seguendo le istruzioni sulla bottiglia. Trasferire il campione nel contenitore in cui esso sarà guarito (ad es., gli stampi monouso descritti in Tabella materiali). Infondere il campione con resina fresca 100% per 4 ore a TA.
Nota: Se non viene utilizzata la resina fresca, la resina ha reso la giornata precedente inizierà ad indurire prematuramente, e il campione sarà difficile da manipolare. - Degas il campione in un forno sotto vuoto per 15 min a 45 ° C.
Nota: Questo passaggio vi aiuterà a rimuovere eventuali bolle d'aria intrappolate all'interno del campione, ma non è essenziale e non influenzerà la qualità dei dati. - Infine, curare il campione in un forno per 48 h a 60 ° C.
5. micro-CT
- Una volta che il campione sia stato sanato, staccare lo stampo USA e getta e la scansione con la macchina di micro-CT.
Nota: A seconda della macchina utilizzata, le impostazioni saranno diverse. Per lo scanner utilizzato dagli autori elencati nella Tabella materiali, le impostazioni consigliate sono 130 kV, 135 µA con un filtro di rame 0,1 mm e una fonte di molibdeno, un'esposizione di 1 secondo e una media di 4 fotogrammi al proiezione. Tuttavia, gli sperimentatori opportuno calibrare lo scanner individualmente, come molti fattori influenzerà le impostazioni ottimali durante una sessione specifica. - Una volta che la scansione è completata, è possibile ricostruire il campione con i parametri consigliati per la combinazione di software e dello scanner dello sperimentatore in un computer con il software dello scanner.
- Infine, visualizzare e analizzare il volume digitale ricostruito utilizzando software di sperimentatore di scelta (Vedi Tabella materiali per esempi).
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Representative Results
Tradizionalmente, cervelli sono sezionati e macchiati al fine di quantificare le lesioni e individuare gli elettrodi, ma questo metodo è soggetto a errori, alta intensità di lavoro e in genere richiede la stima dei risultati. Di preparazione intero cervello per micro-CT imaging, la probabilità di danneggiare i campioni è notevolmente ridotta, caratteristiche di interesse possono essere analizzate nel contesto dell'intero cervello e il metodo si presta ad elaborazione parallela di molti campioni, considerevolmente accelerare la preparazione del campione.
Il metodo prevede quattro fasi principali: (1) colorazione un cervello irrorato con tetrossido di osmio, (2) l'inserimento del cervello in resina, (3) il cervello per immagini con uno scanner di micro-CT e (4) analizzare il volume digitale risultante (Figura 1). In questo articolo, sono descritti solo i passaggi 1-3, come passaggio 4 (analisi) variano notevolmente a seconda delle specifiche esigenze del progetto.
Considerando che nella tradizionale divisione in cui un orientamento di sezionamento deve essere scelto in anticipo, il volume digitale risultante da questo metodo può essere manipolato in tre dimensioni e praticamente affettato in qualsiasi orientamento (Figura 2a-2b). L'utente può anche eseguire la scansione di una sottosezione del campione a una risoluzione superiore, se desiderato, ad esempio il bulbo olfattivo di un cervello di ratto, dove fibre nervose e singoli glomeruli sono visibili (Figura 2c). Il metodo è anche ampiamente applicabile a piccoli cervelli animali. Per verificare ciò, un cervello di zebra finch è stato preparato utilizzando lo stesso protocollo utilizzato per i cervelli di ratto e provocato un volume digitale riuscito (Figura 2e). Microscopia elettronica (SEM) di un campione preparato per micro-CT ha confermato che il tessuto non è stato danneggiato fino a un ordine di grandezza nella risoluzione oltre la risoluzione di micro-CT (Figura 2d). Tuttavia, dovrebbe essere notato che c'era considerevole danno ultrastrutturale, rendendo questa tecnica inadatto per la microscopia elettronica (EM).
La tecnica può essere utilizzata per trovare lesioni superficiali (Figura 3) e le lesioni profonde all'interno del cervello (Figura 4). La tecnica consente anche l'individuazione del singolo tetrodi in situ, lesioni elettrolitiche, tracce di elettrodo di diametro sufficiente, tetrodo matrici in situ e silicio sonde in situ (Figura 5).
Infruttuosi preparazioni comprenderà incompleta mineralizzazione del tessuto, che può verificarsi anche se il buffer non corretto vengono utilizzati (Figura 6). Tuttavia, se solo caratteristiche di superficie sono necessari, ad esempio, poi sola superficie di colorazione del campione può essere sufficiente per lo sperimentatore.
Figura 1 : Panoramica metodo. Panoramica dei passaggi richiesti per preparare e analizzare un intero cervello facendo uso di micro-CT imaging. Figura utilizzata con il permesso dal autori13. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Capacità di caratterizzazione della lesione attraverso micro-CT imaging. (un) Manipulatable 3D volume e (b) virtuale fette (13,9 µm voxel) orientamenti arbitrario da una micro-TAC di un topo lungo Evans. (c) bulbo olfattivo di scansione a risoluzione superiore (4,9 µm voxel) rivelando glomeruli (freccia bianca) e singole fibre nervose (freccia blu). (d), microscopio elettronico a scansione (SEM) immagine (10 nm/pixel) della corteccia visiva di un cervello di ratto preparato per micro-CT imaging. (e), Zebra finch (Taeniopygia guttata) cervello preparato per micro-CT imaging; Volume 3D e 2D fette (5,6 µm voxel) sul frontale, orizzontale e sagittale. Figura utilizzata con il permesso dal autori13. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Caratterizzazione di lesione corteccia visiva utilizzando micro-CT. (un) visualizzazione 3D di un cervello di ratto leso nella corteccia visiva con acido quinolinic. Il pannello di sinistra mostra il volume della lesione nel contesto del cervello (cervello reso leggermente trasparente per consentire accesso visivo alla lesione). Il pannello di destra mostra lesione isolata del volume. (b) 2D fette di lesione sul frontale, orizzontale e sagittale (12,8 µm voxel). Il top 3 pannelli mostrano le sezioni non segmentate, e Visualizza i pannelli di fondo 3 sezioni con annotazione di lesione sovrapposti. Questa lesione era manualmente annotata nell'orientamento della corona ogni 2 fette. Il volume è stato quindi creato mediante interpolazione. Figura utilizzata con il permesso dal autori13. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: confronto di caratterizzazione di lesione dorso-laterale striatum utilizzando micro-CT e l'istologia. (un) sagittale, orizzontale e coronale viste di sinistra metà del "cervello 1" trattate per micro-CT imaging (13,5 µm voxel). Il top 3 pannelli mostrano sezioni non segmentati, e i pannelli di fondo 3 Visualizza la lesione con annotazioni stesse sezioni. La lesione era manualmente segmentato nel piano sagittale ogni 2 sezioni e successivamente interpolato. (b) sezione coronale corrispondente più vicino di destra metà del "cervello 1" trattate istologicamente per microscopia chiara. Pannelli (c, d) sono simili a (a, b) ma corrispondono al "cervello 2". La lesione di cervello 2 è stata segmentata manualmente nell'aereo della corona ogni 8 sezioni. (e) caratterizzazione della lesione di istologia-trattati metà destra del cervello 1 (grigio scuro) e 2 (grigio chiaro). I numeri in (b, d, e) sotto i pannelli corrispondono a posizioni relative bregma. (f) caratterizzazione della lesione di sinistra metà del cervello 1 trattate per micro-CT. Il primo pannello mostra la lesione isolata. I pannelli di secondo e terzi mostrano la lesione nel contesto del cervello da due punti di vista. (g) corrispondente al cervello 2 ma stesso come (f). (h) una sovrapposizione delle lesioni in (f, g) che illustrano la capacità per il confronto di caratterizzazione della lesione con volumi digitali del cervello. La lesione in (f) è stata registrata alla lesione in (g), ed entrambi sono illustrati nel contesto della metà sinistra del cervello 2. Figura utilizzata con il permesso dal autori13. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Localizzazione elettrodo attraverso micro-CT imaging. (un) singolo tetrodo sinistra in situ (14,0 µm voxel). Pannello di sinistra superiore: intensità massima proiezione delle sezioni coronali virtuale che mostra la posizione di un tetrodo nicromo viaggiando attraverso la corteccia visiva in callosum del corpus di un ratto; in alto a destra: primo piano di un'immagine visualizzata nel pannello di sinistro superiore di (a) (rettangolo bianco). In basso a sinistra: sagittale; in basso a destra: vista orizzontale dell'elettrodo impiantato (freccia bianca indica la posizione del tetrodo). elettrodo e (b) elettrolitica lesione traccia nella regione anteriore di un cervello di ratto (13,9 µm voxel). In alto a sinistra: rendering 3D di un cervello con la lesione elettrolitica segmentata fuori (freccia bianca che indica lesione viola); in alto a destra: coronale. In basso a sinistra: sagittale; in basso a destra: sezioni orizzontali che indica lesione elettrolitica (frecce bianche) prodotta con un elettrodo di tungsteno diametro 75 µm. Inoltre, alcuni metallo depositato dall'elettrodo al momento di ritrazione è visibile lungo la pista nella vista sagittale (frecce bianche). impianto di 16-tetrodo (c) lasciato in situ nella corteccia anteriore di un cervello di ratto. In alto a sinistra: rendering 3D di un cervello intero con una matrice di 16-tetrodo sinistra impiantato; in alto a destra: coronale. In basso a sinistra: sagittale; in basso a destra: sezioni orizzontali che indica un impianto di 16-tetrodo (8,9 µm voxel). sonda (d), silicio (gambo di 10 mm, 32 siti) lasciato in situ viaggiando attraverso strutture sottocorticali (13,9 µm voxel), ippocampo e corteccia posteriore. In alto a sinistra: rendering 3D di un cervello intero con una sonda di silicio segmentati (sonda verde che indica freccia bianca); in alto a destra: coronale. In basso a sinistra: sagittale; in basso a destra: vista orizzontale di un silicio sonda nel cervello. Inoltre, il sito di riferimento della sonda di silicio è visibile nelle sezioni coronale e sagittali (punta delle frecce bianche). Figura utilizzata con il permesso dal autori13. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 : Effetto del solvente tetrossido di osmio sulla penetrazione di osmio. (un) pannello di sinistra: cervello del ratto incubati in tetrossido di osmio in ddH2O per 1 settimana. Pannello di destra: cervello del ratto incubati in tetrossido di osmio, ddH2O per 2 settimane. (b) cervelli di ratto due incubati in tetrossido di osmio in tampone cacodilato di sodio per 6 settimane. Figura utilizzata con il permesso dal autori13. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
I seguenti sono passaggi critici del protocollo: in primo luogo, l'uso di una combinazione di PFA e GA per irrorare l'animale e successivamente post-fissare il cervello è stato fondamentale per il raggiungimento di penetrazione coerente osmio completo del tessuto. Anche se non abbiamo provato questo in modo esplicito, una spiegazione plausibile è che la fissazione di PFA è reversibile15, considerando che la fissazione di GA non è reversibile16,17. Poiché un'incubazione di due settimane in tetrossido di osmio è necessaria per la completa infiltrazione del tessuto, è possibile che la PFA all'interno del cervello si diffonde fuori e il tessuto si riduce durante la colorazione. L'osmio così non può preservare le strutture interne.
L'uso di osmio acquosa, al contrario di osmio disciolto in un buffer (cioè, sodio cacodilato), era assolutamente necessario per garantire la penetrazione del tessuto completo dell'osmio. Anche dopo un'incubazione di 6 settimana, osmio disciolto in sodio cacodilato non ha fatto infiltrare il tessuto completamente e sembrava una barriera di diffusione (Figura 6). L'osmio è estremamente reattivo ai lipidi e pensato per associare quelli in membrane cellulari18,19,20. Se il tessuto non è sufficientemente permeabilizzato, come potrebbe essere il caso con un buffer delicato come sodio cacodilato, è possibile che le membrane cellulari può saturare con osmio e stericamente impedire ulteriori osmio di diffusione nel tessuto. Supponiamo, tuttavia, che agisce come un detergente leggero di acqua come solvente per l'osmio e permeabilizes il tessuto sufficientemente per consentire la diffusione profonda nel tessuto.
Se gli sperimentatori stanno preparando un cervello più piccolo, come quello di un mouse, il tempo di incubazione in osmio probabilmente può essere ridotto. Allo stesso modo, il tempo di incubazione deve essere aumentato in grandi campioni. Questo può essere testato per determinare il tempo minimo per la macchiatura coerente in un cervello che è in formato diverso da quello di un topo. Se gli sperimentatori problemi con infiltrazione di osmio completo, i problemi probabilmente non utilizza sia PFA e GA durante l'aspersione e la post-fissazione, non usando l'acqua come solvente per l'osmio (come discusso in precedenza) e l'agitazione insufficiente durante l'osmio incubazione. Abbiamo trovato, per esempio, che quando incubando in provette coniche da 50 mL, che pone i tubi dal loro lato (al contrario di verticalmente su un supporto), riempiendole di macchia e mettendoli in un agitatore orbitale a 50 giri/min per l'incubazione di intero periodo assicurato adeguato infiltrazione.
Questo metodo è limitato in diversi modi. In primo luogo, la preparazione non conserva ultrastruttura molto bene, quindi non dovrebbe essere utilizzato per microscopia elettronica. Questo metodo non è cumulabile con qualsiasi ulteriore istologia o immunofluorescenza. La risoluzione del volume digitale è determinata dalla dimensione del campione (i campioni più piccoli possono essere scansionati a risoluzioni più elevate) e dalla geometria dello scanner, se essa si basa su ingrandimento geometrico; Tuttavia, sottosezioni del campione possono essere scansionate a risoluzioni più elevate, se lo si desidera.
È stato presentato un nuovo metodo che unisce trattamento del tessuto di microscopia elettronica-stile con micro-CT imaging per quantificare le lesioni e la localizzazione di elettrodi nel cervello degli animali piccoli. Questo metodo è probabilmente meno laborioso, richiede meno esperienza e produce risultati quantificabili più facilmente che il gold standard attuale per sezionamento e colorazione di un cervello. In precedenza, gli scienziati hanno descritto un protocollo per la penetrazione anche osmio in cervelli di topo che è destinata a preservare l'ultrastruttura per microscopia elettronica21,22. Questo protocollo, tuttavia, è abbastanza complesso. In questo studio, gli autori hanno mirato a sviluppare un metodo molto più semplice per micro-CT imaging, piuttosto che la microscopia elettronica. Ci sono stati altri studi condotti utilizzando micro-CT Imaging cervelli per vari scopi. Una precedente inchiesta nei conigli e topi usato micro-CT per trovare tumori e altre anomalie23. Questa indagine fatta uso di agenti di contrasto MRI proprietari, ma i ricercatori hanno predetto il utilità potenziale di micro-CT in studi lesionali. Un altro studio in topi volte a trovare differenze morfologiche lorda per uno schermo di droga coinvolto la colorazione dei cervelli di topo con iodio nel cranio, ma gli autori hanno affrontato restringimento irregolare del tessuto e optato per incorporare il tessuto in un idrogel24. Altri studi in topi hanno mirato a trovare malformazioni cavernose cerebrali, un disordine dei capillari anormalmente grandi e irregolari e hanno fatto uso di tetrossido di osmio e iodio acquoso come macchie; Tuttavia, queste sono state effettuate in campioni molto più piccoli (hindbrains del mouse indipendente) rispetto a quelli descritti qui25,26,27. Metodi alternativi per la generazione di volumi 3D del cervello sono µMRI28 e di microscopia ad alta risoluzione episcopica31. La risoluzione del µMRI è più povere (~ 25 µm voxel per simili campioni28), e la tecnica è più costoso23,30. La microscopia ad alta risoluzione episcopica anche sfide: è una tecnica distruttiva, che avrebbe bisogno di un apparato di blocco-viso permettendo di sezionamento del intero-cervello per essere prodotta. Il lavoro qui presentato si estende anche i precedenti tentativi di individuare gli elettrodi nel cervello con i raggi x32,33,34 catturando entrambi l'elettrodo e il tessuto circostante. Inoltre, la tecnica permette per l'individuazione dei singoli elettrodi, tetrodo matrici, lesioni elettrolitiche, tracce di elettrodo e punte in silicio.
Un prezioso orientamento futuro sarebbe la creazione di un atlante "cervello medio" a cui studi lesionali potrebbero essere co-registrati per standardizzare la posizione della lesione e la quantificazione di dimensione. Questo metodo può anche essere ampliato ad altri modello e organismi non-modello, come esemplificato dalla sua immediata applicazione al cervello zebra finch (Figura 2).
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Greg Lin e Arthur McClelland per la loro esperienza con la macchina di micro-CT, David Richmond e Hunter Elliott l'immagine e dati analisi Core (IDAC) presso la Harvard Medical School per loro consigli di elaborazione di immagini e William Liberti a Boston Università per fornire gentilmente un cervello zebra finch. Quest'opera è stata eseguita in parte al centro per sistemi su scala nanometrica (CNS), un membro della nazionale nanotecnologia coordinato infrastruttura rete (NNCI), che è sostenuto dalla National Science Foundation sotto Premio NSF n. 1541959. CNS è una parte dell'Università di Harvard. Questo lavoro è stato supportato dal Richard e Susan Smith Family Foundation e IARPA (contratto #D16PC00002). S.B.E.W. è stato sostenuto da borse di studio dalla Human Frontier Science Program (HFSP; LT000514/2014) e l'organizzazione europea di biologia molecolare (EMBO; ALTF1561-2013). G.G. è stato sostenuto dalla National Science Foundation (NSF) Graduate Research Fellowship programma (GRFP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | 2% (w/v/) in 1X PBS |
| Glutaraldehyde (GA) | EMS | 16220 | 2.5% (w/v) GA in 1x PBS |
| OsO4 | EMS | 19190 | Work in fume hood |
| Ethanol | Decon Labs | Koptec | 140, 190, 200 proof |
| Acetone | EMS | 10015 | Glass-distilled |
| Durcupan ACM resin | Sigma-Aldrich | 44610 | A, B, C and D components, resin for embedding |
| Disposable molds | Ted Pella | 27114 | Suggested |
| milliQ water (ultrapure water) | Millipore Sigma | QGARD00R1 (or related purifier) | Suggested |
| Parafilm (paraffin film) | Millipore Sigma | P7793 | Suggested paraffin film |
| Micro-CT scanner | Nikon Metrology Ltd., Tring, UK | X-Tek HMS ST 225 | Used by authors |
| Software for visualizing and analyzing micro-CT scans: | |||
| Volume Graphics | VG Studio Max | Used by authors | |
| FEI / Thermo Scientific | Avizo | Used by authors | |
| FEI / Thermo Scientific | Amira | Similar to Avizo | |
| Mark Sutton & Russell Garwood | Spiers | Free, http://spiers-software.org/ | |
| Pixmeo Sarl | Osirix Lite | Free, https://www.osirix-viewer.com/ | |
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