Summary
该协议提供了一种基于斐济的、用户友好的方法,以及解释如何可靠地分析单个细胞和弯曲上皮组织中的actomyosin行为的直截了当的说明。无需编程技能即可遵循本教程;所有步骤均使用斐济的图形用户界面和相关插件以半交互式方式执行。
Abstract
果蝇未成熟卵被称为卵室,其结构类似于原始器官,在发育过程中从圆形到椭圆形形态发生形态变化。这种发育过程被称为"成因",对于生成功能成熟卵子以确保下一代苍蝇至关重要。由于这些原因,卵室已成为了解动物器官发育的理想和相关模型。
已经开发了几种体外培养方案,但这些协议有几个缺点。其一涉及应用各种盖,对图像蛋室施加人工压力,以固定它们,并增加被分析的蛋室圆周表面的图像采集平面。这种方法可能会对产生围绕其长轴旋转蛋室的功率的薄肌苷机械的行为产生负面影响。
因此,为了克服这一限制,我们在介质中自由培养果蝇卵室,以便可靠地分析沿着蛋室周长的actomyosin机械。在协议的第一部分,我们提供了一份手册,详细介绍了如何在局部细胞规模(最多15个细胞)的有限采集平面中分析actomyosin机械。在协议的第二部分,我们为用户提供了一个新的基于斐济的插件,允许简单地提取蛋室圆周表面的一个定义的薄层。然后,以下协议描述了如何在组织尺度(>50细胞)分析肌苷信号。最后,我们指出这些方法在局部细胞和组织尺度上的局限性,并讨论其潜在的未来发展和可能的应用。
Introduction
新型成像和软件技术在生命科学中的应用不断发展,对理解生命的基本原则产生了巨大影响。主要挑战之一是动态发育过程的可靠可视化,以及不同组织中的实时成像。组织是器官和身体的一部分,因此,大多数不容易获得成像。因此,已经制定了允许其解剖和体外培养的协议,以便可视化生物事件,充分反映活体内的体内状况。
在过去的几十年里,果蝇卵室的培养和活成像,类似原始器官的类似类似类似动物的结构,极大地促进了对原始器官发育基本原则的理解1。,2,3.目前,有几种培养协议可用,其使用取决于采集时间、要成像的细胞类型及其可访问性(例如,内生殖系与外体线)4 。
所有这些培养协议中的一个共同特征是需要固定分析的蛋室,这些卵室在液体介质中表现出高收缩活性。卵室的收缩活动主要是由覆盖着一长串连接的卵室5、6、7的肌肉表引起的。因此,为了适当固定幼蛋室,已开发出各种方法,包括用盖片覆盖蛋室6、8、9或柔性毛毯4, 10或嵌入低熔点甘蔗3,11。这些方法很受欢迎,因为它们还允许对更大的视觉平面进行成像,因为蛋室的圆周表面很细平。
然而,最近,已经表明,年轻的卵室(阶段1-8)围绕其前后轴6旋转,并且这种组织运动是由接近这些年轻卵室圆周表面的精细肌苷网络供电的12.因此,由这种组织细微扁平引起的细胞表面的人工改变可能对产生力的肌苷机械的行为产生负面影响。相反,如果卵室组织不扁平,卵室圆周表面的蛋白质显微成像将因采集平面尺寸减小而变得更加有限。
因此,我们结合Prasad等人9和Celeste Berg 4、10实验室的协议,进一步修改它们,以便在开发的方法中不使用盖玻片/柔性毯子/agarose。果蝇卵室在介质中自由培养,此处介绍的协议仅适用于倒置显微镜。该协议分为两个部分。第一部分侧重于分析在卵室内局部细胞规模(多达15个细胞)的actomyosin信号。在第二部分,我们专注于克服与卵子室自由培养引起的小采集平面相关的限制。在这方面,我们开发了一种基于斐济的新型计算方法,采用半交互式图形用户界面,选择性地提取和展开圆周组织表面的已定义层。之后是一个协议,描述如何在组织规模(即>50细胞)分析肌苷。由于使用经典 z 堆栈投影(图 1)选择性地提取已定义的曲面上皮组织的薄层(图1),这种易于使用的方法是全面了解在果蝇卵室的组织尺度上,一个薄(<1μm)的肌苷网络的行为。
此外,为了方便该协议,我们提供示例延时电影(TlMs)和荧光标记的非肌肉常规肌苷II行为的样本文件(见补充文件3)。肌苷II是一种运动蛋白,代表肌酸机械的活性收缩部分。为了成像肌辛II,我们使用果蝇转基因线,其中包含一个经过修饰的肌素II的调节光链,称为MRLC::GFP(详见材料表)12,13。为了可视化细胞膜,该协议基于商业染料(见材料表)。该协议不仅适用于分析小亚细胞MRLC::GFP信号12,也适用于±300μM周围的任何类似大小的亚细胞粒子,如使用生命行动::GFP 12、14观测到的亚细胞粒子。
虽然这两种协议都使用体外培养的果蝇卵室呈现,但在优化培养培养培养和取决于可用性时,也可以使用其他组织进行actomyosin信号的采集荧光标记的蛋白质与相应的商业染料,或,例如,mRNA显微注射,以获得瞬态基因表达配置文件。同样,从圆周表面提取薄层的斐济协议可以更普遍地应用于椭圆体和类似器官的组织中。
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Protocol
注:以下协议提供了如何分析局部细胞和果蝇卵室组织规模的肌苷的说明。本地规模方法允许用户分析每个蛋室多达15个细胞中的详细肌苷行为,并要求使用高速成像和倒置共聚焦显微镜在短时间内(5-10分钟)采集TMS。相比之下,组织规模为用户提供50-100个细胞中的actomyosin信息,并且需要使用低速成像和倒旋转盘显微镜长期(±30分钟)采集TMS(参见图2和表 1中每个比例的建议参数 。分析丙位肌苷信号的尺度决定完全取决于用户的科学问题。附带的测试 TTL 应有助于做出此决策。
1. 本地蜂窝秤 (LCS)
注:要解剖和图像体外培养的果蝇卵室,请遵循补充文件1中描述的协议。要分析获取的 TTL,请继续使用以下协议。补充文件3提供了与所附的TMS测试文件的链接。
- 本地蜂窝规模(LCS)的TMS数据处理
- TTL的漂白校正,以补偿荧光标签的强度衰减
- 确保按照以下说明在正在使用的计算机上安装最新的斐济应用程序:斐济>打开 TLM(例如,来自补充文件 3的 TestMovie1.tif)。
- 通过单击"图像> 颜色>拆分通道"拆分颜色通道来拆分颜色通道。
- 使用Image >调整>漂白校正>简单比率>背景强度 0.0. 在两个通道上执行漂白校正。
注:如果得到的结果不理想,请探索此插件中哪种校正方法最适合(例如,使用直方图匹配而不是简单比率)。
- 用于生成 TTLM 的细胞掩码的细胞分段
- 如果斐济尚未打开,请重新打开它(并确保它是最新的),在帮助>更新>应用更改>确定。
- 如果尚未完成此操作,请下载宏组织细胞分类电影.ijm(来自http://adm.irbbarcelona.org/matlab/TissueCellSegmentMovie.ijm)。将此脚本拖放到斐济。
- 打开漂白剂校正的 TLM .tiff 文件(请参阅第 1.1.1 节)。使用图像>颜色>拆分通道拆分漂白校正文件的通道。
- 通过按打开脚本中的"运行"图标,在所选 TLM 的活动细胞膜通道上运行上载的脚本。将高斯模糊设置为2.500,将细胞检测灵敏度设置为-1,然后单击"确定"。为了获得一个不错的单元格掩码,不要更改上面的这些参数。将使用 63x 物镜获得的 TM 的估计噪声容差设置为 10-20 之间,然后单击"确定"。
注:对于其他目标,可能需要不同的参数。清洁 TLM 中的背景时,所需的估计噪声容差较低。 - 生成的单元格掩码出现在分析的 TLM 中,也出现在名为粒子堆栈 (G)的新窗口中,此外,还会出现一个名为"需要操作"的小窗口。从 TLM 上的细胞掩码中,只关注 TLM 中心的细胞,并选择能够在整个 TLM 中提供完整且定义明确的轮廓的细胞。
- 如果所选单元格包含人工/额外单元格轮廓,请使用名为 TLM中"需要操作"的合并工具窗口。对于后者,请按照窗口中的说明进行操作。
注:确保细胞轮廓定义明确,并与 TLM 中的实际细胞膜相对应,因为任何不精确都可能影响后续分析。其他调整和更改(如删除不需要的单元格)稍后可以使用 Surface 管理器工具完成(第 1.1.3 节中介绍)。 - 当中心中的选定单元格与实际细胞膜完全对应时,将粒子堆栈另存为 .tiff 文件,在文件>另存为> Tiff之后。
- 将生成的单元格掩码加载到曲面管理器
- 安装表面管理器插件15到使用的斐济设置。按照维克托利诺娃等人16日的指示。
- 使用插件打开曲面管理器 >分割>曲面管理器(3D)。
注:Surface 管理器窗口在右侧显示多个操作按钮,在左侧显示一个空窗口。要查看所有操作按钮,可能需要以高度/宽度拉伸窗口。请注意,时间范围将显示为 z 切片。 - 单击"文件>打开",将相应的粒子堆栈 .tiff 文件打开到曲面管理器中,然后选择要打开的图像(例如,粒子堆栈1.tif)。
- 在 Surface 管理器中,单击"读取大纲"图像按钮并将 Jacquard 索引设置为 60%。
注:加载粒子Stack1.tif文件可能需要几分钟时间,具体取决于计算机的处理能力。 - 加载后,每个单元格都将分配一个 S 编号,并显示在 Surface 管理器窗口的左侧部分。
注:要显示所有单元格的轮廓和单元格名称,请在 Surface 管理器窗口底部选中"显示所有"和"显示标签"复选框。建议在检查单元格编号的正确性后使用此功能。 - 单击第一个 S 编号;从粒子堆栈1.tif导入的细胞轮廓出现在TLM上。在整个 TLM 中检查每个导入的 S 编号的单元格轮廓质量,并删除显示不正确的单元格轮廓的不需要的单元格。为此,请突出显示单元格轮廓并单击"删除"按钮。
注:还可以纠正不精确的单元格轮廓并添加新的单元格轮廓。讨论部分对此进行了介绍。 - 按"保存到磁盘"按钮,将所有更正的单元格另存为 RoiSet.zip 文件。
注:如果需要中断会话,可以稍后将 RoiSet 文件加载到 Surface 管理器中:在斐济打开 TLM(文件>打开)并选择 TLM。通过插件打开曲面管理器 >分段>曲面管理器(3D).通过单击"从光盘加载"按钮并选择相应的 RoiSet.zip 文件来加载相应的 RoiSet.zip 文件。仔细检查加载的单元格掩码是否与加载的 TLM 相对应。
- TM 中组织漂移的校正
注:在 TTLM 的采集时间内,由于上皮旋转或不需要的移动,可能会观察到漂移效应。在这两种情况下,我们建议纠正任何漂移,以便以后简化手动肌苷分析。漂移校正仅适用于手动肌苷分析。本教程需要安装了 MultiStackReg 插件 (https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#multistackreg) 的最新斐济软件。- 通过文件>打开在斐济打开漂白剂校正的 TLM,然后选择使用上述教程创建的漂白校正文件。
- 分割通道,并选择通过图像>颜色>拆分通道标识细胞膜的通道。
- 当单元格轮廓明显不平滑时,请使用以下协议:过程>滤镜>高斯模糊。将其设置为 63x 目标的 ±1+2,然后单击"确定",然后单击"是"。单击"进程>二进制>使用默认设置转换为蒙版;"然后,单击"确定"。
- 加载多堆栈插件插件后插件>注册>多堆栈注册.
- 确保堆栈 1 设置为细胞膜通道,操作 1 设置为"对齐",转换设置为"转换"。选中"保存转换文件"复选框,然后单击"确定"。
- 使用文件>打开并选择 TLM 重新打开选定的 TLM、多堆栈插件和保存的转换文件。使用图像>颜色>拆分通道拆分颜色通道 。
- 通过单击插件>注册>多堆栈插件来加载多堆栈插件 。选择加载转换文件作为操作 1。
- 将变换保留为刚体,然后单击"确定"。选择以前保存的转换文件,然后再次单击"确定"。
- 合并图像通道,并将注册的 TLM 另存为 .tiff 文件,然后按照图像>颜色>合并通道。通过单击"文件>另存为>Tiff "保存文件。
注:有其他方法来纠正在斐济的组织漂移, 即通过插件>注册> StackReg/正确 3D 漂移.
- TTL的漂白校正,以补偿荧光标签的强度衰减
- LCS表面管理器中丙肌苷脉冲分析
注:此协议步骤允许科学家识别分析组织中是否存在 actomyosin 脉冲,并了解 actomyosin 信号的详细行为以及方向性。- 打开斐济并确保在 Surface 管理器中打开 TLM 及其相应的单元格掩膜。
注:确保斐济已安装并处于最新状态,并安装了 Surface 管理器插件(步骤 1.1.3.1)。 - 打开具有文件>打开的 TLM 并选择要打开的 TLM(例如,TestMovie1_bleach.tif)。通过插件加载曲面管理器插件 >分段>曲面管理器(3D)。在此处加载教程中创建的保存的单元格掩码(例如,粒子堆栈1.tif),通过文件>打开并选择单元格掩码(例如,粒子堆栈1.tif)。加载相应的感兴趣区域(ROI,例如,TestMovie1_RoiSet.zip)。参见图 3A。
- 切换到所选 TLM 中感兴趣的通道。
注:要区分通道,请按照 TLM 周围指示的颜色代码进行操作。 - 在 Surface 管理器中,单击"统计信息"按钮以获取名为"平均灰色值按切片"的窗口(图 3B)。请注意,将随时间显示给定分析通道内给定分析通道中的 actomyosin 信号的平均值/中值强度值,以及与细胞面积和细胞形状相关的其他参数。
注:强度值以任意单位 (A.U.);细胞面积以像素为单位,需要转换为方形微米。 - 将获取的值另存为电子表格文件。单击"统计信息"窗口",文件>另存为。
注:以后可以验证获得的统计值如下:在斐济打开漂白剂校正的 TLM 并打开 Surface 管理器。通过按"从磁盘加载"按钮将相应的 RoiSet.zip 加载到 TLM 并打开文件。将上载包含单元格轮廓的保存蒙版,单元格的名称将显示在左侧 Surface 管理器窗口中。单击"统计信息"按钮查看统计信息值。
- 打开斐济并确保在 Surface 管理器中打开 TLM 及其相应的单元格掩膜。
- LCS个体亚细胞肌苷信号的手动分析
注:该协议要求最集中,而且非常耗时。一般来说,一个获得TLM可以在1天内舒适地分析。这不包括在进行解剖、解剖本身和图像采集之前进行飞行准备的时间。- 在最新的斐济应用程序中打开选定的漂白剂校正和注册(漂移校正)TLM。使用漂白剂校正和漂移校正的 TLM(例如,TestMovie1_漂白剂_reg.tif)作为测试示例。
- 调整亮度和对比度,查看使用图像>调整>亮度/对比度的单个 actomyosin 信号。
- 相对于组织/身体轴,以相同的方向对齐 TTL。在蛋室的情况下,在分析之前,将蛋室的前侧始终对齐在图像/子电影/TLM的左侧。
- 将所选影片划分为 30 s 短片,并按时间投影每个子影片。使用相应的名称保存非时间投影和时间投影子影片。保留原始源。
注:子电影可以从原始 TTL 创建,首先通过图像>堆栈>切片删除器删除不需要的帧。定义要删除的切片并设置增量。在增量 = 1 时使用切片删除程序之前转换为 RGB。要对 30 s 子影片进行时间投影,请单击"图像>堆栈> Z项目"> 定义帧(切片)的最大强度,然后单击"确定"。跳过每秒钟 30 s 子影片,以避免在随后两个 30 s 子影片中计算 actomyosin 信号 2 倍。 - 将时间投影图像放在相应的 30 s 子影片旁边(图 4A,B)。识别时间投影子影片上的信号线。通过手动播放子影片,在原始子影片中沿此线识别 actomyosin 信号移动 (0±360°) 的方向。使用角度工具(在斐济栏中)手动测量信号移动相对于定义的组织轴或类似可用工具的方向。
注:斐济仅在 0°~180° 刻度(图 4C)上工作,需要重新计算获得的值到 0°~360° 刻度上。信号线对应于一个actomyosin信号随时间移动的轨迹。 - 为了避免在分析actomyin信号时重复,在时间投影子电影中标记细胞内分析的信号线(图4B,D)。
- 分析 30 s 子影片中的所有选定单元格并保存获得的角度。
注:在整个TLM中只分析具有明确细胞轮廓的细胞中的亚细胞质肌酸信号。排除在整个 TLM 中检测到的信号小于 15-20 的单个细胞。忽略由于细胞来源不明而在细胞间移动的肌苷信号。图4D显示了30s子电影中一个分析单元的信号计数示例。 - 继续,直到分析一个 TLM 的所有 30 s 长子电影,并将一个 TLM 的 actomyosin 信号的所有测量角度保存在电子表格文件中。
- 将所有测量的角度汇总到相关数量的 TTL 上(取决于实验)。绘制分析的actomyosin信号的方向的百分比,例如,使用首选软件绘制为从0°到360°的玫瑰图。
注:为了获得统计显著性的结果,建议对任何蛋室阶段的五到十个独立蛋室进行分析。
2. 组织规模
注:要解剖和图像体外培养的果蝇卵室,请遵循补充文件2中的规程。要分析获取的 TTL,请继续执行以下协议。随附的TlMs测试文件被放置在补充文件3中。
- 弯曲上皮组织的选择性表面提取
注意：该协议允许用户在一段时间内选择性地提取一层弯曲的上皮组织中的肌黄素。此协议步骤是用户友好的,基于直观的图形界面。可以舒适地分析(提取表面)几个 TTLM。补充文件 3)作为测试 TLM 示例。- 打开最新的斐济应用程序 (斐济>帮助>更新>应用更改>确定)。
- 确保安装椭圆形曲面投影插件15。跟随维克托利诺娃等人。16.
- 打开 TLM,然后通过单击插件> BigDataViewer >将当前图像导出为 XML/HDF5 文件将其导出为 XML/HDF5 文件。
注:需要定义导出路径。保存本身可能需要几分钟时间,并且取决于 TLM 长度。 - 单击"插件">BigDataViewer >椭圆曲面投影>选择 XML文件,在椭圆体曲面投影中打开导出的文件。
注:将出现一个包含蛋室凹陷视图的新窗口和一个对话框,用于指导用户完成处理过程。有关如何在切片视图中导航的详细信息,请参阅https://imagej.net/BigDataViewer。 - 称为卵巢投影的对话框窗口具有多个选项卡。在第一个对话框选项卡称为"边界"框中,定义 TLM 中蛋室的 x 和 y 边框以及边界框的 z 宽度(即 z 堆栈/蛋室的深度)和按组(图5A)。
- 要定义边框,请拖动 x、y 和 z 旁边的按钮,或在 x、y 和 z 框中定义数字坐标。确保边界足够宽大,使鸡蛋的感兴趣部分进入表面提取。蛋室的选定部分以粉红色突出显示。
- 切换到名为"在窗口卵巢投影中查找blob"的选项卡。定义西格玛和最小峰值;然后,按计算以识别actomyosin信号(图5B),该信号将显示为绿色斑点。使用不同的参数重试此步骤,直到找到足够的点(大约 100 个)。
注:Sigma 1_u20123 具有最小峰值 20\u2012100,最能识别阶段 6 到 -8 个蛋室的 actomyosin 信号。识别肌苷信号是一个关键步骤,取决于信号质量及其大小。确认现有 blob 的正确大小非常重要。图像中没有可见的绿点/斑点表示下一步将不起作用。浏览选定的 z 平面以查看 blob。 - 要设计椭圆体,请继续使用名为"拟合椭圆体"的选项卡。将随机样本设置为 10,000,将外部/内部截止距离设置为 1\u201210,然后单击"计算"(图 5C)。
注:截止距离越低,所需的椭圆体就越精确。在此之后,称为投影的选项卡将自动打开并允许定义曲面提取。需要优化设置。 - 继续使用名为"投影"的选项卡 (图 5D)。设置最小和最大的投影距离(即所需椭圆体的宽度)。需要设置最小和最大的投影距离,以便粉红色定义的椭圆体区域包括蛋室的整个外部层。定义切片距离(建议 1)。
注:图 6A,C 显示了导致错误和最佳投影参数的错误和最佳椭圆拟合的示例。利息的薄圆周层可以在以后定义。在按下计算之前,请确保在蛋室上定义宽度的椭圆体的粉红色区域可见。重要的是,所需的椭圆体(粉红色单线)很好地适合蛋室的椭圆体表面,以获得最佳结果。如果椭圆体拟合不好,请安排不同的设置,直到获得所需的表面提取。- 设置椭圆体的输出宽度 (+800) 和高度 (+400)。设置应创建曲面提取的时间点(即定义 TLM 提取的长度)。选择球形投影或圆柱投影。翻转 Z 并对齐 Y(如果需要)。
- 按计算以获取称为Image的新窗口中两个通道的表面提取。通过单击"图像>调整>亮度/对比度",调整获得的图像窗口的亮度和对比度,以便能够看到投影的actomyosin信号。
注:图 6B,D显示了由不正确和最佳椭圆体拟合产生的投影的示例比较。
- 如果表面提取看起来不错,请将图像(两个通道分开)另存为 .tiff。此外,保存日志窗口文件,以供将来参考如何提取此特定蛋室的表面。
注:如果提取的薄层应返回到其原始展开形状(仅适用于开发人员),则此信息尤其重要。 - 在斐济将通道与首选颜色代码合并。
注:如有必要,投影选定的 z 堆栈层,并带有 actomyosin 信号。在 TLM 中,当采集焦点随时间而略有变化时,需要投影选定的 z 堆栈图层。为获得最佳效果,最多投影一到两个 z 堆栈层。 - 将结果另存为 .tiff 文件。
注:代表肌蛋白II(MRLC::GFP)信号的薄层(选择性基底和表层)的代表性示例,来自对照体和脂肪2突变卵室的卵泡上皮信号,如图8所示。
- 选择性提取组织表面的数据处理
- 漂白剂校正 TTL,以补偿荧光标签的强度衰减。
- 打开斐济。使用文件>打开打开 打开 TLM(例如,从补充文件 3中打开 TestMovie2_extraction.tif)。选择要打开的图像。
- 拆分颜色通道,并在必要时通过单击"图像>颜色>拆分通道"将其转换为 16 位图像。使用图像>类型> 16 位将通道转换为 16 位图像(从 32 位图像)。
- 使用Image >调整>漂白校正>简单比率>背景强度 0.0. 在两个通道上执行漂白校正。
注:如果得到的结果不理想,则需要探索此插件中哪种校正方法最适合(例如,使用直方图匹配而不是简单比率)。 - 通过单击"图像>颜色>合并通道"来合并两个漂白校正图像中的通道。单击"文件>另存为> Tiff",将合并的图像另存为 .tiff 文件。
注:如果需要,调整通道的对比度和亮度。
- 用于生成 TTLM 的细胞掩码的细胞分段
- 如果斐济尚未打开,请重新打开它(并通过单击"帮助>更新>应用更改>确定"来确保它是最新的 )。
- 如果尚未这样做,请下载宏组织细胞分类电影.ijm(http://adm.irbbarcelona.org/matlab/TissueCellSegmentMovie.ijm)。
- 将此脚本拖放到斐济。打开漂白校正文件(例如,来自补充文件 3的 TestMovie2_漂白剂.tif,另请参阅 2.2.1)。
- 通过单击图像>颜色>拆分通道来拆分漂白校正文件的通道。通过单击"图像>调整>亮度/对比度"来调整膜通道以确保清晰的细胞轮廓。
- 通过按打开脚本中的"运行"图标,在所选 TLM 的活动细胞膜通道上运行上载的脚本。将高斯模糊设置为1.500。将细胞检测灵敏度设置为 -1并单击"确定"。将使用 40x 物镜获得的 TTL的估计噪声容差设置为 +8,然后单击"确定"。
注:为了获得一个不错的单元格掩码,不要更改上面的这些参数。对于其他目标,可能需要不同的参数。清洁 TLM 中的背景时,所需的估计噪声容差较低。 - 生成的细胞掩码出现在分析的TLM中,也出现在一个名为粒子堆栈(G)的新窗口中。此外,将显示一个名为"需要操作"的小窗口。从 TLM 上的细胞掩码中,只关注 TLM 中心的细胞,并选择能够在整个 TLM 中提供完整且定义明确的轮廓的细胞。
- 如果所选单元格包含人工/额外单元格轮廓,请使用名为 TLM 中所需的操作的合并工具窗口。对于后者,请按照窗口中的说明进行操作。
注:确保细胞轮廓定义明确,并与 TLM 中的实际细胞膜相对应,因为任何不精确都可能影响后续分析。其他调整和更改(如删除不需要的单元格)稍后可以使用 Surface 管理器工具完成(在下面的教程中概述)。 - 当中心中的选定单元格与实际细胞膜完全对应时,将粒子堆栈另存为 .tiff 文件,在文件>另存为> Tiff之后。继续执行生成细胞掩膜的加载和曲面管理器中的 actomyosin 分析,如前面在第 1.1.3 节和第 1.2 节中执行的(第 2.2.3 节和第 2.3 节也对此进行了详细说明)。
- 将生成的单元格掩码加载到曲面管理器
- 如果使用的表面管理器插件已安装在斐济设置中,则继续执行步骤 2。如果没有,跟随维克托利诺娃等人16。对于开发人员,只有源代码也可用15。
- 单击"插件">分段>曲面管理器(3D))打开曲面管理器。
注:Surface 管理器窗口在右侧显示多个操作按钮,在左侧显示一个空窗口。要查看所有操作按钮,可能需要以高度/宽度拉伸窗口。请注意,时间范围将显示为 z 切片。 - 通过文件>打开并选择要打开的图像(例如,从补充文件 3中创建粒子堆栈2.tif)将相应的粒子堆栈.tif 文件打开到曲面管理器中。
- 在 Surface 管理器中,单击"读取大纲"图像按钮并将 Jacquard 索引设置为 60%。
注:加载粒子堆栈.tif 文件可能需要几分钟时间,具体取决于计算机的电源。 - 加载后,每个单元格都将分配一个 S 编号,并将显示在 Surface 管理器窗口的左侧部分(图 7A)。
注:要显示所有单元格的轮廓和单元格名称,请在 Surface 管理器窗口底部选中"显示所有"和"显示标签"复选框。建议在检查单元格编号的正确性后使用此功能。 - 单击第一个 S 编号;从粒子堆栈.tif 导入的单元格轮廓显示在 TLM 上。在整个 TLM 中检查每个导入的 S 编号的单元格轮廓质量,并删除显示不正确的单元格轮廓的不需要的单元格。为此,请突出显示单元格轮廓并单击"删除"按钮。
注:还可以纠正不精确的单元格轮廓并添加新的单元格轮廓。讨论部分对此进行了介绍。 - 按"保存到磁盘"按钮,将所有更正的单元格另存为 RoiSet.zip 文件。
注:如果需要中断会话,可以稍后将 RoiSet.zip 文件加载到 Surface 管理器中:通过文件>打开并在斐济打开 TLM 并选择TLM。开放曲面管理器如下所示:插件>分段>曲面管理器(3D)通过单击"从光盘加载"按钮并选择适当的 RoiSet.zip 文件(例如,TestMovie2_RoiSet.zip),加载相应的 RoiSet.zip。仔细检查加载的单元格掩码是否与加载的 TLM 相对应。
- 漂白剂校正 TTL,以补偿荧光标签的强度衰减。
- 表面管理器中肌苷脉冲的分析
注:打开斐济并确保在 Surface 管理器中打开 TLM 及其相应的单元格掩膜。确保斐济已安装并处于最新状态,并安装了 Surface 管理器插件 (https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager)。- 打开具有文件>打开的 TLM 并选择要打开的 TLM(例如,TestMovie2_漂白剂.tif)。通过插件加载曲面管理器插件 >分段>曲面管理器(3D)。在此处加载教程中创建的保存的单元格掩码(例如,粒子堆栈2.tif),通过文件>打开并选择单元格掩码(例如,粒子堆栈2.tif)。加载相应的 ROI(例如,TestMovie2_RoiSet.zip)。
- 切换到所选 TLM 中感兴趣的通道。
注:要区分通道,请遵循 TLM 周围指示的颜色代码。 - 在 Surface 管理器中,单击"统计信息"按钮以获取名为"平均灰色值按切片"的窗口(图 7B)。请注意,将随时间显示给定分析通道内给定分析通道中的 actomyosin 信号的平均值/中值强度值,以及与细胞面积和细胞形状相关的其他参数。
注:强度值在 A.U.;细胞面积以像素为单位,需要转换为方形微米。 - 将获取的值另存为电子表格文件:单击"统计信息"窗口,文件>另存为。
注:以后可以验证获得的统计值,如下所示。在斐济打开漂白剂校正的 TLM。打开曲面管理器。通过按"从磁盘加载"按钮将相应的 RoiSet.zip 加载到 TLM 并打开文件。将上载包含单元格轮廓的保存蒙版,单元格的名称将显示在左侧 Surface 管理器窗口中。单击"统计信息"按钮查看统计信息值。
注:关于单个亚细胞肌苷信号的手动分析,不可能在组织尺度上对亚细胞肌苷信号进行手动分析。如讨论部分所述,在半组织尺度上分析单个肌苷信号需要优化。
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Representative Results
该协议使科学家能够研究上皮组织中阿托米辛网络的行为。只有当对局部细胞规模(少数细胞)的肌肌苷行为进行详细分析与组织规模(许多细胞)的类似分析相结合时,才可能。然而,上皮组织往往是弯曲的,提取这些组织的薄层以前不容易,如果蝇卵室(图1所示)。此处提供的协议为用户提供了简单的说明,说明如何在这两个尺度下分析肌苷行为(图2)。
该协议的第一部分侧重于有关使用Surface 管理器插件分析 actomyosin 脉冲的说明(图 3)。它还描述了如何在本地细胞规模下手动分析单个肌苷行为(图4)。该协议的第二部分解释了如何使用椭圆体表面投影插件提取一层薄薄的上皮组织(图5和图6)。只有这样,才有可能使用表面管理器插件(图7)在组织尺度上分析肌苷脉冲。代表性的结果和在旋转控制和静态脂肪2突变果蝇卵室在局部细胞和组织规模中的actomyosin行为的比较,如图8和相应的电影1所示。影片2、电影3、电影4、电影 5和影片6(详情请参见图 8)。
图1:选择性地提取一层曲面的薄层。(A) 为了获得关于圆周弯曲上皮中actomyosin网络的充分信息,有必要在大多数可见组织上获取深z-堆栈(粉红色),如弯曲的卵泡上皮(灰色)所示果蝇卵室。(A')然而,这种z堆栈的简单投影导致整个肌酸网络在卵泡细胞中混合。用MRLC::GFP(绿色)可视化的肌苷II显示卵泡细胞在如此z投影中强烈表达的内(表)区域,并且几乎没有来自基底(外部)侧的信息,其中Myosin II显示一个强大的平面细胞极性表型,但其信号强度低12。为了避免像面板A'所示这样的混合,我们开发了一个用户友好的、基于斐济的插件,称为 BigDataViewer18中的Ellipsoid 表面投影,允许 (B) 选择性地提取定义的薄层(粉红色)( ) 从弯曲的上皮 (B') 的 actomyosin ( ) 所示为 Myosin II (绿色) 在卵泡上皮的基底(外部)侧的选择提取。比较组A'和B'中肌苷 II (MRLC::GFP) 的信号差异。注意组B'中的 Myosin II 的平面极化模式。单元格轮廓为红色。前侧在左边。比例尺 = 50 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:平面极化肌苷网络在局部细胞和组织尺度。不同尺度的actomyosin成像允许分析不同数量的上皮细胞,即(A)在局部细胞规模下多达15个细胞,在培养的卵泡上皮组织尺度上分析50-100个细胞果蝇卵室。非肌肉肌苷II用MRLC::GFP(绿色)可视化,所用转基因线的基因型在材料表中指定。细胞轮廓在品红色。前侧在左边。刻度条 = 5 μm (A);50 μm (B)。请点击此处查看此图的较大版本。
图3:局部细胞尺度表面管理器中肌苷II脉冲分析的例子。(A) 粒子堆栈加载到曲面管理器中.请注意,TLM 中的所有标识单元格都显示在 Surface 管理器窗口中。删除整个 TLM 中的所有不需要或不完整的单元格非常重要。(B) 在选定单元格的 Myosin II (MRLC::GFP) 上获得的统计信息显示在名为"曲面管理器中按切片显示的平均灰色值切片"的窗口中。MRLC::GFP显示为绿色,而细胞膜为红色。前侧在左边。请点击此处查看此图的较大版本。
图4:在局部细胞尺度上手动分析单个肌苷II信号的示例。(A) 选定的 30 s 长子影片放置在 (B) 其时间投影旁边.请注意,在时间投影时,Myosin II (MRLC::GFP) 显示单个单元内的轨迹线(参见面板 B)比单个时间帧中长(参见面板A)。应分析细胞中的单个线相对于卵室的前后轴的角方向。(C) 请注意,斐济不测量 0±360°,但对于指向向上的信号仅测量 0±180°,对于指向下部的信号,则仅测量 0±179°。请注意,0° 通常放置在分析图像的右侧。(D) 根据此信息,在特定蛋室中与上皮旋转方向一起移动(以粉红色向上)或对(下)的线应装入其中,以确定分析信号的对称性断开是否存在于细胞,然后用于分析组织中的多个细胞。MRLC::GFP显示为绿色,而细胞膜为红色。前侧在左边。请点击此处查看此图的较大版本。
图5:在组织尺度上生成椭圆体拟合的示例。为了使用 BigDataViewer 中的椭圆形表面投影插件将椭圆体放入蛋室,需要定义 (A) 一个包含大多数扫描组织的边界框。接下来, 识别信号点很重要 (B) 是最佳椭圆体拟合生成的先决条件.(C) 当椭圆体拟合不理想且不很好地包围蛋室时,这会导致 (D) 组织层提取不良.参见图 6中的提取和后续投影结果。请点击此处查看此图的较大版本。
图 6:不正确和最佳椭圆体拟合和相应曲面投影的比较。(A) 当椭圆体未正确安装时, (B) 最终表面投影不会提供分析组织薄层的完整信号数据.(C) 然而,当最佳安装时,它保证对组织中的薄层进行相等的信号检测。(D) 请注意,最佳表面投影包含多个薄层,作为一段时间内表面投影的 z堆栈,随后可以分离,如图8所示。肌苷 II 信号 (MRLC:GFP、 白色) 和膜信号 (白色) 最初在投影之前合并(面板A和C),但在表面投影本身时,这些通道是分开的(参见面板 B 中的 Myosin II 投影和D)。请点击此处查看此图的较大版本。
图7:组织尺度表面管理器中肌苷II脉冲分析的一个示例。(A) 粒子堆栈加载到曲面管理器中.请注意,TLM 中的所有标识单元格都显示在 Surface 管理器窗口中。删除整个 TLM 中的所有不需要或不完整的单元格非常重要。(B) 在 Myosin II (MRLC:GFP) 脉冲(均值或中位数)上获得的统计信息显示在名为"平均灰色值切片(按曲面管理器中的切片)"窗口中。请注意,更强的肌苷 II 点可能会影响内在肌苷 II 强度的最终测量。这是由于这些问题,这些Myosin II点可能似乎迁移超出细胞轮廓,其中有一个不正确的细胞轮廓定义在生成的细胞掩膜。MRLC::GFP显示为绿色,而细胞膜为红色。前侧在顶部。请点击此处查看此图的较大版本。
图 8:在果蝇卵泡上皮的肌苷II网络的代表结果。动态肌苷 II (MRLC:GFP) 行为 (A和B) 在局部细胞规模和 (C-F) 在控制组织和脂肪2突变果蝇卵室的代表性示例.有关已用基因型的详细信息,请参阅材料表。请注意,MRLC::GFP 信号(绿色)垂直于控制蛋室的前后 (AP) 轴移动。这种极性在脂肪2突变的卵室中丢失,并导致各向异性肌苷II脉冲/振荡12。手动分析小型 MRLC::GFP 信号 (±300 μm) 及其角方向运动的量化(如协议所述),可以观察到 MRLC 的对称性断开::GFP 信号可以优先与上皮方向相反在分析的蛋室12(图4)中旋转。相应的影片包括:面板A =影片1、面板B =影片2、面板C =影片3、面板D =影片4、面板E =影片 5和面板F |电影 6.细胞轮廓以品红色显示。前侧在左边。刻度条 = 5 μm (A和B) 和 50 μm (C-F) 。请点击此处查看此图的较大版本。
| 本地蜂窝规模短期高速成像的建议参数: | |||
| Ⅰ。 | 感兴趣的组织可自由放置在培养介质中(即无盖单、柔性毛毯等) | ||
| Ⅱ。 | 63x 水目标,带数值孔径 >= 1.3 | ||
| Ⅲ。 | 倒置共聚焦显微镜 | ||
| Ⅳ。 | 单平面 | ||
| 五。 | 6-12 秒的时间间隔 | ||
| Ⅵ。 | 5-10 分钟 TTL | ||
| Ⅶ。 | 每个 TLM 的数据存储要求高达 100MB | ||
| 组织尺度上长期低速成像的推荐参数: | |||
| Ⅰ。 | 感兴趣的组织可自由放置在培养介质中(即无盖单、柔性毛毯等) | ||
| Ⅱ。 | 40x 水目标和数值孔径 >= 1.3 | ||
| Ⅲ。 | 倒旋转盘显微镜 | ||
| Ⅳ。 | z 堆栈获取蛋室的一半 | ||
| 五。 | 60 秒的时间间隔 | ||
| Ⅵ。 | 至少 30 分钟 TTL | ||
| Ⅶ。 | 数据存储需求约 1GB | ||
表 1:推荐的成像参数。
电影1:肌苷II(MRLC::GFP)在对照果蝇卵室的细胞尺度上代表动态行为。请注意,MRLC::GFP(绿色)倾向于垂直于蛋室的AP轴移动。细胞轮廓在品红色。基础视图。前侧在左边。比例尺 = 5 μm.请点击此处观看此视频。右键单击下载。
电影2:肌苷II的代表性动态行为(MRLC::GFP)在脂肪2突变果蝇卵室的细胞规模。请注意,MRLC::GFP 脉冲(绿色),不再与静态蛋室的 AP 轴垂直的平面对齐。细胞轮廓在品红色。基础视图。前侧在左边。比例尺 = 5 μm.请点击此处观看此视频。右键单击下载。
电影3:基底肌苷II的代表性动态行为(MRLC::GFP)在对照果蝇卵室的组织规模。请注意,只有薄基底(外部)MRLC::GFP层从蛋室几乎一半的卵泡上皮中提取。MRLC::GFP为绿色,细胞轮廓为洋红色。请注意此处获得的 MRLC::GFP 信号行为(表示组织刻度)与Movie 1(表示细胞规模)的详细级别的差异。前侧在左边。比例尺 = 50 μm.请点击此处观看此视频。右键单击下载。
电影 4:基底肌苷II(MRLC::GFP)在脂肪2突变果蝇卵室的组织尺度的代表性动态行为。请注意,MRLC::GFP(绿色)脉冲强在脂肪2突变卵室近一半的卵泡上皮基侧,并且无法产生促进上皮旋转所需的同步力。细胞轮廓在品红色。前侧在左边。比例尺 = 50 μm.请点击此处观看此视频。右键单击下载。
电影 5:在对照果蝇卵室的组织尺度上,杏子素II(MRLC:GFP)的代表性动态行为。只有一个薄的MRLC::GFP层从几乎一半的卵泡上皮的表(内)侧提取。请注意,MRLC::GFP(绿色)显示不同的动态行为,在这里与卵泡上皮的基础侧相比(如电影3所示)。细胞轮廓在品红色。前侧在左边。比例尺 = 50 μm.请点击此处观看此视频。右键单击下载。
电影6:apical肌苷II的代表性动态行为(MRLC::GFP)在脂肪2突变果蝇卵室的组织规模。改变的MRLC的动态行为::GFP(绿色)从静态脂肪2突变卵室近一半的卵泡上皮的薄片区中提取。细胞轮廓在品红色。前侧在左边。比例尺 = 50 μm.请点击此处观看此视频。右键单击下载。
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Discussion
蛋室解剖和培养的关键步骤和故障排除
如果太多的苍蝇被放入一个小瓶中,由于大量喂食幼虫和成年苍蝇被困在苍蝇食物中,苍蝇食物在2~3天后会变浑浊。在这种情况下,将这些苍蝇剩下的放入一个新的小瓶中,加入新鲜食物,并缩小它们的数量。特别是,排除被困在食物中的女性。
施耐德混合物(SM)应提前准备,可在4°C下储存14天。请注意,较旧的混合混合物可能包含会破坏蛋室表面的晶体。始终将 SM 与新鲜添加的胰岛素混合,并留出足够的时间达到室温。这保护卵室免受冷冲击,这可能对微管的生长和细胞骨架的平面对齐产生负面影响(如在发育中的果蝇翼19所示)。
卵室和选定的卵子非常脆弱,由于其体积小,可能漂浮在SMI(带胰岛素的SM中)。建议它们自发沉入 SMI 中。他们还经常坚持解剖钳/仙人掌工具。在这种情况下,让他们通过在 SMI 中轻轻移动它们来释放自己。避免随时直接挤压和触摸它们。如果需要,从进一步协议中排除这些卵子室/卵子。
由于解剖立体镜对于识别受损的卵室/卵子不可靠,应在共聚焦/旋转盘显微镜下使用细胞掩码或FM 4-64染料检查蛋室/卵子。与未损坏的蛋室组织背景相比,受损的蛋室具有极高的着色。切勿获得具有强染料斑块的 TLM。
卵室体外现场成像的关键步骤和故障排除
如果 SMI 中自由放置的卵室仍然移动,请在共聚焦显微镜下再次检查,看看 SMI 中是否还有任何被忽视的肌肉片和碎屑残留。请将其删除,然后重试。在卵室中,90%应在后续成像过程中稳定且不可移动。
为了确保选定的蛋室/卵子稳定,使用高速成像(6秒间隔)1分钟。不稳定的蛋室会在此移动。但是,建议观看整个延时记录,以便能够轻轻地纠正图像蛋室的潜在意外移动。这可以通过移动显微阶段/表,其中持有培养的蛋室/卵子的培养皿,到原始位置,使感兴趣的蛋室再次在图像,聚焦窗口。
如果出现图像蛋室的突然和意外移动,则停止成像。检查显微镜台的缓冲,避免在采集期间在显微镜附近走动,因为这可能导致由于振动而中断图像采集。
如果细胞膜染料在 30 分钟后不可见且使用的激光线正确,则添加更多染料并增加其浓度,以便下次采集。
如果actomyosin信号似乎模糊不清,请检查所使用的目标的NA。低于 1.3 的 NA 会降低成像质量。此外,确保用过的浸入油已正确应用于水63x目标。如有必要,添加或更换它。
如果卵室收缩,观察到的细胞膜变形,请检查盖子是否正确关闭。如果盖子缺失或未正确关闭,则由于 SMI 在采集时间内蒸发,蛋室可能会干涸。
如果蛋室的旋转减慢或停止,降低激光功率。如果蛋室出现一个洞,它被激光烧死。降低激光功率。
如果在TLM采集过程中2分钟后,actomyosin发出漂白信号,则降低激光功率,增加显微镜软件中的信号放大。
一旦获得一个卵泡上皮的TLM,建议避免在这个蛋室的同一组织区域再次成像。然而,当蛋室围绕其AP轴旋转时,在大约30分钟后,有可能使用这种未损坏的蛋室重复获得TLM。在一个卵泡上皮中成像卵泡,即使其他卵室位于同一卵子或 SMI 中的另一个卵子中,也不会漂白/损坏。
如果满足所有这些要求,则成功成像的卵室在阶段 6-8 时应为约 90%-100%,阶段 3-5 应为 50%-60%,第 1~-2 阶段为约 20%-30%。失败主要是由于卵室的移动或在其解剖/操作过程中损坏。
数据处理的关键步骤和故障排除
在斐济使用提供的脚本生成掩膜期间,可能会发生许多生成的细胞轮廓,这些轮廓不反映 TLM 中的实际细胞膜。这通常是由高背景噪声引起的,特别是当使用染料染色细胞膜时。在这种情况下,为了避免在生成的掩码中对不需要的单元格轮廓进行繁琐的校正,请再次运行分段并将参数设置为最佳拟合。这可以通过调整估计噪声容差参数来实现。
将包含单元格轮廓的一个 ParticleStack.tif 文件加载到 Surface 管理器中时,加载时间会随单元格轮廓的数量线性缩放,并且可能需要几分钟时间。如果加载中断或不正确,请重复。确保上载窗口处于焦点状态,并且未使用其他程序。
有时,需要在某些帧中更正单元格轮廓;在这种情况下,请使用"画笔"按钮。通过将鼠标拖动到细胞膜周围,在一个特定帧中绘制正确的细胞轮廓。移动到 TLM 的不同帧,然后,通过更正返回到时间范围:现在应该替换不正确的单元格轮廓。然后,再次转到下一帧以更正该帧。"画笔"工具现在将切换到擦除模式。如有必要,通过按下现有单元格轮廓,然后按+Add按钮创建新单元格轮廓,在下一个时间范围内更正轮廓。从 Surface 管理器窗口中删除旧 S 编号,并根据需要按"重命名"按钮重命名新单元格轮廓。
如果在整个 TLM 中缺少整个重要单元格,请按"取消选择>多边形"创建新的蒙版轮廓。通过点击细胞膜,在 TLM 的第一帧中创建新的细胞轮廓。然后,转到 TLM 的最后一帧,然后对所选单元格执行相同的操作。通过及时运行影片 , 单元格轮廓将值。如有必要,使用"画笔"工具进行更正。完成后,按+Add按钮,然后按"重命名"按钮重命名单元格轮廓。创建新单元格轮廓的点/单击越多,插值效果越好。
除了上皮旋转外,TTLM 有时还受到不需要的运动的影响。因此,建议纠正这些TTLM中的此类组织漂移。通过这样做,子圈也得到矫正,用于卵室的上皮旋转,细胞膜变得僵硬。这使得人工分析的肌苷信号更容易。然而,这种方法不允许科学家区分观察到的acmyosin信号是移动还是相对于细胞膜是静态的。如果对actomyosin信号的静态运动和主动运动加以区分是这种分析的目标,则不应应用组织漂移校正。我们发现,大多数actomyosin信号相对于细胞膜主动移动,只有一小部分出现静态。
分析亚细胞肌苷信号的关键步骤和故障排除
如果生成的统计信息包含异常值,请确保相对于整个数据集的任何极低值或高值都真正反映单元格中的行为,而不是工件。这可以通过识别包含异常值的单元格,并在测量低值/高值时检查细胞轮廓质量来实现。通常,这种极值是由错误测量另一个单元格的一部分的有缺陷的单元格轮廓造成的。当大斑点干扰相邻单元格的单元格轮廓时,这可能特别明显。在这种情况下,纠正细胞轮廓并重复测量至关重要。
为了使量化更容易,分析特定细胞表面的信号,并逐个继续,直到子电影中分析所有细胞。人工分析亚细胞肌苷信号的结果可能不会显示一个细胞和一个特定卵室的对称性断裂。我们体验到,在旋转的卵室(阶段6-8)中,丙突蛋白不会明显打破与组织运动相对对称性。这个百分比在阶段412时增加。我们还发现,在识别蛋室12中actomyosin信号运动的首选方向时,分析5分钟或10分钟没有区别。
从弯曲组织选择性地提取丙曲核苷信号的关键步骤和故障排除
blob 的大小错误(标识的信号)不会导致任何 blob,程序将在下一步中冻结。在这种情况下,强制退出斐济和新重新启动插件椭圆体表面投影。当程序在按"计算"后没有反应时,也执行相同的操作。这通常表示已选择不合适的参数。
如果有太多的斑点和/如果它们集中在分析的蛋室的一侧,这可能会影响设计的椭圆体,并且不能为蛋室提供正确的拟合。返回 blob 标识,并尝试将其大小与蛋室的 x 轴、y 轴和 z 轴选择组合排列。当使用不合适的截止距离设置时,也经常出现生成良好椭圆体拟合的失败。
获得的投影有时可能看起来聚焦不当,或者获得的 z 平面实际上在靠近蛋室表面的细胞层之间移动。这通常是一个不太合身的椭圆体的标志,其中椭圆体的一个区域设置得离蛋室太远。尝试拟合椭圆体,使其与蛋室周长保持相同的距离。
方法的局限性和新方法
这种卵室的自由培养省略了蛋室表面的微妙扁平化。为此,此方法有其优点和缺点。当使用共聚焦显微镜时,它为用户提供高分辨率和高速成像,可靠地发现在蛋室周长细胞中的肌苷行为,时间很短(5~10分钟)。但是,通过这样做,它限制了单个平面的大小,该平面可以随时间随时间随时间进行共聚焦显微镜成像。一般来说,在6-8阶段,每个卵室可以成像多达15个细胞,但在第1~5阶段,在卵室中只有大约两个细胞。因此,我们在这里将此方法定义为仅适用于本地蜂窝规模。
为了克服由单个共聚焦平面的有限尺寸造成的这些尺寸限制,我们开发了一种基于斐济的替代方法,称为椭圆体表面投影,用于组织规模。这结合了旋转盘显微镜与半互动表面提取的卵室在组织规模。通过这种方式,可以从一个分析的卵室中同时获得超过50~100个细胞的actomyosin信号。请务必注意,此方法生成获取的数据(+gba 字节)的非常大的数据集,具有较低的分辨率(它使用 40 倍与 63x 目标),并且还提供较慢的成像速度(扫描蛋湛的一半组织需要 60 sber [阶段 6[8],因此,它比有限的共聚焦平面方法慢 10 倍)。
与从参数化表面提取分层投影的其他现有软件相比,为该协议开发的插件侧重于在流程的每一步都使用方便和交互式视觉反馈。其他工具,如陈等人使用的基于MATLAB的ImSaNE20,侧重于处理各种参数化和非参数化表面模型和各种投影方法。例如,ImSaNE 要求以特定方式对数据进行预处理和对齐,部分要求中间步骤的外部工具。相反,此处提供的插件可处理可在斐济打开的任何 3D/4D/5D 图像(序列),无需外部预处理。虽然 ImSaNE 通过编辑 MATLAB 脚本具有高度可配置(可编程)功能,但我们在一个工作流中提供了针对此处讨论的具体问题量身定制的最小选项集。交互式工作流的每个步骤都提供结果,必要时可立即进行目视检查和调整。
关于这些成像方法中哪一种(局部细胞或组织规模)最适合特定实验,则完全取决于要回答的科学问题(即分辨率高与低;短与长采集时间)。这两种尺度之间的一个很好的折衷方案是结合这两种方法,从而在半组织尺度(即20-30个细胞)上获得actomyosin信号的成像。这需要旋转盘显微镜、带 NA ±1.3 的水 63x 透镜,以及为蛋室的 20-30 个细胞建立 z 堆栈设置。这种较浅的 z 堆栈(与采集一半蛋室所需的 z 堆栈不同)允许更快地扫描 60 s 以下。此处获得的时间可用于重复 z 堆栈采集以加快成像速度,也可以用于单个 z 堆栈之间的样品恢复(时间交相)。使用后者,可以延长旋转蛋室的 TlMs 采集时间(>30 分钟)。这种半组织方法保证在较长时间内同时对肌苷信号和更多细胞进行成像具有足够的分辨率。
未来的应用和愿景
两种描述的方法(在局部细胞和组织规模)提供了一种简单和低成本的方法(不包括显微镜设备),对actomyosin网络的副作用有限,并可以实施和容易地用于其他解剖动物组织。这里唯一的先决条件是培养皿中现有的培养方案,用于感兴趣的弯曲组织、可用的转基因、标记或标记方法。
结合光片荧光显微镜22,也可以在toto中成像actomyosin机械(即,同时成像果蝇卵室的完整外圆表面,然后随后使用插件椭圆体表面提取展开 。然而,在适应高速成像的actomyosin信号方面,有一些限制需要解决,即1)将卵室嵌入低点熔化的角质或它们在成像过程中粘在毛细管上;ii) 二用水镜的低数值孔径,不能提供足够的肌苷信号分辨率;iii) 获得多个角度的蛋室所需的额外时间,这阻止了高速成像。
为此,可以预见,随着显微镜参数(如通过上皮组织的扫描速度的优化)和所用显微镜片的改进,对actomyosin机械的详细分析将在未来实现承诺在组织上获得高分辨率的结果,并在长时间内进行缩放。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者非常感谢米里亚姆·奥斯特菲尔德使用塞莱斯特·伯格实验室4采用的方法分享她对卵子室体外生命成像的建议。我们还感谢塞巴斯蒂安·托西的斐济脚本,使细胞分割。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Schneider Medium | Gibco | 21720-024 | [+]-Glutamine |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | [+] 10.000 Units/mL Penicillin [+] 10.000 µg/mL Streptomycin |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F135 | Heat inactivated |
| Insulin Solution Human | Sigma | I9278 | |
| 50 mL Falcon tubes | Eppendorf | sterile | |
| Millex-GV filter | Millipore | SLGV033NS | 33 mm |
| Glass Bottom Microwell Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | 35 mm Petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 cover glass |
| Forceps | A. Dumont & Fils | #55 | |
| CellMask Deep Red (cell membrane dye) | Invitrogen | C10046 | |
| FM4-64 (cell membrane dye) | ThermoFisher/Invitrogen | T13320 | |
| Depression dissection slide | Fisher Scientific | 12-560B | |
| Microscopic equipment | |||
| Steromicroscope | e.g. Zeiss | Stemi SV 6 | |
| Inverted confocal microscope | e.g. Zeiss/Olympus | ||
| Spinning disc microscope | e.g. Zeiss/Andor | ||
| Microscopic glass/cover glass | e.g. Thermo Scientific/Menzel Glas | ||
| Cactus tool | |||
| Wironit needle holder | Hammacher | 9160020 | |
| Cactus spine | Echinocactus grusonii/barrel cactus | ||
| Drosophila stocks used in the manuscript | |||
| AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP | For detail see Rauzi et al.: Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodeling. Nature 2010, Vol. 468, pg. 1110-1115. | ||
| AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP; fat258D/fat2103C | For detail see Viktorinova et al.: Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations. PLoS Genetics 2017, Vol. 13, Issue 11, pg. e1007107. |
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