Analys av Actomyosin dynamik på lokala cellulära och vävnad skalor med hjälp av Time-lapse filmer av odlade Drosophila ägg kammare

Summary

Detta protokoll ger en Fiji-baserade, användarvänlig metod tillsammans med enkla instruktioner som förklarar hur man tillförlitligt analysera aktomyosin beteende i enskilda celler och böjda epitelial vävnader. Inga programmeringskunskaper krävs för att följa handledningen; alla steg utförs på ett semi-interaktivt sätt med hjälp av det grafiska användargränssnittet för Fiji och tillhörande insticksprogram.

Abstract

Drosophila omogna ägg kallas ägg kammare, och deras struktur liknar primitiva organ som genomgår morfologiska förändringar från en runda till en ellipsoid form under utvecklingen. Denna utvecklingsprocess kallas oogenes och är avgörande för att generera funktionella mogna ägg för att säkra nästa fluga generation. Av dessa skäl har Egg Chambers fungerat som en idealisk och relevant modell för att förstå utvecklingen av djurens organ.

Flera in vitro-culturingprotokoll har utvecklats, men det finns flera nackdelar med dessa protokoll. En innebär tillämpning av olika omslag som utövar ett konstgjort tryck på avbildade ägg kammare för att immobilisera dem och öka den avbildade förvärvs plan av omkretsriktningen ytan av de analyserade ägg kamrarna. Ett sådant tillvägagångssätt kan negativt påverka beteendet hos den tunna aktomyosin maskiner som genererar kraften att rotera ägg kammare runt deras längre axel.

Således, för att övervinna denna begränsning, vi kultur Drosophila ägg kammare fritt i medierna för att tillförlitligt analysera aktomyosin maskiner längs omkretsen av ägg kammare. I den första delen av protokollet, ger vi en manual som beskriver hur man analyserar aktomyosin maskiner i ett begränsat anskaffnings plan på den lokala cellulära skalan (upp till 15 celler). I den andra delen av protokollet, vi förse användare med en ny Fiji-baserade plugin som gör det enkelt utvinning av ett definierat tunt skikt av ägget kamrarna omkretsriktningen yta. Följande protokoll beskriver sedan hur man analyserar aktomyosin signaler på vävnads skalan (> 50 celler). Slutligen, vi precisera begränsningarna av dessa metoder på både lokala cellulära och vävnads skalor och diskutera dess potentiella framtida utveckling och möjliga tillämpningar.

Introduction

Den ständiga utvecklingen av nya avbildnings-och programvaruteknologier med tillämpningar inom Life Sciences har gett en enorm inverkan på förståelsen av livets grundläggande principer. En av de största utmaningarna är den pålitliga visualiseringen av utvecklingsprocesser i kombination med deras levande avbildning i olika vävnader. Vävnader är delar av organ och organ och, som sådan, majoriteten är inte lätt tillgängliga för avbildning. Därför har protokoll som gör att deras dissektion och in vitro-odling har utvecklats för att visualisera biologiska händelser som i tillräcklig utsträckning återspeglar den in vivo situationen inom en levande kropp.

Under de senaste decennierna har odling och levande avbildning av Drosophila ägg kammare, acinar-liknande strukturer som liknar primitiva organ, bidragit oerhört till förståelsen av de grundläggande principerna för primitiv orgel utveckling^{1 , 2 , 3}. för närvarande finns det flera odlings protokoll tillgängliga, och deras användning beror på förvärvs tid, celltyp som ska avbildas, och deras tillgänglighet (t. ex. inre köns cells kontra yttre somatisk linje)⁴.

Ett vanligt inslag i alla dessa odlings protokoll är behovet av immobilisering av analyserade ägg kammare som visar en hög kontraktila aktivitet i flytande media. Den kontraktila aktiviteten av ägg kammare orsakas främst av muskeln arket som täcker en lång rad anslutna ägg kammare^5,6,7. Därför, för att uppnå korrekt immobilisering av unga ägg kammare, olika metoder har utvecklats, som omfattar täcker ägg kammare med täckglas^6,8,9 eller flexibla filtar^{4, 10} eller bädda in dem i låg-smältande-punkt aguppstod^3,11. Dessa metoder är populära eftersom de också tillåter avbildning av ett större visuellt plan på grund av den subtila tillplattning av omkretsriktningen ytan av ägget kamrarna.

Emellertid, nyligen, det har visat sig att unga ägg kammare (etapp 1-8) rotera runt deras främre-posterior axel⁶ och att denna vävnad rörelse drivs av en fin aktomyosin nätverk nära omkretsriktningen ytan av dessa unga ägg kammare ¹². därför kan konstgjord förändring av den cellulära ytan orsakad av en subtil tillplattning av denna vävnad ha en negativ inverkan på beteendet hos den kraft som genererar aktomyosin maskiner. Den kontrapunkt är att om ägget kammaren vävnad inte är tillplattad, mikroskopisk avbildning av proteiner på omkretsriktningen ytan av ägg kammare blir ännu mer begränsad av den minskade storleken på förvärvet planet.

Därför har vi kombinerat protokoll från Prasad et al.⁹ och labbet i Celeste berg^4,10 och ytterligare modifierade dem så att ingen täckslip/flexibel filt/aguppstod används i den utvecklade metoden. Drosophila ägg kammare är fritt odlade i media och det protokoll som presenteras här gäller endast inverterad mikroskopi. Det finns två delar i protokollet. Den första delen är inriktad på analys av aktomyosin signaler på den lokala cellulära skalan (upp till 15 celler) inom ägg kammare. I den andra delen fokuserar vi på att övervinna de begränsningar som är förknippade med ett litet förvärvs plan som orsakas av fri odling av ägg kammare. I detta avseende har vi utvecklat en roman Fiji-baserad beräkningsmetod med ett semi-interaktivt grafiskt användargränssnitt som selektivt extraherar och vecklar ut definierade skikt av en omkrets vävnad yta. Detta följs av ett protokoll som beskriver hur man analyserar aktomyosin på vävnads skalan (dvs > 50 celler). Eftersom selektiv extraktion av ett definierat tunt skikt av böjda epitelvävnader inte har varit lätt möjligt med hjälp av en klassisk z-stack projektion (figur 1), denna lättanvända metod fungerar som en viktig förutsättning för att på ett heltäckande sätt förstå beteende av en tunn (< 1 μm) aktomyosin nätverk på vävnads skalan i Drosophila ägg kammare.

Dessutom, för att underlätta protokollet, ger vi exempel på Time-lapse filmer (TLMs) och exempelfiler av Fluorescent taggade nonmuscle konventionella myosin II beteende (se kompletterande fil 3). Myosin II är ett motor protein och representerar den aktiva kontraktila delen av aktomyosin maskiner. För att bild myosin II, använder vi Drosophila transgena linjer som innehåller en modifierad regel ljus kedja av myosin II kallas mrlc:: GFP (se tabell över material för detaljer)^12,13. För att visualisera cellmembran, är protokollet baserat på kommersiella färgämnen (se tabell över material). Detta protokoll lämpar sig inte bara för analys av små subcellulära mrlc:: GFP signaler¹² men också för alla liknande stora subcellulära partiklar runt ± 300 μm, såsom de som observerats med Life-Act:: GFP^12,14.

Även om båda dessa protokoll presenteras med hjälp av in vitro odlade Drosophila ägg kammare, kan förvärvet av aktomyosin signaler också utföras med hjälp av andra vävnader på optimering av odlingsmedier och beroende på tillgängligheten av antingen Fluorescent märkta proteiner med motsvarande kommersiella färgämnen eller, till exempel, mRNA mikroinjektioner för att få övergående genuttrycksprofiler. På samma sätt kan det Fiji-baserade protokollet för utvinning av ett tunt lager från en omkretsriktningen yta appliceras mer allmänt på ellipsoid och orgel-liknande vävnader.

Protocol

Anmärkning: Följande protokoll innehåller instruktioner om hur man analyserar aktomyosin på den lokala cellulära och vävnad skalan i Drosophila Egg Chambers. Den lokala skalan tillåter användare att analysera detaljerade aktomyosin beteende i upp till 15 celler per ägg kammare och kräver förvärv av tlms för en kort tidsperiod (5 – 10 min) med hjälp av höghastighets avbildning och en inverterad konfokal Mikroskop. I kontrast, vävnad skalan ger användare med aktomyosin information i 50 – 100 celler och kräver förvärv av tlms under en lång tid (≥ 30 min) med hjälp av låg hastighet Imaging och en inverterad spinning Disc Mikroskop (se figur 2 och rekommenderade parametrar i varje skala i tabell 1). Det beslut i vilket skala för att analysera aktomyosin signaler helt beror på användarens vetenskapliga fråga. Åtföljda test TLMs bör bidra till att fatta detta beslut.

1. lokala cellulära skala (LCS)

Anmärkning: För att dissekera och bild in vitro odlade Drosophila ägg kammare, följ protokollet som beskrivs i kompletterande fil 1. Om du vill analysera förvärvade TLMs, fortsätter du med följande protokoll. Länkar till medföljande testfiler av TLMs finns i tilläggsfilen 3.

1. Data behandling av TLMs på den lokala cellulära skalan (LCS)
   1. Blekmedel korrigering av TLMs för att kompensera för intensitet förfall av fluorescerande etiketter
      1. Se till att en up-to-date Fiji ansökan är installerad på datorn som används genom att följa dessa instruktioner: Fiji > öppna en TLM (t. ex. TestMovie1. tif från tilläggsfilen 3).
      2. Dela färgkanalerna genom att klicka på bild > färg > delade kanaler.
      3. Utför en blekmedel korrigering på båda kanalerna med hjälp av bild > Justera > blekmedel korrigering ≫ enkelt förhållande > bakgrundsintensitet 0,0.
         Anmärkning: Om otillfredsställande resultat erhålls, utforska vilka korrigeringsmetoder i denna plugin passar bäst (t. ex. använda histogram matchning istället för ett enkelt förhållande).
   2. Cellsegmentering för att generera en cellmask för TLMs
      1. Om Fiji inte redan är öppet, öppna det igen (och se till att det är uppdaterat) följande hjälp > Uppdatera ≫ tillämpa ändringar > OK.
      2. Om detta inte redan är gjort, Ladda ner makrot TissueCellSegmentMovie. IJM (från http://adm.irbbarcelona.org/MATLAB/TissueCellSegmentMovie.IJM). Dra och släpp detta skript i Fiji.
      3. Öppna filen Bleach-korrigerad TLM. TIFF (se avsnitt 1.1.1). Dela kanalerna i blek-korrigerade filen med hjälp av bild > färg > dela kanaler.
      4. Kör det uppladdade skriptet på den aktiva cellmembran kanalen för den valda TLM genom att trycka på ikonen Kör i det öppna skriptet. Ange Gaussisk oskärpa till 2,500 och cell detekterings känsligheten till -1 och klicka på OK. För att få en fin cellmask, ändra inte dessa parametrar ovan. Ange den uppskattade brus toleransen mellan 10 – 20 för TLMs som förvärvats med målet 63x och klicka på OK.
         Anmärkning: För andra mål kan olika parametrar krävas. Renare bakgrunden i en TLM, krävs den lägre uppskattade brus toleransen .
      5. En genererad cellmask visas i den analyserade TLM och även i ett nytt fönster som kallas Particlestack (G), och dessutom ett litet fönster som heter åtgärd krävs visas. Från cell masken på TLM, fokusera bara på celler i mitten av TLM och välj de som kan ge kompletta och väldefinierade konturer i hela TLM.
      6. Om markerade celler innehåller konstgjorda/extra cell kon turer använder du verktyget sammanfoga verktyg som kallas åtgärd som krävs i TLM. För den senare, följ instruktionerna i fönstret.
         Anmärkning: Se till att cell konturer är väldefinierade och motsvarar verkliga cellmembran i en TLM som någon inexaktheter kan påverka efterföljande analyser. Ytterligare tweaks och förändringar, såsom avlägsnande av oönskade celler, kan göras senare med hjälp av verktyget Surface Manager (beskrivs i avsnitt 1.1.3).
      7. När de valda cellerna i mitten fint motsvarar den verkliga cellmembranen, spara ParticleStack som en TIFF-fil följande fil ≫ Spara som > TIFF.
   3. Inläsning av den genererade cell masken till Surface Manager
      1. Installera Surface Manager plugin¹⁵ i den begagnade Fiji setup. Följ instruktionerna från Viktorinova et al.¹⁶.
      2. Öppna Surface Manager med hjälp av insticks program ≫ segmentering ≫ Surface Manager (3D).
         Anmärkning: I fönstret Surface Manager visas flera åtgärdsknappar till höger och ett tomt fönster till vänster. Om du vill visa alla åtgärdsknappar kan det krävas att fönstret sträcks ut i höjd/bredd. Observera att tidsramar visas som z-segment.
      3. Öppna motsvarande ParticleStack. TIFF-fil i Surface Manager genom att klicka på arkiv > Öppna och välj den bild som ska öppnas (t. ex. ParticlesStack1. tif).
      4. I Surface Manager klickar du på knappen Läs kon tur bild och anger Jacquard-indexet till 60%.
         Anmärkning: Inläsning av filen ParticlesStack1. tif kan ta upp till flera minuter, beroende på datorns processorkraft.
      5. När den är laddad tilldelas varje cell ett S-nummer och visas i den vänstra delen av Ythanterarens fönster.
         Anmärkning: Om du vill visa konturer och cell namn för alla celler markerar du kryssrutorna Visa alla och Visa etiketter längst ned i fönstret för Surface Manager. Det rekommenderas att använda denna funktion när cellnumren har kontrollerats för deras riktighet.
      6. Klicka på det första S-numret; den importerade cell konturerna från ParticlesStack1. tif visas på TLM. Kontrollera varje importerat S-nummer för cell kon tur kvalitet i hela TLM och ta bort oönskade celler som visar felaktiga cell konturer. Om du vill göra det markerar du cell dispositionen och klickar på knappen ta bort.
         Anmärkning: Det är också möjligt att korrigera för oprecisa cell konturer och lägga till nya cell konturer. Detta beskrivs i diskussionsavsnittet.
      7. Spara alla korrigerade celler som en RoiSet. zip-fil genom att trycka på knappen Spara till disk .
         Anmärkning: Om sessionen behöver avbrytas är det möjligt att läsa in RoiSet-filen i Surface Manager senare: öppna en TLM i Fiji (file > Open) och välj en TLM. Öppna Surface Manager via insticks program ≫ segmentering ≫ Surface Manager (3D). Ladda motsvarande RoiSet. zip-fil genom att klicka på knappen Ladda från skiva och välja lämplig roiset. zip-fil. Dubbelkolla att de laddade cellmasker motsvarar den laddade TLM.
   4. Korrigering för vävnads drift i TLMs
      Anmärkning: Under TLMs förvärvs tid, kan drift effekter observeras på grund av epitelial rotation eller en oönskad rörelse. I båda fallen rekommenderar vi att korrigera för alla drift för att förenkla den manuella aktomyosin analys senare. Drift korrigering krävs endast för manuell aktomyosin analys. Denna handledning kräver up-to-date Fiji programvara med MultiStackReg plugin (https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#multistackreg) installerat.
      1. Öppna blekmedel korrigerade TLM i Fiji via fil > Öppna och välj den bleka-korrigerade filen som skapats med hjälp av handledningen som nämns ovan.
      2. Dela upp kanalerna och välj den som identifierar cellmembranen via bild > färg > delade kanaler.
      3. Använd följande protokoll när cell konturerna inte är synligt släta: Process > filter > Gaussian Blur. Ställ in den på ~ 1 – 2 för en 63x mål och klicka på OK och sedan Ja. Klick förlopp > binär > omvänd till mask användande försummelsen infattningarna; Klicka sedan på OK.
      4. Ladda MultiStackReg plugin efter Plugins > registrering > multistackreg.
      5. Kontrollera att stack 1 är inställt på cellmembran kanalen, åtgärd 1 är inställd på Justera och omvandling är inställd på översättning. Markera kryssrutan Spara omvandlings fil och klicka sedan på OK.
      6. Öppna den valda TLM, den MultiStackReg plugin, och den sparade Transformation fil med hjälp av filen > öppen och välj en TLM. Dela färgkanalerna med bild > färg > delade kanaler.
      7. Ladda MultiStackReg plugin genom att klicka Plugins > registrering > multistackreg. Välj Ladda transformeringsfil som åtgärd 1.
      8. Lämna omvandling som styv kropp och klicka på OK. Markera den tidigare sparade omvandlings filen och klicka på OK igen.
      9. Sammanfoga bild kanalerna och spara den registrerade TLM som en TIFF-fil följande bild > färg > sammanfoga kanaler. Spara filen genom att klicka på arkiv ≫ Spara som > TIFF.
         Anmärkning: Det finns alternativa sätt att korrigera för en vävnad glida i Fiji, nämligen via Plugins > registrering ≫ stackreg/correct 3D drift.
2. Analys av aktomyosin pulser i Surface Manager på LCS
   Anmärkning: Detta protokoll steg gör det möjligt för forskare att identifiera om aktomyosin pulser finns i den analyserade vävnaden och att förstå det detaljerade beteendet samt riktningen av aktomyosin signaler.
   1. Öppna Fiji och se till att en TLM och dess motsvarande cell mask är öppen i Surface Manager.
      Anmärkning: Se till att Fiji är installerat och uppdaterat och att Surface Manager-insticksprogrammet är installerat (steg 1.1.3.1).
   2. Öppna en TLM med fil > Öppna och välj en TLM att öppna (t. ex. TestMovie1_bleach. tif). Ladda Surface Manager-insticksprogrammet via insticks program ≫ segmentering ≫ Surface Manager (3D). Ladda den sparade cellmask som skapats i handledningen här (t. ex. ParticlesStack1. tif) via fil > Öppna och välj en cellmask (t. ex. ParticlesStack1. tif). Läs in motsvarande intresseområde (ROI, t. ex. TestMovie1_RoiSet. zip). Se diagram 3a.
   3. Växla till den kanal som intresserar dig för vald TLM.
      Anmärkning: För att skilja kanalerna, följ den färgkod som anges runt TLM.
   4. I Surface Manager klickar du på statistik knappen för att få fönstret Genomsnittligt grått värde segment per segment (figur 3b). Observera att medelvärdet/medianvärdet för actomyosinsignaler i en given analyserad kanal inom de definierade cell konturerna över tid kommer att visas, liksom andra parametrar relaterade till cellområdet och cell formen.
      Anmärkning: Intensitetsvärdena finns i arbitraty-enheter (A.U.). cellområdet är i pixlar och måste konverteras till kvadratiska mikrometrar.
   5. Spara de erhållna värdena som en kalkylbladsfil. Klicka på statistikfönstret, fil ≫ Spara som.
      Anmärkning: Det är möjligt att kontrollera erhållna statistiska värden senare enligt följande: öppna den bleka-korrigerade TLM i Fiji och öppna Surface Manager. Ladda motsvarande RoiSet. zip till TLM genom att trycka på knappen Ladda från disk och öppna filen. Den sparade masken med cell kon turer kommer att överföras och namnen på cellerna visas i det vänstra fönstret i Surface Manager. Klicka på statistik knappen för statistiska värden.
3. Manuell analys av enskilda subcellulära aktomyosin signaler vid LCS
   Anmärkning: Detta protokoll kräver mest koncentration och är tidskrävande. I allmänhet, en förvärvad TLM kan bekvämt analyseras inom 1 dag. Detta inkluderar inte tid för flyga förberedelse innan deras dissektion, dissektion själv, och bild förvärv.
   1. Öppna en vald, blekmedel korrigerade och registrerade (drift-korrigerade) TLM i en up-to-date Fiji ansökan. Använd en blek-korrigerad och drivkorrigerad TLM (t. ex. TestMovie1_bleach_reg. tif) som ett test exempel.
   2. Justera ljusstyrka och kontrast för att se enskilda aktomyosin signaler med hjälp av bild > Justera > ljusstyrka/kontrast.
   3. Justera TLMs i samma riktning i förhållande till vävnaden/kropps axeln. När det gäller ägg kammare, rikta den främre sidan av ägget kamrarna alltid till vänster om bilden/submovie/TLM före analysen.
   4. Dela upp den valda filmen i korta 30 s submovies och Time-projekt var och en av dem. Spara icke-tidsprojicerade och tidprojicerade under filmer med motsvarande namn. Behåll originalkällan.
      Anmärkning: Submovies kan skapas från original TLMs genom att först ta bort oönskade ramar via bild ≫ stackar > slice Remover. Definiera de segment som ska tas bort och ange inkrement. Omvandla till RGB innan du använder segment borttagningsprogrammet när du ökar = 1. Om du vill tidsprojicera en 30-underfilm klickar du på bild > staplar > Z-projekt > Max intensitet för de definierade bildrutorna (segment) och klickar sedan på OK. Hoppa över varannan 30 s submovie för att undvika att räkna aktomyosin signaler 2x i två efterföljande 30 s submovies.
   5. Placera en tids projicerad bild bredvid motsvarande 30-under film (figur 4a, B). Identifiera signallinjen på den tidprojicerade under filmen. Identifiera riktningen för aktomyosin signal rörelse (0 °-360 °) längs denna linje i den ursprungliga under filmen genom att manuellt spela under filmen. Använd vinkel verktyget (i Fiji bar) för att manuellt mäta riktningen på signal rörelsen i förhållande till den definierade vävnads axeln eller ett liknande tillgängligt verktyg.
      Anmärkning: Fiji arbetar endast på en skala 0 ° – 180 ° (figur 4c), och en omräkning av de erhållna värdena till en skala på 0 ° – 360 ° krävs. En signalera fodrar motsvarar till trajectoryen av en aktomyosin signalerar rörelse över tid.
   6. För att undvika dubbelarbete i analysen av actomyosinsignaler, markera de analyserade signal linjerna i cellerna i den tidprojicerade under filmen (figur 4b, D).
   7. Analysera alla valda celler i 30 s submovie och spara de erhållna vinklar.
      Anmärkning: Analysera endast subcellulära cytoplasmiska aktomyosin signaler i celler med väldefinierade cell konturer i hela en TLM. Utesluta enskilda celler med mindre än 15 – 20 upptäckta signaler i hela TLM. Ignorera aktomyosin signaler som rör sig över celler på grund av deras okända ursprung. Ett exempel på signal räknas för en analyserad cell i 30 s submovie visas i figur 4D.
   8. Fortsätt tills alla 30 s-långa submovies av en TLM analyseras, och spara alla uppmätta vinklar av aktomyosin signaler av en TLM i en kalkylbladsfil.
   9. Summera alla uppmätta vinklar över det relevanta antalet TLMs (beroende på experimentet). Rita den procentuella andelen av riktningen analyserade aktomyosin signaler, till exempel, som ett steg diagram med ett intervall från 0 ° till 360 ° med en föredragen programvara.
      Anmärkning: För att få statistiskt signifikanta resultat rekommenderas fem till tio oberoende ägg kammare i varje ägg kammare skede att analyseras.

2. vävnads skalan

Anmärkning: Att dissekera och bild in vitro odlade Drosophila ägg kammare, följ protokollet i kompletterande fil 2. För att analysera förvärvade TLMs, Fortsätt med följande protokoll nedan. Medföljande testfiler för TLMs placeras i tilläggsfilen 3.

1. Selektiv ytutvinning av böjda epitelvävnader
   Observera:Detta protokoll tillåter användare att selektivt extrahera ett tunt lager av aktomyosin i en böjd epitelial vävnad över tiden. Detta protokoll steg är användarvänligt och baserat på ett intuitivt grafiskt gränssnitt. Det är möjligt att bekvämt analysera (extrahera yta) flera TLMs. Använd TestMovie2. CZI (frånKompletterande fil 3) som ett test TLM-exempel.
   1. Öppna ett uppdaterat Fiji-program (fiji > hjälp ≫ Uppdatera > tillämpa ändringar > OK).
   2. Kontrollera att ellipsoid Surface Projection plugin¹⁵ är installerad. Följ Viktorinova et al. ¹⁶.
   3. Öppen en TLM och exportera den så en XML/HDF5 arkivera vid klickande plugg ≫ bigdataviewer > Exportera ström bild så XML/hdf5 arkivera.
      Anmärkning: Det krävs för att definiera en exportsökväg. Räddningen sig själv kanna ta flera minuterna och berott på det TLM längd.
   4. Öppna den exporterade filen i ellipsoid yta projektion genom att klicka på Plugins ≫ bigdataviewer ≫ ellipsoid yta projektion > Välj XML-fil.
      Anmärkning: Ett nytt fönster med sagittal vyer av ägget kammaren och en dialogruta för att vägleda användaren genom behandlingen kommer att visas. Information om hur du navigerar i segmentvyn finns på https://imagej.net/BigDataViewer.
   5. Dialogen fönster alarmerat Ovarierar projekteringen har flera tabs. I den första dialogrutan som kallas begränsningsram, definiera x-och y-kanterna på en ägg kammare i TLM tillsammans med markeringsrutans z-bredd (dvs. djupet på en z-stack/ägg kammare) och tryck på set (figur 5a).
   6. Om du vill definiera kantlinjer drar du knapparna bredvid x, y och z eller anger nummerkoordinaterna i rutorna x, y och z. Se till att gränserna är generösa nog att få den del av ägget kammaren av intresse i ytan utvinning. De utvalda delarna av ägg kammaren är markerade i rosa.
   7. Växla till fliken som heter hitta blobbar i fönstret äggstockar projektion. Definiera Sigma och Minimal Peak Value; Tryck sedan på Compute för att identifiera aktomyosin-signalerna (Figur 5b), som visas som gröna blobbar. Försök det här steget med olika parametrar tills det finns tillräckligt många punkter (cirka 100).
      Anmärkning: Sigma 1 \ u20123 med minimal Peak Value 20 \ u2012100 fungerar bäst att identifiera aktomyosin signaler av Stage-6 till-8 ägg kammare. Identifiera aktomyosin signaler är ett viktigt steg och beror på signalkvaliteten och dess storlek. Det är viktigt att bekräfta rätt storlek på befintliga blobbar. Inga synliga gröna fläckar/blobbar i bilden innebär att nästa steg inte kommer att fungera. Bläddra igenom de valda z-planen för att se blobbar.
   8. Om du vill designa ellipsoid fortsätter du med fliken Anpassa ellipsoid. Ställ in slumpmässiga exempel på 10 000, utanför/innanför cut-off avstånd till 1 \ u201210, och klicka sedan på Compute (figur 5c).
      Anmärkning: Ju lägre cut-off avstånd, desto mer exakt önskad ellipsoid kommer att vara. Efter detta öppnas fliken projektion automatiskt och tillåter definitionen av ytan utvinning. Inställningarna måste optimeras.
   9. Fortsätt vidare med fliken projektion (bild 5D). Ställ in ett minsta och högsta projektionsavstånd (d.v.s. bredden på önskad ellipsoid). Det är obligatoriskt att ställa in ett minimalt och maximalt projektionsavstånd så att det rosa definierade ellipsoid-området omfattar hela det yttre lagret av ägg kammaren. Definiera segment avståndet (1 rekommenderas).
      Anmärkning: Exempel på felaktig och optimal ellipsoid-anpassning som resulterar i felaktiga och optimala projektionsparametrar visas i figur 6a, C. Det tunna omkretsriktningen lagrar av intressera kan definieras mer sistnämnd. Se till att den rosa regionen av ellipsoid med den definierade bredden på ägg kammaren är synlig innan du trycker på Compute. Det är viktigt att den önskade ellipsoid (rosa enkelrad) passar fint ellipsoid ytan av en ägg kammare för att få bästa resultat. Om ellipsoid Fit inte är bra, ordna olika inställningar tills önskad yta extraktion erhålls.
      1. Ange en utmatnings bredd (≥ 800) och höjd (≥ 400) för ellipsoid. Ställ in från vilken tidpunkt som tidspunkten ytan utvinning ska skapas (dvs definiera längden på TLM utvinning). Välj antingen en sfärisk eller en cylindrisk projektion. Vänd Z och justera Y om det behövs.
      2. Tryck på Compute för att få en Surface-extraktion för båda kanalerna i nya fönster som kallas image. Justera ljusstyrkan och kontrasten i de erhållna bild Fönstren för att kunna se de projicerade actomyosinsignalerna, genom att klicka på bild > Justera ≫ ljusstyrka/kontrast.
         Anmärkning: En exempel jämförelse av en projektion till följd av en felaktig och optimal ellipsoid-anpassning visas i figur 6B, D.
   10. Om Surface-extraktionen ser bra ut sparar du bilderna (båda kanalerna separat) som. TIFF. Dessutom Spara loggfönstret filen för framtida referens om hur ytan av denna särskilda ägg kammare extraherades.
       Anmärkning: Detta är särskilt viktig information om det extraherade tunna skiktet ska returneras till sin ursprungliga ovikt form (endast för utvecklare).
   11. Sammanfoga kanalerna med en önskad färgkod i Fiji.
       Anmärkning: Om det behövs, projekt utvalda z-stack skikt med aktomyosin signaler. Projektionen av valda z-stack skikt krävs när förvärvet fokus något förändras över tid i en TLM. För bästa resultat, projekt högst en till två z-stack lager.
   12. Spara resultaten som TIFF-filer.
       Anmärkning: Representativa exempel på tunna skikt (selektiv basal och apikal yta) som representerar myosin II (MRLC:: GFP) signal från follikeln epitel av kontroll och fat2 Mutant ägg kammare finns i figur 8.
2. Data behandling av en selektivt utdragen vävnadsyta
   1. Blekmedel-korrigera TLMs för att kompensera för intensitet förfall av fluorescerande etiketter.
      1. Öppna Fiji. Öppna en TLM (t. ex. TestMovie2_extraction. tif från tilläggsfilen 3) med File > Open. Välj bilden för att öppna den.
      2. Dela upp färgkanalerna och konvertera dem till 16-bitarsbilder, om det behövs, genom att klicka på bild > färg > delade kanaler. Konvertera kanalerna till 16-bitarsbilder (från 32-bitarsbilder) med hjälp av bild > typ > 16-bitars.
      3. Utför en blekmedel korrigering på båda kanalerna med hjälp av bild > Justera > blekmedel korrigering ≫ enkelt förhållande > bakgrundsintensitet 0,0.
         Anmärkning: Om otillfredsställande resultat erhålls, är det nödvändigt att undersöka vilka korrigeringsmetoder i denna plugin passar bäst (t. ex. använda histogram matchning istället för ett enkelt förhållande).
      4. Sammanfoga kanalerna från de två bleka korrigerade bilderna genom att klicka på bild > färg > sammanfoga kanaler. Spara den sammanfogade bilden som en TIFF-fil genom att klicka på arkiv ≫ Spara som > TIFF.
         Anmärkning: Justera kontrasten och ljusstyrkan för kanalerna om det behövs.
   2. Cellsegmentering för att generera en cellmask för TLMs
      1. Om Fiji inte redan är öppet öppnar du det igen (och ser till att det är uppdaterat genom att klicka på hjälp > Uppdatera ≫ tillämpa ändringar > OK).
      2. Om detta inte redan är gjort, Ladda ner makrot TissueCellSegmentMovie. IJM (http://adm.irbbarcelona.org/matlab/TissueCellSegmentMovie.ijm).
      3. Dra och släpp detta skript i Fiji. Öppna den bleka-korrigerade filen (t. ex. TestMovie2_bleach. tif från tilläggsfilen 3, se även 2.2.1).
      4. Dela kanalerna i blek-korrigerade filen genom att klicka på bild > färg > dela kanaler. Justera membran kanalen för att säkerställa tydliga cell konturer genom att klicka på bild > Justera ≫ ljusstyrka/kontrast.
      5. Kör det uppladdade skriptet på den aktiva cellmembran kanalen för den valda TLM genom att trycka på ikonen Kör i det öppna skriptet. Ställ Gaussian Blur till 1,500. Ange känslighet för cell avkänning till-1 och klicka på OK. Ange uppskattad brus tolerans till ~ 8 för tlms som förvärvats med 40x-målet och klicka på OK.
         Anmärkning: För att få en fin cellmask, ändra inte dessa parametrar ovan. För andra mål kan olika parametrar krävas. Renare bakgrunden i en TLM, krävs den lägre uppskattade brus toleransen .
      6. En genererad cellmask visas i den analyserade TLM och även i ett nytt fönster som kallas Particlestack (G). Dessutom visas ett litet fönster som heter åtgärd krävs . Från cell masken på TLM, fokusera bara på celler i mitten av TLM och välj de som kan ge kompletta och väldefinierade konturer i hela TLM.
      7. Om markerade celler innehåller konstgjorda/extra cell kon turer använder du verktyget sammanfoga verktyg som kallas åtgärd som krävs i TLM. För den senare, följ instruktionerna i fönstret.
         Anmärkning: Se till att cell konturer är väldefinierade och motsvarar verkliga cellmembran i en TLM som någon inexaktheter kan påverka efterföljande analyser. Ytterligare tweaks och förändringar, såsom avlägsnande av oönskade celler, kan göras senare med hjälp av verktyget Surface Manager (beskrivs i handledningen nedan).
      8. När valda celler i mitten fint motsvarar den verkliga cellmembranen, spara ParticleStack som en TIFF-fil följande fil ≫ Spara som > TIFF. Fortsätt att utföra lastning av den genererade cell masken och aktomyosin-analysen i Surface Manager som tidigare utförts i avsnitten 1.1.3 och 1,2 (beskrivs också i detalj i avsnitten 2.2.3 och 2,3).
   3. Inläsning av den genererade cell masken till Surface Manager
      1. Om Surface Manager-insticksprogrammet redan är installerat i Fiji-installationen som används går du vidare till steg 2. Om inte, följ Viktorinova et al.¹⁶. För utvecklare, bara källkoden finns också¹⁵.
      2. Öppna Surface Manager genom att klicka på insticks program ≫ segmentering ≫ Surface Manager (3D).
         Anmärkning: I fönstret Surface Manager visas flera åtgärdsknappar till höger och ett tomt fönster till vänster. Om du vill visa alla åtgärdsknappar kan det krävas att fönstret sträcks ut i höjd/bredd. Observera att tidsramar visas som z-segment.
      3. Öppna motsvarande ParticleStack. tif-fil i Surface Manager via fil > Öppna och välj den bild som ska öppnas (t. ex. ParticleStack2. tif från tilläggsfilen 3).
      4. I Surface Manager klickar du på knappen Läs kon tur bild och anger Jacquard-indexet till 60%.
         Anmärkning: Det kan ta upp till flera minuter att läsa in en ParticleStack. tif-fil, beroende på datorns strömförsörjning.
      5. När den har laddats kommer varje cell att tilldelas med ett S-nummer och visas i den vänstra delen av Ythanterarens fönster (figur 7a).
         Anmärkning: Om du vill visa konturer och cell namn för alla celler markerar du kryssrutorna Visa alla och Visa etiketter längst ned i fönstret för Surface Manager. Det rekommenderas att använda denna funktion när cellnumren har kontrollerats för deras riktighet.
      6. Klicka på det första S-numret; den importerade cell dispositionen från ParticleStack. tif visas på TLM. Kontrollera varje importerat S-nummer för cell kon tur kvalitet i hela TLM och ta bort oönskade celler som visar felaktiga cell konturer. Om du vill göra det markerar du cell dispositionen och klickar på knappen ta bort.
         Anmärkning: Det är också möjligt att korrigera för oprecisa cell konturer och lägga till nya cell konturer. Detta beskrivs i diskussionsavsnittet.
      7. Spara alla korrigerade celler som en RoiSet. zip-fil genom att trycka på knappen Spara till disk .
         Anmärkning: Om sessionen behöver avbrytas är det möjligt att läsa in filen RoiSet. zip i Surface Manager senare: öppna en TLM i Fiji via fil > Öppna och välj en TLM. Öppna Surface Manager på följande sätt: insticks program ≫ segmentering ≫ Surface Manager (3D). Ladda motsvarande RoiSet. zip genom att klicka på knappen Ladda från skiva och välja lämplig roiset. zip-fil (t. ex. TestMovie2_RoiSet. zip). Dubbelkolla att de laddade cellmasker motsvarar den laddade TLM.
3. Analys av aktomyosin pulser i Surface Manager
   Anmärkning: Öppna Fiji och se till att en TLM och dess motsvarande cell mask är öppen i Surface Manager. Se till att Fiji är installerat och uppdaterat och att Surface Manager-pluginprogrammet (https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager) är installerat.
   1. Öppna en TLM med fil > Öppna och välj en TLM att öppna (t. ex. TestMovie2_bleach. tif). Ladda Surface Manager-insticksprogrammet via insticks program ≫ segmentering ≫ Surface Manager (3D). Ladda den sparade cellmask som skapats i handledningen här (t. ex. ParticlesStack2. tif) via fil > Öppna och välj en cellmask (t. ex. ParticlesStack2. tif). Ladda motsvarande ROI (t. ex. TestMovie2_RoiSet. zip).
   2. Växla till den kanal som intresserar dig för vald TLM.
      Anmärkning: För att skilja mellan kanalerna, följ den färgkod som anges runt TLM.
   3. I Surface Manager klickar du på statistik knappen för att få fönstret Genomsnittligt grått värde segment per segment (figur 7b). Observera att medelvärdet/medianvärdet för actomyosinsignaler i en given analyserad kanal inom de definierade cell konturerna över tid kommer att visas, liksom andra parametrar relaterade till cellområdet och cell formen.
      Anmärkning: Intensitetsvärdena finns i A.U.; cellområdet är i pixlar och måste konverteras till kvadratiska mikrometrar.
   4. Spara de erhållna värdena som en kalkylbladsfil: Klicka på statistikfönstret, fil ≫ Spara som.
      Anmärkning: Det är möjligt att kontrollera de erhållna statistiska värdena senare, enligt följande. Öppna blekmedel korrigerade TLM i Fiji. Öppna Surface Manager. Ladda motsvarande RoiSet. zip till TLM genom att trycka på knappen Ladda från disk och öppna filen. Den sparade masken med cell kon turer kommer att överföras och namnen på cellerna visas i det vänstra fönstret i Surface Manager. Klicka på statistik knappen för statistiska värden.
      Anmärkning: När det gäller en manuell analys av enskilda subcellulära aktomyosin signaler, är det inte möjligt att utföra en manuell analys av subcellulära aktomyosin signaler på vävnads skalan. Optimering krävs för analys av enskilda aktomyosin signaler vid semi-vävnad skala, som framhålls i diskussionsavsnittet.

Representative Results

Detta protokoll gör det möjligt för forskare att undersöka beteendet hos aktomyosin nätverk i epitelial vävnader. Detta är endast möjligt när en detaljerad analys av aktomyosin beteende på den lokala cellulära skalan (några celler) kombineras med en liknande analys på vävnads skalan (många celler). Emellertid, epitelial vävnader är ofta böjda och utvinning av ett tunt skikt av dessa vävnader var tidigare inte lätt möjligt, som visas i Drosophila ägg kammare (figur 1). Protokollet presenteras här ger användare med enkla instruktioner som beskriver hur man analyserar aktomyosin beteende på båda dessa skalor (figur 2).

Den första delen av detta protokoll fokuserar på instruktioner om analys av aktomyosin pulser med hjälp av Surface Manager -insticksprogrammet (figur 3). Det beskriver också hur man manuellt analysera enskilda aktomyosin beteende på den lokala cellulära skalan (figur 4). Den andra delen av detta protokoll förklarar hur man extraherar ett tunt skikt av epitelial vävnad med hjälp av ellipsoid Surface Projection plugin (figur 5 och figur 6). Först då är det möjligt att analysera aktomyosin pulser på vävnads skalan med hjälp av Surface Manager -insticksprogrammet (figur 7). Representativa resultat och en jämförelse av aktomyosin beteende i roterande kontroll och statisk fat2 Mutant Drosophila ägg kammare på lokal cell-och vävnads skalan visas i figur 8 och i motsvarande film 1, Film 2, Movie 3, Movie 4, Movie 5och film 6 (för detaljer, se figur 8).

Figur 1: selektiv extraktion av ett tunt skikt av en böjd vävnadsyta. (A) för att få tillräcklig information om aktomyosin nätverk i circumferellt böjda epitelier, är det nödvändigt att förvärva en djup z-stack (rosa) över majoriteten av en synlig vävnad som visas för böjda follikelepitel (grå) av Drosophila ägg kammare. (A) Men en enkel projektion av en sådan z-stacken leder till blandning av hela aktomyosin nätverk i follikelceller. Myosin II visualiseras med MRLC:: GFP (grön) visar starkt uttrycker inre (apikala) regionen follikelceller i en sådan z-projektion och nästan ingen information från basal (yttre) sida, där myosin II visar en stark planar cell polaritet fenotyp, men dess signalintensiteten är låg¹². För att undvika sådan blandning som visas i panel A ', vi har utvecklat en användarvänlig, Fiji-baserade plugin kallas ellipsoid yta projektion i bigdataviewer¹⁸ som tillåter (B) selektiv extraktion av ett definierat, tunt skikt (rosa ) av aktomyosin från en böjd epitel (B ') som visas för myosin II (grön) i en utvald extraktion av den basala (yttre) sidan av follikelepitelet. Jämför skillnaden i signal av myosin II (MRLC:: GFP) i panelerna A ' och B '. Notera det plana polariserade mönstret av myosin II i panel B '. Cell konturerna är i rött. Den främre sidan är till vänster. Scale bar = 50 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: planar polariserade aktomyosin nätverk på den lokala cellulära och vävnad skalor. Avbildning av aktomyosin vid olika skalor gör det möjligt att analysera olika antal epitelceller, nämligen (a) upp till 15 celler på den lokala cellulära skalan och (B) 50-100 celler på vävnads skalan i follikeln epitel av odlade Drosophila ägg kammare. Nonmuscle myosin II visualiseras med MRLC:: GFP (grön) och genotyp av den använda transgena linjen anges i tabellen av material. Cell konturerna är i magenta. Den främre sidan är till vänster. Skalstreck = 5 μm (A); 50 μm (B). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: ett exempel på analys av myosin II pulser i Surface Manager på den lokala cell skalan. (A) en partikel stack läses in i Surface Manager. Observera att alla identifierade celler i TLM visas i Ythanterarens fönster. Det är viktigt att ta bort alla oönskade eller ofullständiga celler i en TLM. (B) statistik som erhållits på MYOSIN II (mrlc:: GFP) för valda celler visas i fönstret Genomsnittligt grått värde segment för segment i Surface Manager. MRLC:: GFP visas i grönt medan cellmembranen är i rött. Den främre sidan är till vänster. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4: ett exempel på den manuella analysen av enskilda myosin II-signaler på den lokala cellulära skalan. (A) en utvald 30 s-lång under film placeras bredvid (B) dess tidprojektion. Observera att vid tidprojektion, myosin II (MRLC:: GFP) visar längre bollbana linjer (se panel B) inom enskilda celler än i en individuell tidsram (se panel A). Enskilda linjer i celler bör analyseras för deras vinkel riktning i förhållande till den främre-bakre axeln av ägget kamrarna. (C) notera att Fiji inte mäter 0 ° – 360 ° utan endast 0 ° – 180 ° för signaler som pekar uppåt och 0 ° – 179 ° för signaler som pekar nedåt. Tänk på att 0 ° är atypiskt placerad till höger om en analyserad bild. (D) baserat på denna information, linjer som rör sig med (upp i rosa) eller mot (i gult) riktningen för epitelial rotation i en viss ägg kammare bör papperskorgen att identifiera om symmetri bryta av analyserade signaler finns inom en cell och sedan för flera celler i den analyserade vävnaden. MRLC:: GFP visas i grönt medan cellmembranen är i rött. Den främre sidan är till vänster. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5: ett exempel på att generera en ellipsoid passar på vävnads skalan. För att passa en ellipsoid på ett ägg kammare med hjälp av ellipsoid ytan projektion plugin i BigDataViewer, är det nödvändigt att definiera (a) en begränsningsram som innehåller majoriteten av den skannade vävnaden. Därefter är det viktigt (B) att identifiera signal punkter, som är en förutsättning för en optimal ellipsoid Fit generation. (C) när ellipsoid passform är inte optimalt och inte fint omger en ägg kammare, detta resulterar i (D) dålig vävnad skikt utvinning. Se extraheringen och senare projektionsresultat i figur 6. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6: jämförelse av en felaktig och optimal ellipsoid passform och motsvarande ytprojektioner. (A) när ellipsoid inte är korrekt monterad, (B) den slutliga ytan projektion kommer inte att ge kompletta signal data i det tunna skiktet av den analyserade vävnaden. (C) när den monteras optimalt garanterar den en likvärdig signaldetektering av ett tunt skikt i vävnaden. (D) Observera att den optimala ytprojektionen innehåller flera tunna skikt som en ytprojicerad z-stack över tiden, som kan separeras därefter som visas i figur 8. Myosin II-signalerna (MRLC:: GFP, White) och membran signaler (vita) sammanfogas initialt före projektionen (panelerna A och C), men på själva ytprojiceringen separeras dessa kanaler (se prognoser för myosin II i paneler B och D). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 7: ett exempel på analys av myosin II pulser i ytan chef på vävnads skalan. (A) en partikel stack läses in i Surface Manager. Observera att alla identifierade celler i TLM visas i Ythanterarens fönster. Det är viktigt att ta bort alla oönskade eller ofullständiga celler i en TLM. (B) statistik som erhålls på MYOSIN II (mrlc:: GFP) pulser (medelvärde eller median) för valda celler över tid visas i fönstret Genomsnittligt grått värde segment per segment i Surface Manager. Observera att starkare myosin II prickar kan påverka det slutliga måttet av inneboende myosin II intensitet. Detta beror på problemet att dessa myosin II-punkter kan visas för att migrera bortom cell konturerna där det finns en felaktig cell dispositions definition i den genererade cell masken. MRLC:: GFP visas i grönt medan cellmembranen är i rött. Den främre sidan är på toppen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 8: Representativa resultat av en myosin II nätverk i Drosophila follikelepitel. Representativa exempel på dynamiska myosin II (mrlc:: GFP) beteende (a och B) på den lokala cellulära skalan och (C-F) på vävnaden skala för kontroll och fat2 Mutant Drosophila ägg kammare. Se tabell över material för detaljerad information om begagnade genotyper. Observera att MRLC:: GFP signaler (grön) flytta vinkelrätt mot främre-bakre (AP) Axel kontroll ägg kammare. Denna polaritet går förlorad i fat2 Mutant ägg kammare och leder till Anisotrop MYOSIN II pulser/svängningar¹². Vid manuell analys av små MRLC:: GFP signaler (~ 300 μm) och kvantifiering av deras vinkel riktade rörelse som beskrivs i protokollet, symmetri bryta av MRLC:: GFP signaler kan observeras med en preferens mot riktningen av epitelial en analyserad ägg kammare¹² (figur 4). Motsvarande filmer är: panel A = film 1, panel B = film 2, panel C = film 3, panel D = film 4, panel E = film 5, och panel F = Film 6. Cell konturerna visas i magenta. Den främre sidan är till vänster. Skalstreck = 5 μm (A och B) och 50 μm (C-F). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Rekommenderade parametrar för kort tids fotografering med hög hastighet på den lokala cell skalan:
I.	Vävnad av intresse fritt placerad i odlingsmediet (dvs. inga täckhalvor, flexibla filtar, etc.)
Ii.	63x vatten mål med numerisk bländare > = 1,3
Iii.	Inverterat konfokala Mikroskop
Iv.	Enda plan
V.	6-12 s tidsintervall
Vi.	5-10 minuter TLMs
Vii.	Data lagringskrav per TLM upp till 100MB
Rekommenderade parametrar för lång tid låg hastighet Imaging på vävnads skalan:
I.	Vävnad av intresse fritt placerad i odlingsmediet (dvs. inga täckhalvor, flexibla filtar, etc.)
Ii.	40x vatten mål och numerisk bländare > = 1,3
Iii.	Inverterad snurrande skiva Mikroskop
Iv.	z-stackar för att förvärva ca. hälften av en ägg kammare
V.	60 s tidsintervall
Vi.	Minst 30 minuter TLMs
Vii.	Krav för data lagring ca. 1GB

Tabell 1: rekommenderade avbildnings parametrar.

Film 1: representativt dynamiskt beteende av myosin II (MRLC:: GFP) på cell skalan i en kontroll Drosophila Egg Chamber. Observera att MRLC:: GFP (grön) föredrar att flytta vinkelrät mot AP-axeln av ägg kamrarna. Cell konturerna är i magenta. Basala vyn. Den främre sidan är till vänster. Scale bar = 5 μm. vänligen klicka här för att se denna video. Högerklicka för att ladda ned.

Film 2: representativa dynamiska beteendet hos myosin II (MRLC:: GFP) på cell skalan i en Fat2 Mutant Drosophila Egg Chamber. Observera att MRLC:: GFP pulser (grön) och är inte längre planar justerad vinkelrätt mot AP-axeln av statiska äggkamrar. Cell konturerna är i magenta. Basala vyn. Den främre sidan är till vänster. Scale bar = 5 μm. vänligen klicka här för att se denna video. Högerklicka för att ladda ned.

Film 3: representativa dynamiskt beteende av basal myosin II (MRLC:: GFP) på vävnads skalan i en kontroll Drosophila ägg kammare. Observera att endast en tunn basal (yttre) MRLC:: GFP skiktet utvinns från nästan hälften av follikeln epitel av en ägg kammare. MRLC:: GFP är i grönt och cell konturerna är i magenta. Lägg märke till skillnaden i detaljnivån för den erhållna MRLC:: GFP signal beteende här (som representerar vävnads skalan) jämfört med film 1 (som representerar den cellulära skalan). Den främre sidan är till vänster. Scale bar = 50 μm. vänligen klicka här för att se denna video. Högerklicka för att ladda ned.

Movie 4: Representativt dynamiskt uppförande av basal myosin II (MRLC:: GFP) på vävnaden fjäll i en Fat2 Mutant Drosophila ägg kammare. Observera att MRLC:: GFP (grön) pulserar starkt vid den basala sidan av nästan hälften av follikelepitelet i en fat2 Mutant ägg kammare och underlåter att generera den synkroniserade kraft som krävs för att främja epitelial rotation. Cell konturerna är i magenta. Den främre sidan är till vänster. Scale bar = 50 μm. vänligen klicka här för att se denna video. Högerklicka för att ladda ned.

Movie 5: Representativt dynamiskt uppförande av apikala myosin II (MRLC:: GFP) på vävnads skalan i en kontroll Drosophila ägg kammare. Endast en tunn MRLC:: GFP skiktet utvinns ur apikala (inre) sidan av nästan hälften av follikeln epitel av en ägg kammare. Observera att MRLC:: GFP (i grönt) visar olika dynamiska beteende här på apikala sidan jämfört med den basala sidan av follikelepitel (som visas i filmen 3). Cell konturerna är i magenta. Den främre sidan är till vänster. Scale bar = 50 μm. vänligen klicka här för att se denna video. Högerklicka för att ladda ned.

Film 6: representativa dynamiskt beteende apikala myosin II (MRLC:: GFP) på vävnads skalan i en Fat2 Mutant Drosophila Egg Chamber. Förändrat dynamiskt beteende av MRLC:: GFP (grön) utvinns ur en tunn apikal region av nästan hälften av follikeln epitel av en statisk fat2 Mutant ägg kammare. Cell konturerna är i magenta. Den främre sidan är till vänster. Scale bar = 50 μm. vänligen klicka här för att se denna video. Högerklicka för att ladda ned.

Discussion

Kritiska steg och felsökning för dissektion och odling av ägg kammare

Om alltför många flugor är placerade i en liten flaska, kan flugan vända leriga efter 2-3 dagar på grund av omfattande mängder av utfodring larver och vuxna flugor fastnar i flugan mat. I ett sådant fall, Vänd resten av dessa flugor i en ny flaska med färsk mat och trappa ner deras antal. I synnerhet utesluta kvinnor som fastnat i maten.

Den Schneider mix (SM) bör förberedas i förväg och kan förvaras vid 4 ° c för ~ 14 dagar. Tänk på att en äldre blandning kan innehålla kristaller som kan skada ytan av ägg kammare. Blanda alltid SM med nytillsatt insulin och låt den tillräckligt med tid för att nå rumstemperatur. Detta skyddar ägg kammare mot kall chock, vilket kan ha en negativ inverkan på tillväxten av mikrotubuli och planar anpassningen av cytoskelettet (som kan ses i utvecklingen Drosophila Wing¹⁹).

Ägg kammare och utvalda ovarioler är mycket bräckliga och, på grund av sin ringa storlek, kan flyta i SMI (SM med insulin). Det rekommenderas att låta dem spontant sjunka i SMI. De också ofta hålla sig till dissektion forceps/Cactus verktyg. I ett sådant fall, låt dem frigöra sig från dissektion enheter genom att försiktigt flytta dem i SMI. Undvik att klämma och vidrör dem direkt vid alla tidpunkter. Om så krävs, utesluta dessa ägg kammare/ovarioler från ytterligare protokoll.

Som en dissektion stereoskop är inte tillförlitlig för identifiering av skadade ägg kammare/ovarioles, ägg kammare/ovarioles bör kontrolleras med hjälp av en CellMask eller FM 4-64 färgämne under en Confocal/spinning disk Mikroskop. Skadade ägg kammare visar extrem färg jämfört med en oskadad Egg Chamber vävnad bakgrund. Aldrig förvärva en TLM med starka färgämnen fläckar.

Kritiska steg och felsökning för in vitro levande avbildning av ägg kammare

Om fritt placerade ägg kammare i SMI fortfarande flytta, kontrollera igen under den konfokala Mikroskop för att se om det fortfarande finns några förbisedda rester av muskelvävnad ark och skräp flyter i SMI. Ta bort dem och försök igen. Av ägg kamrarna bör 90% vara stabila och orörlig vid efterföljande avbildning.

För att se till att en vald Egg kammare/ovariole är stabil, Använd höghastighets bildtagning (6 s intervall) för 1 min. instabila ägg kammare skulle flytta genom denna punkt. Det rekommenderas dock att titta på hela tidsfördröjning inspelning för att kunna försiktigt korrigera en potentiell oväntad rörelse av den avbildade ägg kammaren. Detta kan göras genom att flytta mikroskopiska skede/bord, som innehar petriskål med odlade ägg kammare/ovarioles, till den ursprungliga positionen så att ägget kammaren av intresset är återigen i avbildade, fokuserade fönster.

Stoppa bildtagning om en plötslig och oväntad förflyttning av den avbildade ägg kammaren visas. Kontrollera dämpning av Mikroskop bordet, och undvika att gå runt nära mikroskopet under förvärvs tiden eftersom detta kan resultera i störningar i bilden förvärvet på grund av vibrationerna orsakade.

Om cellmembran färgämnet inte syns efter 30 min och den använda laserlinjen är korrekt, tillsätt mer av färgämnet och öka dess koncentration för nästa förvärv.

Om aktomyosin signalerna verkar vara suddig, kontrollera na av det mål som används. En NA lägre än 1,3 kommer att minska bildkvaliteten. Dessutom, se till att använda nedsänkning olja har tillämpats korrekt på vatten 63x mål. Lägg till eller Ersätt den om det behövs.

Om ägg kamrarna krymper och de observerade cellmembranen deformera, kontrollera om locket är ordentligt stängt. Om locket saknas eller inte är ordentligt stängd, kan ägget kamrarna torka ut på grund av SMI avdunstning över förvärvs tiden.

Om äggkamrarna saktar ner eller stannar, minskar lasereffekten. Om ett hål visas i ägg kammaren, har det bränts av lasern. Minska lasereffekten.

Om aktomyosin signaler blekmedel efter 2 min under TLM förvärv, minska lasereffekten och öka signal förstärkning i Mikroskop programvaran.

När en TLM av follikeln epitel av en ägg kammare har förvärvats, det rekommenderas att undvika avbildning igen i samma vävnads region i denna ägg kammare. Men som ägg kammare rotera runt deras AP-axeln, är det möjligt att upprepa förvärvet av en TLM med denna oskadade ägg kammare efter ca 30 min. Medan Imaging follikeln epitel i en ägg kammare, andra ägg kammare kommer inte att blekas/skadas även om de är placerade i samma ovariole eller i en annan ovariole i SMI.

Om alla dessa krav uppfylls bör andelen framgångsrika ägg kammare vara cirka 90% – 100% för etapperna 6 – 8, cirka 50% – 60% för faserna 3 – 5 och cirka 20% – 30% för etapperna 1 –-2. Misslyckande beror främst på förflyttning av ägg kammare eller skador på dem under deras dissektion/manipulation.

Kritiska steg och felsökning för databehandling

Under maskgenerering med hjälp av den medföljande skriptet i Fiji, kan det hända att det finns en hel del genererade cell konturer som inte återspeglar den faktiska cellmembranen i en TLM. Detta orsakas ofta av höga bakgrundsljud, särskilt när färgämnen för att färga cellmembran används. I ett sådant fall, för att undvika den tråkiga korrigering av oönskade cell konturer i den genererade masken, kör segmenteringen igen och Ställ in parametrarna till den bästa passformen. Detta kan göras genom att justera den uppskattade brus tolerans parametern.

När du läser in en av de ParticleStack. TIF-filer som innehåller cell kon turer i Surface Manager skalas laddningstiden linjärt med antalet cell kon turer och kan ta flera minuter. Om laddningen avbryts eller är felaktig upprepar du den. Kontrollera att uppladdnings fönstret är i fokus och att inget annat program används.

Ibland måste en cell kontur korrigeras i vissa ramar. Använd i så fall pensel knappen. Rita rätt cell disposition i en viss bildruta genom att dra musen runt cellmembranet. Flytta till en annan bildruta i TLM och återgå sedan till tidsramen med korrigeringen: den felaktiga cell dispositionen ska nu bytas ut. Gå sedan tillbaka till nästa bildruta för att korrigera den. Pensel verktyget kommer nu att växla till Raderingsläge. Om det behövs korrigerar du konturerna i nästa tidsramar genom att trycka på den befintliga cell kon turen och sedan trycka på knappen + Lägg till för att skapa en ny cell disposition. Ta bort det gamla S-numret från fönstret för Surface Manager och Byt namn på den nya cell dispositionen genom att trycka på knappen Byt namn om det behövs.

Om en hel viktig cell saknas i en TLM skapar du en ny mask disposition genom att trycka på avmarkera > polygon. Skapa en ny cell disposition i den första bildrutan i TLM genom att klicka längs cellmembranet. Gå sedan till den sista bildrutan i TLM och gör samma för den valda cellen. Genom att köra filmen i tid interpoleras cell konturerna. Korrigera med pensel verktyget om det behövs. När du är klar trycker du på knappen + Lägg till och byter namn på cell dispositionen genom att trycka på knappen Byt namn . Ju fler poäng/klick för att skapa en ny cell disposition, desto bättre interpolation fungerar.

Förutom epitelial rotation, är TLMs ibland påverkas av oönskade rörelser. Därför, det rekommenderas att korrigera för sådan vävnads drift i dessa TLMs. Genom att göra det, TLMs korrigeras också för epitelial rotation av ägg kammare, och cellmembran blir stela. Detta gör den manuella analysen av aktomyosin signaler lättare. Ett sådant tillvägagångssätt tillåter dock inte forskarna att särskilja huruvida de observerade actomyosinsignalerna rör sig eller är statiska i förhållande till cellmembranet. Om en distinktion mellan statiska och aktiva rörelser av actomyosinsignaler är målet för en sådan analys, bör ingen korrigering av vävnads drift tillämpas. Vi fann att majoriteten av aktomyosin signaler aktivt flytta i förhållande till cellmembranet och endast en mindre del av dem verkar statiska.

Kritiska steg och felsökning för analys av subcellulära aktomyosin signaler

Om statistiken som genereras innehåller avvikare, se till att alla extremt låga eller höga värden med avseende på hela datauppsättningen verkligen återspeglar beteendet i cellen och inte är artefakter. Detta kan göras genom att identifiera cellen som innehåller avvikare och kontrollera cell kon tur kvalitet vid den tidpunkt då det låga/höga värdet mättes. Ofta resulterar sådana extrema värden av defekta cell kon turer som felaktigt mäter en del av en annan cell. Detta kan vara särskilt tydligt när stora blobbar stör cell konturerna för en angränsande cell. I ett sådant fall är det viktigt att korrigera cell konturerna och upprepa mätningen.

Om du vill göra kvantifieringen enklare analyserar du signalerna i en viss cellyta och fortsätter en efter en tills alla celler analyseras i en under film. Resultaten av manuell analys av subcellulära aktomyosin signaler kan inte visa symmetri bryta i en cell och en viss ägg kammare. Vi upplevde att aktomyosin inte klart bryter symmetri i förhållande till vävnads rörelsen i < 10% av de roterande ägg kamrarna (etapperna 6 – 8). Denna procentsats ökas runt etapp 4¹². Vi fann också att det inte finns någon skillnad om 5 min eller 10 min analyseras i identifieringen av den föredragna riktningen av aktomyosin signal rörelse i en ägg kammare¹².

Kritiska steg och felsökning för selektiv extraktion av aktomyosin signaler från böjda vävnader

Fel storlek på blobbar (identifierade signaler) kommer att resultera i inga blobbar och programmet kommer att frysa i nästa steg. I det här fallet tvinga-avsluta Fiji och nyligen starta om plugin ellipsoid ytan projektion. Gör samma när programmet inte reagerar efter att ha tryckt Compute. Detta är ofta en indikation på att olämpliga parametrar har valts.

Om det finns för många blobbar och/om de är koncentrerade mot ena sidan av den analyserade ägg kammaren, detta kan påverka den utformade ellipsoid och inte ge rätt passform för ägget kammaren. Gå tillbaka till BLOB-identifieringen och försök att ordna deras storlek i kombinationen med x-, y-och z-axelns val av ägg kammaren. Ett misslyckande att generera en bra ellipsoid passar också ofta uppstår när olämpliga cut-off avståndsinställningar används.

De prognoser som erhålls kan ibland se missriktad, eller kanske den erhållna z-planet faktiskt rör sig mellan cellskikt nära ytan av ägget kammaren. Detta är vanligtvis ett tecken på en dåligt passande ellipsoid där en region i ellipsoid är inställd för långt från ägg kammaren. Försök att passa ellipsoid så att den upprätthåller samma avstånd från ägget kammaren omkrets.

Begränsningar av metoden och nya metoder

Denna fria odling av ägg kammare utesluter subtila tillplattning av en ägg kammarens yta. För detta ändamål har denna metod sina fördelar och nackdelar. När du använder konfokalmikroskopi, det ger användare med hög upplösning och hög hastighet Imaging som tillförlitligt avslöjar aktomyosin beteende i celler vid omkretsen av ägg kammare för en kort tid (5 – 10 min). Men genom att göra det, begränsar det storleken på ett enda plan som kan avbildas med konfokalmikroskopi över tiden. I allmänhet är det möjligt att avbilda upp till ~ 15 celler per ägg kammare i etapper 6-8 men bara om två celler i ägg kammare i etapper 1 – 5. Därför har vi definierat denna metod här som är lämplig endast för den lokala cellulära skalan.

För att övervinna dessa storleksbegränsningar som orsakas av den begränsade storleken på ett enda konfokalplan, har vi utvecklat en alternativ Fiji-baserade metod som kallas ellipsoid Ytprojektion, för användning på vävnads skalan. Detta kombinerar spinning skivmikroskopi med en semi-interaktiv yta extraktion av ägg kammare på vävnads skalan. På detta sätt, aktomyosin signaler kan erhållas samtidigt för mer än 50 –-100 celler från en analyserade ägg kammare. Det är viktigt att notera att denna metod genererar mycket stora dataset av förvärvade data (~ Giga bytes), har en lägre upplösning (den använder en 40x vs en 63x mål), och ger också en långsammare bildhastighet (det tar ~ 60 s att skanna igenom hälften av vävnaden i ett ägg Cham [etapperna 6 – 8] och som sådan är den 10X långsammare än den begränsade konfokalplaneringsmetoden).

Jämfört med andra befintliga program för att extrahera skiktade prognoser från parametriserade ytor, plugin som utvecklats för detta protokoll är inriktad på enkel användning och interaktiv visuell feedback vid varje steg i processen. Andra verktyg, som MATLAB-baserade ImSaNE²⁰, som används av Chen et al.²¹, fokuserar på att hantera en mängd olika parametriserade och icke-parametriserade ytmodeller och olika projektionsmetoder. Till exempel kräver ImSaNE data som ska förbearbetas och justeras på ett visst sätt och kräver delvis externa verktyg i mellanliggande steg. I motsats, den plugin som presenteras här hanterar alla 3D/4D/5D bild (sekvens) som kan öppnas i Fiji utan extern förbehandling. Även om ImSaNE är mycket konfigurerbar (programmerbar) genom att redigera MATLAB-skript, tillhandahåller vi en minimal uppsättning alternativ i ett arbetsflöde som är anpassat till det specifika problem som diskuteras här. Varje steg i det interaktiva arbetsflödet ger resultat som omedelbart kan inspekteras visuellt och justeras vid behov.

Beslutet om vilken av dessa Imaging metoder, den lokala cellulära eller vävnad skala, är det bästa för ett visst experiment, beror enbart på den vetenskapliga frågan som skall besvaras (dvs högre kontra lägre upplösning, kort kontra lång förvärvs tid). En bra kompromiss mellan dessa två skalor skulle kunna vara att kombinera båda metoderna, vilket vinner avbildning av aktomyosin signaler vid halv vävnads skalan (dvs., 20 – 30 celler). Detta kräver en snurrande skiva Mikroskop, ett vatten 63x objektiv med NA ≥ 1,3, och etablerade z-stack inställningar för 20 – 30 celler i en ägg kammare. Detta mycket grundare z-stack (i motsats till z-stacken som krävs för förvärvet av en halv av en ägg kammare) möjliggör snabbare skanning av under 60 s. Den tid som vunnits här kan användas antingen för upprepad z-stack förvärv för att påskynda Imaging eller för ett prov återhämtning (tid interleaves) mellan enskilda z-stackar. Med den senare, en längre förvärvs tid (> 30 min) av TLMs av roterande ägg kammare kan uppnås. Denna semi-Tissue tillvägagångssätt garanterar en tillräcklig upplösning för aktomyosin signaler och avbildning av fler celler samtidigt över längre tidsperioder.

Framtida tillämpningar och visioner

Båda beskrivna metoderna (på den lokala cell-och vävnads skalan) ger en enkel och låg kostnad metod (exklusive Mikroskop enheter) med begränsade biverkningar på aktomyosin nätverket och kan implementeras och lätt antas för andra dissekerade djurvävnader. Den enda förutsättningen här är en befintlig odling protokoll i en petriskål för en böjd vävnad av intresse, tillgängliga transgener, och markörer eller märkningsmetoder.

I kombination med ljusblad fluorescens mikroskopi²², är det också möjligt att bilden aktomyosin maskiner i Toto (dvs bild den kompletta yttre omkretsriktningen ytan av Drosophila ägg kammare samtidigt och därefter veckla ut med insticksprogrammet ellipsoid Surface Extraction). Det finns dock några begränsningar som måste lösas i fråga om lämplighet för höghastighetståg avbildning av aktomyosin signaler, nämligen 1) inbäddning av ägg kammare i en låg-punkt smältande aguppstod eller deras fastnar i en kapillär under avbildning; II) en låg numerisk bländare av använda vatten linser som inte ger tillräcklig aktomyosin signal upplösning; III) den ytterligare tid som behövs för att förvärva flera vinklar av ägg kammare, vilket förhindrar höghastighetsfotografering.

I detta syfte är det förutsebart att den detaljerade analysen av aktomyosin-maskineriet, med förfining av Mikroskop parametrar såsom hastigheten för skanning genom epitelvävnaden och förbättringen av använda mikroskopiska linser, i framtiden kommer att möjliggöra lovande högupplöst resultat som erhålls på vävnaden och i Toto skala över långa tidsperioder.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Schneider Medium	Gibco	21720-024	[+]-Glutamine
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122	[+] 10.000 Units/mL Penicillin [+] 10.000 µg/mL Streptomycin
Fetal Bovine Serum	Sigma	F135	Heat inactivated
Insulin Solution Human	Sigma	I9278
50 mL Falcon tubes	Eppendorf		sterile
Millex-GV filter	Millipore	SLGV033NS	33 mm
Glass Bottom Microwell Dishes	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C	35 mm Petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 cover glass
Forceps	A. Dumont & Fils		#55
CellMask Deep Red (cell membrane dye)	Invitrogen	C10046
FM4-64 (cell membrane dye)	ThermoFisher/Invitrogen	T13320
Depression dissection slide	Fisher Scientific	12-560B
Microscopic equipment
Steromicroscope	e.g. Zeiss		Stemi SV 6
Inverted confocal microscope	e.g. Zeiss/Olympus
Spinning disc microscope	e.g. Zeiss/Andor
Microscopic glass/cover glass	e.g. Thermo Scientific/Menzel Glas
Cactus tool
Wironit needle holder	Hammacher	9160020
Cactus spine	Echinocactus grusonii/barrel cactus
Drosophila stocks used in the manuscript
AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP			For detail see Rauzi et al.: Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodeling. Nature 2010, Vol. 468, pg. 1110-1115.
AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP; fat258D/fat2103C			For detail see Viktorinova et al.: Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations. PLoS Genetics 2017, Vol. 13, Issue 11, pg. e1007107.