Analyse av Actomyosin Dynamics på lokale Cellular og tissue skalaer bruke time-lapse Movies of kultivert Drosophila egg Chambers

Summary

Denne protokollen gir en Fiji-basert, brukervennlig metodikk sammen med enkle instruksjoner som forklarer hvordan du pålitelig analysere actomyosin atferd i individuelle celler og buet epitel vev. Ingen programmeringskunnskaper kreves for å følge opplæringen; alle trinnene utføres i en semi-interaktiv måte ved hjelp av det grafiske brukergrensesnittet i Fiji og tilhørende plugins.

Abstract

Drosophila umodne egg kalles egg kamre, og deres struktur ligner primitive organer som gjennomgår morfologiske endringer fra en runde til en ellipsoiden form under utvikling. Denne utviklingsmessige prosessen kalles oogenese og er avgjørende for å generere funksjonelle modne egg for å sikre neste fly generasjon. Av disse grunner har egg kamre fungert som en ideell og relevant modell for å forstå dyr orgel utvikling.

Flere in vitro dyrking protokoller er utviklet, men det er flere ulemper til disse protokollene. En innebærer anvendelse av ulike deksler som utøver et kunstig press på avbildet egg kamre for å nakkens dem og å øke avbildet oppkjøpet flyet av circumferential overflaten av analysert egg kamre. En slik tilnærming kan negativt påvirke atferden til den tynne actomyosin maskiner som genererer makt til å rotere egg kamre rundt deres lengre akse.

Derfor, for å overvinne denne begrensningen, kultur vi Drosophila egg kamre fritt i media for å pålitelig analysere actomyosin maskiner langs omkretsen av egg kamre. I den første delen av protokollen, gir vi en manuell detaljering hvordan å analysere actomyosin maskiner i et begrenset oppkjøp flyet på den lokale mobilnettet skala (opptil 15 celler). I den andre delen av protokollen, gir vi brukerne en ny Fiji-basert plugin som gjør det mulig for enkel ekstraksjon av et definert tynt lag av egg kamre ' circumferential overflate. Følgende protokoll beskriver deretter hvordan du analyserer actomyosin signaler på vevs vekten (> 50 celler). Til slutt, vi finne begrensningene i disse tilnærmingene på både den lokale cellulære og vev skalaer og diskutere sin potensielle fremtidige utvikling og mulige anvendelser.

Introduction

Den kontinuerlige utviklingen av romanen bilde-og programvare teknologier med programmer i biovitenskap har gitt en enorm innvirkning på forståelsen av livets grunnleggende prinsipper. En av hovedutfordringene er den pålitelige visualiseringen av utviklingsprosesser i kombinasjon med deres Live Imaging i ulike vev. Vev er deler av organer og organer, og som sådan, de fleste er ikke lett tilgjengelig for Imaging. Derfor er protokoller som tillater at deres disseksjon og in vitro-dyrking er utviklet for å visualisere biologiske hendelser som tilstrekkelig reflekterer in vivo-situasjonen i et levende legeme.

I løpet av de siste ti årene, dyrking og live Imaging av Drosophila egg kamre, acinar strukturer som likner primitive organer, har bidratt umåtelig til forståelsen av de grunnleggende prinsippene for primitive orgel utvikling^{1 , 2} andre priser ^{, 3}. for tiden er det flere dyrking protokoller tilgjengelig, og deres bruk avhenger av oppkjøpet tid, celle type som skal avbildet, og deres tilgjengelighet (f. eks indre germline g. ytre somatiske linje)⁴.

En vanlig funksjon i alle disse dyrking protokollene er behovet for immobilisering av analysert egg kamre som viser en høy kontraktile aktivitet i flytende Media. Den kontraktile aktivitet av egg Chambers er forårsaket hovedsakelig av muskelen ark som dekker en lang rekke koblet egg Chambers^5,6,7. Derfor, for å oppnå riktig immobilisering av unge egg kamre, har ulike tilnærminger er utviklet, som involverer dekker egg kamre med coverslips^6,8,9 eller fleksible tepper^{4, 10} eller bygge dem inn i lav-smelte-punkt agarose^3,11. Disse tilnærmingene er populære som de også tillate Imaging av en større visuell planet på grunn av subtile flatere av circumferential overflaten av egg kamre.

Men nylig har det vist seg at unge egg kamre (etappe 1-8) roterer rundt deres fremre-bakre akse⁶ og at dette vevet bevegelse er drevet av en fin actomyosin nettverk nær circumferential overflaten av disse unge egg kamre ¹². derfor kan kunstig endring av mobilnettet overflaten skyldes en subtil flatere av dette vevet har en negativ innvirkning på atferden til kraft-generering actomyosin maskiner. Kontrapunkt er at hvis egget kammer vevet ikke slås sammen, blir mikroskopisk bilde av proteiner på circumferential overflate av egg kamre enda mer begrenset av den reduserte størrelsen på oppkjøpet flyet.

Derfor har vi kombinerte protokoller fra Prasad et al.⁹ og laboratoriet av Celeste Berg^4,10 og ytterligere modifisert dem slik at ingen dekkglass/fleksibelt teppe/agarose brukes i den utviklede metoden. Drosophila egg kamre er fritt kultivert i Media og protokollen som presenteres her gjelder bare invertert mikroskopi. Det er to deler til protokollen. Den første delen er fokusert på analyse av actomyosin signaler på den lokale mobilnettet skala (opptil 15 celler) i egg kamre. I den andre delen, fokuserer vi på å overvinne begrensningene forbundet med et lite oppkjøp fly forårsaket av den frie dyrking av egg kamre. I denne forbindelse har vi utviklet en roman Fiji-baserte beregningsorientert metode med en semi-interaktivt grafisk brukergrensesnitt som selektivt ekstrakter og utfolder definerte lag av en circumferential vev overflaten. Dette etterfølges av en protokoll som beskriver hvordan man analyserer actomyosin på vevs vekten (dvs. > 50 celler). Som selektiv ekstraksjon av et definert tynt lag av buet epitel vev har ikke vært lett mulig å bruke en klassisk z-stack projeksjon (figur 1), denne lett-å-bruke metoden fungerer som en viktig forutsetning for å omfattende forstå atferden til en tynn (< 1 μm) actomyosin nettverk på vevet skala i Drosophila egg kamre.

I tillegg, for å lette protokollen, tilbyr vi eksempel tidsforløp filmer (TLMs) og eksempel filer av fluorescensmerkete tagget nonmuscle konvensjonelle myosin II-atferd (se tilleggsfil 3). Myosin II er et motor protein og representerer den aktive kontraktile delen av actomyosin maskineri. For å image myosin II bruker vi Drosophila transgene Lines som inneholder en modifisert regulatoriske lys kjede av myosin II kalt MRLC:: GFP (se tabell over materialer for detaljer)^12,13. For å visualisere cellemembraner, er protokollen basert på kommersielle fargestoffer (se tabell over materialer). Denne protokollen er egnet ikke bare for analyse av små subcellulære MRLC:: GFP signaler¹² , men også for alle lignende store subcellulære partikler rundt ± 300 μM, slik som de som er observert med Life-Act:: GFP^12,14.

Selv om begge disse protokollene er presentert med in vitro kultivert Drosophila egg kamre, kan oppkjøpet av actomyosin signaler også utføres ved hjelp av andre vev på optimalisering av dyrking Media og avhengig av tilgjengelighet av enten fluorescensmerkete merkede proteiner med tilsvarende kommersielle fargestoffer eller, for eksempel, mRNA microinjections å få forbigående gen uttrykks profiler. På samme måte kan den Fiji-baserte protokollen for ekstraksjon av et tynt lag fra en circumferential overflate brukes mer generelt til ellipsoiden vev.

Protocol

Merk: Følgende protokoll gir instruksjoner om hvordan å analysere actomyosin på det lokale mobilnettet og vevet skala i Drosophila egg kamre. Det innenbys-skalaen adgang innrømmer brukernes å analysere detaljert actomyosin opptreden inne til 15 celler per eggkammeret og behøver oppkjøpet av TLMs for en kort perioden (5 – 10 min) av benytter høy-fart tenkelig og en invertert konfokalmikroskopi mikroskop. I kontrast gir vevs vekten brukerne actomyosin informasjon i 50 – 100 celler og krever anskaffelse av TLMs i lang tid (≥ 30 min) ved bruk av lavhastighets bildebehandling og et invertert, roterende plate mikroskop (se figur 2 og de anbefalte parametrene i hver skala i tabell 1). Beslutningen i hvilken skala for å analysere actomyosin signaler avhenger helt av brukerens vitenskapelige spørsmål. Ledsaget test TLMs bør bidra til å ta denne avgjørelsen.

1. lokal Cellular Scale (LCS)

Merk: Å analysere og bilde in vitro kultivert Drosophila egg kamre, følger protokollen beskrevet i supplerende fil 1. Hvis du vil analysere ervervet TLMs, fortsetter du med protokollen nedenfor. Lenker til med følgende test filer av TLMs er gitt i supplerende fil 3.

1. Data behandling av TLMs på lokal mobil skala (LCS)
   1. Bleach korreksjon av TLMs å kompensere for intensitet forfall av fluorescerende etiketter
      1. Sørg for at et oppdatert Fiji-program er installert på datamaskinen som brukes, ved å følge disse instruksjonene: Fiji > åpne en TLM (for eksempel TestMovie1. tif fra tilleggsfilen 3).
      2. Del fargekanalene ved å klikke bilde > farge > delte kanaler.
      3. Utfør en bleke korreksjon på begge kanaler ved hjelp av bilde > Juster > blekemiddel korreksjon > enkelt forhold > bakgrunns intensitet 0,0.
         Merk: Hvis utilfredsstillende resultater oppnås, bør du utforske hvilke korrigerings metoder i denne plugin-modulen som passer best (for eksempel bruke histogram Matching i stedet for et enkelt forhold).
   2. Celle segmentering for å generere en celle maske for TLMs
      1. Hvis Fiji ikke allerede er åpent, åpner du det på nytt (og kontrollerer at det er oppdatert) etter hjelp > oppdateringen ≫ tar i Bruk endringer > OK.
      2. Hvis dette ikke allerede er gjort, Last ned makroen TissueCellSegmentMovie. ijm (fra http://adm.irbbarcelona.org/MATLAB/TissueCellSegmentMovie.ijm). Dra og slipp dette skriptet til Fiji.
      3. Åpne den bleke-korrigerte TLM. TIFF-filen (se pkt. 1.1.1). Split kanalene i bleke-korrigert fil ved hjelp av bilde > farge > Split Channels.
      4. Kjør det opplastede skriptet på den aktive celle membran kanalen til den valgte TLM ved å trykke på ikonet Kjør i det åpne skriptet. Sett Gaussian Blur til 2,500 og cellen deteksjon følsomhet til -1 og klikk OK. For å få en fin celle maske, ikke endre disse parametrene ovenfor. Angi anslått støy toleranse mellom 10 – 20 for TLMs som er anskaffet med 63x-objektiv, og klikk på OK.
         Merk: For andre målsettinger kan det være nødvendig med ulike parametre. Den renere bakgrunnen i en TLM, den nedre estimert støy toleranse er nødvendig.
      5. En generert celle maske vises i den analyserte TLM og også i et nytt vindu kalt ParticleStack (G), og i tillegg et lite vindu kalt handling kreves vises. Fra celle masken på TLM fokuserer du bare på celler i midten av TLM og velger de som kan gi fullstendige og veldefinerte konturer i hele TLM.
      6. Hvis merkede celler inneholder kunstige/ekstra celle omriss, bruker du flette verktøyvinduet kalt handling obligatorisk i TLM. For sistnevnte, følg instruksjonene i vinduet.
         Merk: Sørg for at celle omriss er veldefinerte og samsvarer med reelle cellemembraner i en TLM, da enhver upresisjonsverdier kan påvirke påfølgende analyser. Ytterligere tilpasninger og endringer, for eksempel fjerning av uønskede celler, kan gjøres senere ved hjelp av Surface Manager-verktøyet (beskrevet i avsnitt 1.1.3).
      7. Når de valgte cellene i sentrum pent samsvarer med den virkelige cellemembraner, lagre ParticleStack som en TIFF-fil etter fil ≫ Lagre som > TIFF.
   3. Lasting av den genererte celle masken i Surface Manager
      1. Installere Surface Manager plugin¹⁵ i den brukte Fiji-oppsett. Følg instruksjonene fra Viktorinova et al.¹⁶.
      2. Åpne Surface Manager ved hjelp av plugin-moduler > Segmentering ≫ Surface Manager (3D).
         Merk: Surface Manager-vinduet viser flere handlingsknapper til høyre og et tomt vindu til venstre. Hvis du vil se alle handlingsknappene, kan det være nødvendig å strekke vinduet i høyden/bredden. Vær oppmerksom på at tidsrammer vil vises som z-stykker.
      3. Åpne den tilsvarende ParticleStack. TIFF-filen i Surface Manager ved å klikke fil > Åpne og velge bildet som skal åpnes (for eksempel ParticlesStack1. tif).
      4. I Surface Manager klikker du på Les disposisjons bilde knappen og setter jacquard-indeksen til 60%.
         Merk: Innlasting av ParticlesStack1. TIF-filen kan ta opptil flere minutter, avhengig av datamaskinens prosessorkraft.
      5. Når den er lastet inn, tildeles hver celle med et S-nummer og vises i den venstre delen av Surface Manager-vinduet.
         Merk: Hvis du vil vise disposisjoner og cellenavn for alle cellene, merker du av for Vis alle og Vis etiketter nederst i Surface Manager-vinduet. Det anbefales å bruke denne funksjonen når cellenumrene er kontrollert for riktigheten.
      6. Klikk på det første S-tallet; den importerte celle disposisjonen fra ParticlesStack1. tif vises på TLM. Kontroller hvert importerte S-nummer for celle omriss kvalitet i hele TLM og fjern uønskede celler som viser feil celle omriss. For å gjøre dette, uthever du celle disposisjonen og klikker på knappen delete.
         Merk: Det er også mulig å korrigere for unøyaktige celle omriss og legge til nye celle omriss. Dette er beskrevet i diskusjons delen.
      7. Lagre alle korrigerte celler som en RoiSet. zip-fil ved å trykke på Lagre på disk -knappen.
         Merk: Hvis sesjonen må avbrytes, er det mulig å laste RoiSet-filen inn i Surface Manager senere: åpne en TLM i Fiji (fil > åpen) og velg en TLM. Åpne Surface Manager via Plugins > Segmentering ≫ Surface Manager (3D). Last inn den tilsvarende RoiSet. zip-filen ved å klikke Last fra plate knappen og velge den riktige RoiSet. zip-filen. Dobbeltsjekk at de lastede celle maskene tilsvarer den lastede TLM.
   4. Korreksjon for vev drift i TLMs
      Merk: I løpet av TLMs ' anskaffelsestid kan drift effekter observeres på grunn av epitel rotasjon eller en uønsket bevegelse. I begge tilfeller anbefaler vi at du korrigerer for enhver drift for å forenkle den manuelle actomyosin analysen senere. Drift korreksjon er bare nødvendig for manuell actomyosin analyse. Denne opplæringen krever oppdatert Fiji programvare med MultiStackReg plugin (https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#multistackreg) installert.
      1. Åpne blekemiddel-korrigert TLM i Fiji via fil > Åpne og velg Bleach-korrigert fil opprettet ved hjelp av opplæringen nevnt ovenfor.
      2. Split kanalene og velg den som identifiserer cellemembraner via bilde > farge > Split Channels.
      3. Bruk følgende protokoll når celle konturene ikke er synlige glatte: prosess > filtre > Gaussian Blur. Sett den til ~ 1-2 for en 63x objektiv og klikk OK og så Ja. Klikk på behandle > binær > Konverter til maske ved hjelp av standardinnstillingene. Klikk deretter OK.
      4. Last MultiStackReg plugin følgende Plugins > registrering > MultiStackReg.
      5. Kontroller at stakk 1 er satt til cellen membran kanalen, handling 1 er satt til Juster, og transformasjon er satt til oversettelse. Merk av for Lagre transformeringsfil , og klikk deretter OK.
      6. Åpne den valgte TLM, MultiStackReg-plugin-modulen og den lagrede transformeringsfilen på nytt ved hjelp av fil > Åpne og Velg a TLM. Del fargekanalene ved hjelp av bilde > farge > delte kanaler.
      7. Last MultiStackReg plugin ved å klikke Plugins > registrering > MultiStackReg. Velg Last inn transformeringsfil som handling 1.
      8. La transformasjon som rigid Body og klikk OK. Velg den tidligere lagrede transformeringsfilen, og klikk OK igjen.
      9. Slå sammen bilde kanalene og lagre den registrerte TLM som en TIFF-fil etter bilde > farge > flette kanaler. Lagre filen ved å klikke fil ≫ Lagre som > TIFF.
         Merk: Det finnes alternative måter å korrigere for en vev drift i Fiji, nemlig via Plugins > registrering ≫ StackReg/riktig 3D drift.
2. Analyse av actomyosin pulser i Surface Manager på LCS
   Merk: Dette protokoll trinnet tillater forskere å identifisere om actomyosin pulser er til stede i det analyserte vevet og å forstå den detaljerte atferden samt retningen av actomyosin signaler.
   1. Åpne Fiji, og kontroller at en TLM og den tilsvarende celle masken er åpen i Surface Manager.
      Merk: Kontroller at Fiji er installert og oppdatert, og at Surface Manager plugin-modulen er installert (trinn 1.1.3.1).
   2. Åpne en TLM med fil > Åpne og velg en TLM for å åpne (f.eks. TestMovie1_bleach. tif). Last inn Surface Manager plugin via Plugins > Segmentering ≫ Surface Manager (3D). Legg den lagrede celle masken opprettet i opplæringen her (f. eks, ParticlesStack1. tif) via fil > Åpne og velg en celle maske (f. eks, ParticlesStack1. tif). Last inn tilsvarende region av interesse (ROI, for eksempel, TestMovie1_RoiSet. zip). Se figur 3a.
   3. Bytt til den kanalen som er interessert i den valgte TLM.
      Merk: Hvis du vil skille kanalene, følger du fargekoden som er angitt rundt TLM.
   4. Klikk statistikk -knappen i Surface Manager for å få tak i vinduet kalt gjennomsnittlig grå verdi Slice by Slice (figur 3b). Legg merke til at middelverdien/median intensitet verdier av actomyosin signaler i en gitt analysert kanal innenfor den definerte cellen skisserer over tid vil bli vist, samt andre parametre knyttet til celleområdet og celle form.
      Merk: Intensiteten verdiene er i arbitraty enheter (A.U.); celleområdet er i piksler og må konverteres til firkantede mikrometer.
   5. Lagre de oppnådde verdiene som en regnearkfil. Falle i staver på statistikken vindu, arkiv ≫ bevare idet.
      Merk: Det er mulig å verifisere innhentet statistiske verdier senere som følger: åpne bleke-korrigert TLM i Fiji og åpne Surface Manager. Belaste det tilsvarende RoiSet. zip å det TLM av trykker det belaste fra diskett knapp og åpen filen. Den lagrede masken med celle omriss blir lastet opp, og navnene på cellene vises i venstre Surface Manager-vindu. Klikk statistikk -knappen for statistiske verdier.
3. Manuell analyse av individuelle subcellulære actomyosin signaler på LCS
   Merk: Denne protokollen krever mest konsentrasjon og er tidkrevende. Generelt, en ervervet TLM kan godt analyseres innen 1 dag. Dette inkluderer ikke tid til flue forberedelser før deres disseksjon, disseksjon selv, og bildeoppkjøp.
   1. Åpne en valgt, Bleach-korrigert og registrert (drift-korrigert) TLM i et oppdatert Fiji-program. Bruk en bleke-korrigert og drift-korrigert TLM (f. eks, TestMovie1_bleach_reg. tif) som et test eksempel.
   2. Juster lysstyrken og kontrasten for å se de individuelle actomyosin signalene ved hjelp av bilde > justere ≫ lysstyrke/kontrast.
   3. Juster TLMs i samme retning i forhold til vevet/kropps aksen. I tilfelle av egg kamre, justere den fremre siden av egg kamre alltid til venstre for bilde/submovie/TLM før analysen.
   4. Del den valgte filmen i kort 30 s submovies og tid-prosjektet hver av dem. Lagre nontime og tids projisert submovies med tilsvarende navn. Behold den opprinnelige kilden.
      Merk: Submovies kan opprettes fra opprinnelige TLMs ved først å slette uønskede rammer via bilde > stabler > Slice Remover. Definer sektorene som skal fjernes, og angi Øk. Transformer til RGB før du bruker Slice Remover når økning = 1. For å tids projisere en 30 s submovie klikker du bilde > stabler > Z-Project > Max intensitet for de definerte rammene (sektorene), og klikk deretter OK. Hopp over hver andre 30 s submovie for å unngå å telle actomyosin signaler 2x i to påfølgende 30 s submovies.
   5. Plasser et tids projisert bilde ved siden av tilsvarende 30 s-submovie (figur 4a, B). Identifiser signallinjen på den tids beregnede submovie. Identifiser retningen til actomyosin signal bevegelse (0 ° – 360 °) langs denne linjen i den opprinnelige submovie ved å manuelt spille av submovie. Bruk Angle Tool (i Fiji bar) for å manuelt måle retningen av signal bevegelsen i forhold til den definerte vev aksen eller et lignende tilgjengelig verktøy.
      Merk: Fiji fungerer bare på en 0 °-180 ° skala (figur 4c), og en omberegning av de oppnådde verdiene til en 0 °-360 ° skala er nødvendig. En signal linje tilsvarer banen til en actomyosin signal bevegelse over tid.
   6. For å unngå duplisering i analysen av actomyosin signaler, Merk de analyserte signal linjene i cellene i det tids projiserte submovie (figur 4b, D).
   7. Analysere alle valgte celler i 30 s submovie og lagre de oppnådde vinkler.
      Merk: Analyser bare subcellulære cytoplasmatiske actomyosin signaler i celler med veldefinerte celle omriss gjennom en TLM. Ekskluder enkeltceller med mindre enn 15 – 20 oppdagede signaler i hele TLM. Ignorer actomyosin signaler som beveger seg over celler på grunn av deres ukjente opprinnelse. Et eksempel på signal teller for en analysert celle i 30 s submovie er vist i figur 4d.
   8. Fortsett til alle 30 s lange submovies av en TLM er analysert, og lagre alle målte vinkler av actomyosin signaler av en TLM i en regnearkfil.
   9. Oppsummer alle målte vinkler over det relevante antallet TLMs (avhengig av eksperimentet). Plot prosentandelen av retning av analysert actomyosin signaler, for eksempel som en rose diagram med et område fra 0 ° til 360 ° med en foretrukket programvare.
      Merk: For å få statistisk signifikante resultater, fem til ti uavhengige egg kamre av egg kammer scenen er anbefalt å bli analysert.

2. vev Scale

Merk: Å analysere og bilde in vitro kultivert Drosophila egg kamre, følger protokollen i supplerende fil 2. Hvis du vil analysere ervervet TLMs, fortsetter du med følgende protokoll nedenfor. Ledsaget test filer av TLMs er plassert i supplerende fil 3.

1. Selektiv overflate ekstraksjon av buede epitel vev
   Merk:Denne protokollen gjør det mulig for brukere å selektivt trekke ut et tynt lag med actomyosin i et buet epitel vev over tid. Denne protokoll trinnet er brukervennlig og basert på et intuitivt grafisk grensesnitt. Det er mulig å komfortabelt analysere (ekstrakt overflate) flere TLMs. Bruk TestMovie2. czi (fraTilleggsfil 3) som en test TLM eksempel.
   1. Åpne en oppdatert Fiji-program (fiji > hjelp ≫ oppdatering > gjelder endringer > OK).
   2. Kontroller at ellipsoiden Surface projeksjon plugin¹⁵ er installert. Følg Viktorinova et al. ¹⁶i den.
   3. Åpne en TLM og eksportere den som en XML/HDF5-fil ved å klikke Plugins > BigDataViewer > Export gjeldende bilde som XML/HDF5-fil.
      Merk: Det er nødvendig å definere en eksport bane. Lagringen i seg selv kan ta flere minutter og avhenger av TLM lengde.
   4. Åpne den eksporterte filen i ellipsoiden overflate projeksjon ved å klikke Plugins > BigDataViewer > ELLIPSOIDEN overflate projeksjon > Velg XML-fil.
      Merk: Et nytt vindu med sagittal visninger av eggkammeret og en dialog for å veilede brukeren gjennom behandlingen vil vises. Du finner mer informasjon om hvordan du navigerer i Slice-visningen på https://imagej.net/BigDataViewer.
   5. Dialogvinduet kalt eggstokkene projeksjon har flere kategorier. I den første dialogboksen som heter markeringsramme definerer du x-og y-grensene for et egge kammer i TLM sammen med z-bredden på markeringsrammen (dvs. dybden på en z-stack/egg kammer) og trykker på Set (figur 5a).
   6. Hvis du vil definere kantlinjer, drar du knapper ved siden av x, y og z, eller definerer tall koordinatene i x-, y-og z-boksene. Sørg for at grensene er sjenerøse nok til å få den delen av eggkammeret av interesse i overflaten utvinning. De valgte delene av eggkammeret er uthevet i rosa.
   7. Bytt til fanen " Finn boblene i vinduet" eggstokkene projeksjon. Definer Sigma og minimal topp verdi; trykk deretter databehandling for å identifisere de actomyosin signalene (figur 5B), som vises som grønne punkter. Prøv dette trinnet med forskjellige parametere til nok flekker (rundt 100) er funnet.
      Merk: Sigma 1 \ u20123 med minimal topp verdi 20 \ u2012100 fungerer best å identifisere actomyosin signaler av Stage-6 til-8 egg kamre. Identifisering actomyosin signaler er et avgjørende skritt og avhenger av signalkvaliteten og dens størrelse. Det er viktig å bekrefte riktig størrelse på de eksisterende boblene. Ingen synlige grønne flekker/klumper i bildet betyr at neste trinn ikke vil fungere. Bla gjennom de valgte z-flyene for å se boblene.
   8. Hvis du vil utforme ellipsoiden, fortsetter du med kategorien kalt Fit ellipsoiden. Sett tilfeldige prøver til 10 000, Utvendig/innvendig avskåret avstand til 1 \ u201210, og klikk deretter Beregn (figur 5c).
      Merk: Jo lavere cut-off avstand, jo mer presis ønsket ellipsoiden vil bli. Etter dette, kategorien kalt projeksjon vil automatisk åpne og tillater definisjonen av overflaten utvinning. Innstillingene må optimaliseres.
   9. Fortsett videre med kategorien kalt projeksjon (figur 5D). Sett opp en minimum og maksimum projeksjons avstand (dvs. bredden på ønsket ellipsoiden). Det er nødvendig å sette en minimal og maksimal projeksjon avstand slik at den rosa definerte ellipsoiden regionen inkluderer hele utsiden laget av eggkammeret. Definer avstanden til stykket (1 anbefales).
      Merk: Eksempler på feil og optimal ellipsoiden passform som resulterer i uriktige og optimale projeksjons parametre, vises i figur 6a, C. Den tynne circumferential lag av interessen kan defineres senere. Kontroller at den rosa delen av ellipsoiden med den definerte bredden på egge kammeret er synlig før du trykker databehandling. Det er viktig at den ønskede ellipsoiden (rosa enkelt linje) passer fint til ellipsoiden overflate av et egg kammer for å oppnå de beste resultatene. Hvis ellipsoiden passformen ikke er god, ordner du forskjellige innstillinger til ønsket overflate ekstraksjon er oppnådd.
      1. Angi en utgangs bredde (≥ 800) og høyde (≥ 400) av ellipsoiden. Sett fra hvilket tidspunkt punktet som tid peker på overflaten ekstraksjon skal opprettes (dvs. definere lengden på TLM ekstraksjon). Velg enten en sfærisk eller en sylindrisk projeksjon. Vend Z og Juster Y hvis nødvendig.
      2. Presse beregne å få en overflate trekking for begge to kanalene inne ny Vinduer alarmert Image. Juster lysstyrken og kontrasten til de oppnådde bilde vinduene for å kunne se de projiserte actomyosin signalene ved å klikke på bilde > justere ≫ lysstyrke/kontrast.
         Merk: Et eksempel på sammenligning av en projeksjon som skyldes feil og optimal ellipsoiden passform, vises i figur 6b, D.
   10. Hvis overflaten ekstraksjon ser bra ut, lagre bildene (begge kanaler separat) som. TIFF. I tillegg lagre loggvinduet filen for fremtidig referanse om hvordan overflaten av denne spesielle egg kammer ble ekstrahert.
       Merk: Dette er spesielt viktig informasjon hvis det utpakkede tynne laget skal returneres til sin opprinnelige utfoldet form (for utviklere bare).
   11. Flett kanalene med en foretrukket fargekode i Fiji.
       Merk: Hvis det er nødvendig, prosjektet valgte z-stack lag med actomyosin signaler. Projeksjon av valgte z-stack lag er nødvendig når oppkjøpet fokusere litt endringer over tid i en TLM. For best resultat, prosjekt ved de fleste en til to z-stack lag.
   12. Lagre resultatene som. TIFF-filer.
       Merk: Representative eksempler på tynne lag (selektiv basal og apikale overflate) som representerer myosin II (MRLC:: GFP) signal fra hårsekken epitel av kontroll og fat2 mutant egg kamre kan bli funnet i Figur 8.
2. Data behandling av en selektivt ekstrahert vevs overflate
   1. Bleach-rett TLMs å kompensere for intensiteten forfall av fluorescerende etiketter.
      1. Åpne Fiji. Åpne en TLM (for eksempel TestMovie2_extraction. tif fra tilleggsfilen 3) ved hjelp av fil > Åpne. Velg bildet for å åpne det.
      2. Du kan om nødvendig dele fargekanalene og konvertere dem til 16-biters bilder ved å klikke bilde > farge > delte kanaler. Konvertere kanalene å 16-bit profilen (fra 32-bit profilen) benytter Image > type > 16-bit.
      3. Utfør en bleke korreksjon på begge kanaler ved hjelp av bilde > Juster > blekemiddel korreksjon > enkelt forhold > bakgrunns intensitet 0,0.
         Merk: Hvis utilfredsstillende resultater er oppnådd, er det nødvendig å utforske hvilke korreksjon metoder i denne plugin passer best (for eksempel bruke histogram Matching i stedet for et enkelt forhold).
      4. Slå sammen kanalene fra de to bleke-korrigerte bildene ved å klikke på bilde > farge > slå sammen kanaler. Lagre det flettede bildet som en TIFF-fil ved å klikke fil ≫ Lagre som > TIFF.
         Merk: Juster kontrasten og lysstyrken for kanalene ved behov.
   2. Celle segmentering for å generere en celle maske for TLMs
      1. Hvis Fiji ikke allerede er åpent, åpner du det på nytt (og kontrollerer at det er oppdatert ved å klikke hjelp > oppdateringen ≫ bruke endringene > OK).
      2. Hvis dette ikke allerede er gjort, kan du laste ned makroen TissueCellSegmentMovie. ijm (http://adm.irbbarcelona.org/matlab/TissueCellSegmentMovie.ijm).
      3. Dra og slipp dette skriptet til Fiji. Åpne bleke-korrigert fil (f. eks TestMovie2_bleach. tif fra supplerende fil 3, se også 2.2.1).
      4. Split kanalene i bleke-korrigert fil ved å klikke bilde > farge > Split Channels. Juster membran kanalen for å sikre klare celle omriss ved å klikke på bilde > justere ≫ lysstyrke/kontrast.
      5. Kjør det opplastede skriptet på den aktive celle membran kanalen til den valgte TLM ved å trykke på ikonet Kjør i det åpne skriptet. Sett Gaussian Blur til 1,500. Angi følsomhet for celle gjenkjenning til-1, og klikk OK. Angi anslått støy toleranse til ~ 8 for TLMs anskaffet med 40x-objektiv, og klikk OK.
         Merk: For å få en fin celle maske, ikke endre disse parametrene ovenfor. For andre målsettinger kan det være nødvendig med ulike parametre. Den renere bakgrunnen i en TLM, den nedre estimert støy toleranse er nødvendig.
      6. En generert celle maske vises i den analyserte TLM og også i et nytt vindu kalt ParticleStack (G). I tillegg vises et lite vindu kalt handling kreves . Fra celle masken på TLM fokuserer du bare på celler i midten av TLM og velger de som kan gi fullstendige og veldefinerte konturer i hele TLM.
      7. Hvis merkede celler inneholder kunstige/ekstra celle omriss, bruker du flette verktøyvinduet kalt handling som kreves i TLM. For sistnevnte, følg instruksjonene i vinduet.
         Merk: Sørg for at celle omriss er veldefinerte og samsvarer med reelle cellemembraner i en TLM, da enhver upresisjonsverdier kan påvirke påfølgende analyser. Ytterligere tweaks og endringer, for eksempel fjerning av uønskede celler, kan gjøres senere ved hjelp av Surface Manager verktøyet (skissert i opplæringen nedenfor).
      8. Når utvalgte celler i midten stemmer overens med de virkelige cellemembraner, lagrer du ParticleStack som en TIFF-fil etter fil ≫ Lagre som > TIFF. Fortsett med å utføre lastingen av den genererte celle masken og den actomyosin analysen i Surface Manager som tidligere utført i seksjoner 1.1.3 og 1,2 (også beskrevet i detalj i seksjoner 2.2.3 og 2,3).
   3. Lasting av den genererte celle masken i Surface Manager
      1. Hvis Surface Manager-plugin-modulen allerede er installert i installasjonsprogrammet for Fiji, går du videre til trinn 2. Hvis ikke, følg Viktorinova et al.¹⁶. For utviklere, bare kildekoden er også tilgjengelig¹⁵.
      2. Åpne Surface Manager ved å klikke på plugin-moduler > Segmentering ≫ Surface Manager (3D).
         Merk: Surface Manager-vinduet viser flere handlingsknapper til høyre og et tomt vindu til venstre. Hvis du vil se alle handlingsknappene, kan det være nødvendig å strekke vinduet i høyden/bredden. Vær oppmerksom på at tidsrammer vil vises som z-stykker.
      3. Åpne den tilsvarende ParticleStack. TIF-filen i Surface Manager via fil > Åpne og velg bildet som skal åpnes (for eksempel ParticleStack2. tif fra tilleggsfilen 3).
      4. I Surface Manager klikker du på Les disposisjons bilde knappen og setter jacquard-indeksen til 60%.
         Merk: Det kan ta opptil flere minutter å laste inn en ParticleStack. tif-fil, avhengig av datamaskinens strømforbruk.
      5. Når den er lastet inn, vil hver celle tildeles med et S-nummer og vises i venstre del av Surface Manager-vinduet (figur 7a).
         Merk: Hvis du vil vise disposisjoner og cellenavn for alle cellene, merker du av for Vis alle og Vis etiketter nederst i Surface Manager-vinduet. Det anbefales å bruke denne funksjonen når cellenumrene er kontrollert for riktigheten.
      6. Klikk på det første S-tallet; den importerte celle disposisjonen fra ParticleStack. tif vises på TLM. Kontroller hvert importerte S-nummer for celle omriss kvalitet i hele TLM og fjern uønskede celler som viser feil celle omriss. For å gjøre dette, uthever du celle disposisjonen og klikker på knappen delete.
         Merk: Det er også mulig å korrigere for unøyaktige celle omriss og legge til nye celle omriss. Dette er beskrevet i diskusjons delen.
      7. Lagre alle korrigerte celler som en RoiSet. zip-fil ved å trykke på Lagre på disk -knappen.
         Merk: Hvis sesjonen må avbrytes, er det mulig å laste inn RoiSet. zip-filen i Surface Manager senere: åpne en TLM i Fiji via fil > Åpne og velg en TLM. Åpne Surface Manager på følgende måte: Plugins > Segmentering ≫ Surface Manager (3D). Last inn tilsvarende RoiSet. zip ved å klikke Last fra plate -knappen og velge den riktige RoiSet. zip-filen (for eksempel TestMovie2_RoiSet. zip). Dobbeltsjekk at de lastede celle maskene tilsvarer den lastede TLM.
3. Analyse av actomyosin pulser i Surface Manager
   Merk: Åpne Fiji, og kontroller at en TLM og den tilsvarende celle masken er åpen i Surface Manager. Kontroller at Fiji er installert og oppdatert, og at Surface Manager plugin-modulen (https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager) er installert.
   1. Åpne en TLM med fil > Åpne og velg en TLM for å åpne (f.eks. TestMovie2_bleach. tif). Last inn Surface Manager-plugin-modulen via Plugins > Segmentering ≫ Surface Manager (3D). Legg den lagrede celle masken opprettet i opplæringen her (f. eks, ParticlesStack2. tif) via fil > Åpne og velg en celle maske (f. eks, ParticlesStack2. tif). Last inn tilsvarende ROI (f. eks, TestMovie2_RoiSet. zip).
   2. Bytt til den kanalen som er interessert i den valgte TLM.
      Merk: For å skille mellom kanalene, følger du fargekoden som er angitt rundt TLM.
   3. Klikk statistikk -knappen i Surface Manager for å få tak i vinduet kalt gjennomsnittlig grå verdi Slice by Slice (figur 7b). Legg merke til at middelverdien/median intensitet verdier av actomyosin signaler i en gitt analysert kanal innenfor den definerte cellen skisserer over tid vil bli vist, samt andre parametre knyttet til celleområdet og celle form.
      Merk: Intensiteten verdiene er i A.U.; celleområdet er i piksler og må konverteres til firkantede mikrometer.
   4. Lagre oppnådde verdier som en regnearkfil: Klikk på statistikk vindu, fil ≫ Lagre som.
      Merk: Det er mulig å verifisere de oppnådde statistiske verdiene senere, som følger. Åpne blekemiddel-korrigert TLM i Fiji. Åpne Surface Manager. Belaste det tilsvarende RoiSet. zip å det TLM av trykker det belaste fra diskett knapp og åpen filen. Den lagrede masken med celle omriss blir lastet opp, og navnene på cellene vises i venstre Surface Manager-vindu. Klikk statistikk -knappen for statistiske verdier.
      Merk: Når det gjelder en manuell analyse av individuelle subcellulære actomyosin signaler, er det ikke mulig å utføre en manuell analyse av subcellulære actomyosin signaler i vevs vekten. Optimalisering er nødvendig for analyse av individuelle actomyosin signaler på semi-tissue skala, som uthevet i diskusjonen delen.

Representative Results

Denne protokollen gjør det mulig for forskere å undersøke atferden til actomyosin nettverk i epitel vev. Dette er bare mulig når en detaljert analyse av actomyosin atferd på den lokale mobilnettet skala (noen få celler) er kombinert med en lignende analyse på vev skala (mange celler). Men epitel vev er ofte buet og ekstraksjon av et tynt lag av disse vev var tidligere ikke lett mulig, som vist i Drosophila egg kamre (figur 1). Protokollen som presenteres her gir brukerne enkle instruksjoner som beskriver hvordan man analyserer actomyosin atferd på begge disse vektene (figur 2).

Den første delen av denne protokollen fokuserer på instruksjoner om analyse av actomyosin pulser ved hjelp av Surface Manager plugin (Figur 3). Den beskriver også hvordan du manuelt analyserer individuelle actomyosin atferd på den lokale mobilnettet skalaen (Figur 4). Den andre delen av denne protokollen forklarer hvordan du kan trekke ut et tynt lag av epitel vev ved hjelp av ellipsoiden overflate projeksjon plugin (figur 5 og figur 6). Bare da er det mulig å analysere actomyosin pulser på vevs skalaen ved hjelp av Surface Manager plugin (figur 7). Representative resultater og en sammenligning av actomyosin atferd i roterende kontroll og statisk fat2 mutant Drosophila egg kamre på den lokale cellulære og vevs vekten er vist i Figur 8 og i tilsvarende film 1, Film 2, film 3, film 4, film 5og film 6 (for detaljer, se Figur 8).

Figur 1: selektiv ekstraksjon av et tynt lag av en buet vev overflate. (A) for å få tilstrekkelig informasjon om actomyosin nettverk i circumferentially buet prolifererende, er det nødvendig å erverve en dyp z-stack (rosa) over flertallet av et synlig vev som vist for den buede hårsekken epitel (grå) av Drosophila egg kamre. (A ') Men en enkel projeksjon av en slik z-stack fører til blanding av hele actomyosin nettverk i hårsekken celler. Myosin II med MRLC:: GFP (grønn) viser sterkt uttrykker indre (apikale) regionen hårsekken celler i en slik z-projeksjon og nesten ingen informasjon fra basal (ytre) side, der myosin II viser en sterk Planar celle polaritet fenotype, men signal intensiteten er lav¹². For å unngå en slik blanding som vist i panel A ', har vi utviklet en brukervennlig, Fiji-basert plugin kalt ellipsoiden Surface projeksjon i BigDataViewer¹⁸ som tillater (B) selektiv ekstraksjon av et definert, tynt lag (rosa ) av actomyosin fra et buet epitel (B ') som vist for myosin II (grønn) i en valgt ekstraksjon av basal (ytre) side av hårsekken epitel. Sammenlign forskjellen i signal av myosin II (MRLC:: GFP) i paneler A ' og B '. Legg merke til Planar polarisert mønster av myosin II i panel B '. Celle konturene er i rødt. Den fremre side er til venstre. Scale bar = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: Planar polarisert actomyosin nettverk på lokale cellulære og vevs vekter. Imaging av actomyosin på ulike skalaer gjør det mulig å analyse av ulike antall epitelceller, nemlig (A) opp til 15 celler på den lokale cellulære skalaen og (B) 50-100 celler i vevet skala i hårsekken epitel av kultivert Drosophila egg kamre. Nonmuscle myosin II er i samsvar med MRLC:: GFP (grønn) og genotype av den brukte transgene-linjen er spesifisert i materialfortegnelsen. Celle konturene er i magenta. Den fremre side er til venstre. Skala stolper = 5 μm (A); 50 μm (B). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3: et eksempel på analysen av MYOSIN II pulser i Surface Manager på den lokale mobilnettet skala. (A) en partikkel stabel lastes inn i Surface Manager. Vær oppmerksom på at alle identifiserte celler i TLM vises i vinduet Surface Manager. Det er viktig å slette alle uønskede eller ufullstendige celler i en TLM. (B) statistikk innhentet på myosin II (MRLC:: GFP) for utvalgte celler er vist i vinduet kalt gjennomsnittlig grå verdi Slice by Slice i Surface Manager. MRLC:: GFP er vist i grønt mens cellulære membraner er i rødt. Den fremre side er til venstre. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4: et eksempel på manuell analyse av individuelle MYOSIN II-signaler på den lokale celle skalaen. (A) en valgt 30 s-lang submovie plasseres ved siden av (B) tids projeksjon. Merk at på tids anslaget viser myosin II (MRLC:: GFP) lengre bane linjer (se panel B) i enkeltceller enn i en individuell tidsramme (se panel A). Individuelle linjer i cellene skal analyseres for deres kantete retning i forhold til fremre-bakre akse av egg kamre. (C) Merk at Fiji ikke måler 0 ° – 360 °, men bare 0 ° – 180 ° for signaler som peker opp og 0 ° – 179 ° for signaler som peker ned. Vær oppmerksom på at 0 ° er algoritmeoppdatering plassert til høyre for et analysert bilde. (D) basert på denne informasjonen, linjer som beveger seg med (opp i rosa) eller mot (ned i gult) retningen av epitel rotasjonen i et bestemt egg kammer bør være binned å identifisere om symmetri bryte av analyserte signaler er til stede i en celle og deretter for flere celler i det analyserte vevet. MRLC:: GFP er vist i grønt mens cellulære membraner er i rødt. Den fremre side er til venstre. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5: et eksempel på å generere en ellipsoiden passer på vevs vekten. For å passe en ellipsoiden på et egg kammer ved hjelp av ellipsoiden overflate projeksjon plugin i BigDataViewer, er det nødvendig å definere (a) en markeringsramme som inkluderer flertallet av skannet vev. Deretter er det viktig (B) å identifisere signal prikker, som er en forutsetning for en optimal ellipsoiden Fit-generering. (C) når ellipsoiden passer ikke er optimal og ikke pent omgir et egg kammer, dette resulterer i (D) dårlig vev lag ekstraksjon. Se utvinning og senere projeksjon resultater i figur 6. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6: sammenligning av en feil og optimal ellipsoiden passform og tilsvarende overflate anslag. (A) når ellipsoiden ikke er riktig montert, (B) den endelige overflate projeksjon vil ikke gi fullstendige signal data i det tynne laget av det analyserte vevet. (C) imidlertid, når montert optimalt, garanterer det en lik signal deteksjon av et tynt lag i vevet. (D) Merk at den optimale overflate projeksjon inneholder flere tynne lag som en overflate-projisert z-stack over tid, som kan skilles senere som vist i Figur 8. Myosin II signaler (MRLC:: GFP, hvit) og membran signaler (hvit) er i utgangspunktet slått sammen før projeksjon (paneler A og C), men på overflaten projeksjon selv, disse kanalene er separert (se projeksjoner av myosin II i paneler B og D). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 7: et eksempel på analyse av MYOSIN II-pulser i Surface Manager på vevs vekten. (A) en partikkel stabel lastes inn i Surface Manager. Vær oppmerksom på at alle identifiserte celler i TLM vises i vinduet Surface Manager. Det er viktig å slette alle uønskede eller ufullstendige celler i en TLM. (B) statistikk innhentet på myosin II (MRLC:: GFP) pulser (middelverdi eller median) for valgte celler over tid vises i vinduet kalt gjennomsnittlig grå verdi Slice by Slice i Surface Manager. Merk at sterkere myosin II prikker kan påvirke den endelige mål på indre myosin II intensitet. Dette skyldes problemet at disse myosin II prikker kan se ut til å migrere utover celle disposisjonen der det er en feil celle disposisjons definisjon i den genererte celle masken. MRLC:: GFP er vist i grønt mens cellulære membraner er i rødt. Den fremre side er på toppen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 8: Representative resultatene av et MYOSIN II nettverk i Drosophila hårsekken epitel. Representative eksempler på Dynamic myosin II (MRLC:: GFP) atferd (A og B) på den lokale mobilnettet skala og (C-F) på vev skala for kontroll og fat2 mutant Drosophila egg Chambers. Se tabell over materialer for detaljert informasjon om brukte genotyper. Merk at MRLC:: GFP signaler (grønn) flytte vinkelrett på fremre-bakre (AP) aksen av kontroll egg kamre. Dette polaritet er tapt i fat2 mutant egg kamre og fører til ANISOTROP myosin II pulser/svingninger¹². Ved manuell analyse av små MRLC:: GFP signaler (~ 300 μm) og kvantifisering av deres kantete retningsbestemt bevegelse som beskrevet i protokollen, symmetri bryte av MRLC:: GFP signaler kan observeres med en preferanse mot retningen av epitel rotasjon i et analysert egg kammer¹² (Figur 4). Tilsvarende filmer er: panel A = film 1, panel B = film 2, panel C = film 3, panel D = film 4, panel E = film 5og panel F = Film 6. Celle omriss vises i magenta. Den fremre side er til venstre. Skala stolper = 5 μm (A og B) og 50 μm (C-F). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Anbefalte parametre for kort tids avbildning med høy hastighet ved lokal mobil skala:
I.	Vev av interesse fritt plassert i dyrking medium (dvs. ingen deksel slips, fleksible tepper, etc.)
Ii.	63x vann mål med numerisk blenderåpning > = 1,3
Iii.	Invertert konfokalmikroskopi mikroskop
Iv.	Enkelt fly
V.	6-12 tidsintervaller
Vi.	5-10 min TLMs
Vii.	Data lagringskrav per TLM opp til 100MB
Anbefalte parametre for lang tids bildebehandling med lav hastighet ved vevs vekten:
I.	Vev av interesse fritt plassert i dyrking medium (dvs. ingen deksel slips, fleksible tepper, etc.)
Ii.	40x vann mål og numerisk blenderåpning > = 1,3
Iii.	Invertert roterende plate mikroskop
Iv.	z-stabler å erverve ca. halvparten av et egg kammer
V.	60 tidsintervaller
Vi.	Minst 30 min TLMs
Vii.	Krav til data lagring ca. 1 GB

Tabell 1: anbefalte bildeparametere.

Film 1: representative dynamisk oppførsel av MYOSIN II (MRLC:: GFP) på celle skalaen i en kontroll Drosophila egg kammer. Merk at MRLC:: GFP (grønn) foretrekker å flytte vinkelrett på AP aksen av egg kamre. Celle omriss er i magenta. Basal visning. Den fremre side er til venstre. Scale bar = 5 μm. Vennligst klikk her for å se denne videoen. Høyreklikk for å laste ned.

Film 2: representant dynamisk oppførsel av MYOSIN II (MRLC:: GFP) på mobilnettet skala i en Fat2 mutant Drosophila egg kammer. Merk at MRLC:: GFP pulser (grønn) og er ikke lenger Planar justert vinkelrett på AP aksen av statiske egg kamre. Celle omriss er i magenta. Basal visning. Den fremre side er til venstre. Scale bar = 5 μm. Vennligst klikk her for å se denne videoen. Høyreklikk for å laste ned.

Film 3: representant dynamisk oppførsel av basal MYOSIN II (MRLC:: GFP) på vev skala i en kontroll Drosophila egg kammer. Merk at bare en tynn basal (ytre) MRLC:: GFP laget er Hentet fra nesten halvparten av hårsekken epitel av et egg kammer. MRLC:: GFP er i grønt og celle omriss er i magenta. Legg merke til forskjellen i detaljnivået av den oppnådde MRLC:: GFP signal atferd her (som representerer vevet skala) i forhold til film 1 (som representerer den cellulære skalaen). Den fremre side er til venstre. Scale bar = 50 μm. Vennligst klikk her for å se denne videoen. Høyreklikk for å laste ned.

Film 4: Representative dynamisk oppførsel av basal MYOSIN II (MRLC:: GFP) på vevet skala i en Fat2 mutant Drosophila egg kammer. Merk at MRLC:: GFP (grønn) pulser sterkt på basal siden av nesten halvparten av hårsekken epitel av en fat2 mutant egg kammer og unnlater å generere synkronisert kraft som kreves for å fremme epitel rotasjon. Celle omriss er i magenta. Den fremre side er til venstre. Scale bar = 50 μm. Vennligst klikk her for å se denne videoen. Høyreklikk for å laste ned.

Film 5: Representative dynamisk oppførsel av apikale MYOSIN II (MRLC:: GFP) på vev skala i en kontroll Drosophila egg kammer. Bare en tynn MRLC:: GFP laget er Hentet fra apikale (indre) side av nesten halvparten av hårsekken epitel av et egg kammer. Merk at MRLC:: GFP (i grønt) viser ulike dynamiske atferd her på apikale side i forhold til basal siden av hårsekken epitel (som vist i film 3). Celle omriss er i magenta. Den fremre side er til venstre. Scale bar = 50 μm. Vennligst klikk her for å se denne videoen. Høyreklikk for å laste ned.

Film 6: representant dynamisk oppførsel av apikale MYOSIN II (MRLC:: GFP) på vev skala i en Fat2 mutant Drosophila egg kammer. Endret dynamisk oppførsel av MRLC:: GFP (grønn) Hentet fra en tynn apikale område på nesten halvparten av hårsekken epitel av en statisk fat2 mutant egg kammer. Celle omriss er i magenta. Den fremre side er til venstre. Scale bar = 50 μm. Vennligst klikk her for å se denne videoen. Høyreklikk for å laste ned.

Discussion

Kritiske trinn og feilsøking for disseksjon og dyrking av egg kamre

Hvis for mange fluer er plassert i et lite hetteglass, kan fly mat slå gjørmete etter 2-3 dager på grunn av omfattende mengder fôring larver og voksne fluer får fanget i fly mat. I et slikt tilfelle, Vend resten av disse fluene inn i en ny hetteglass med fersk mat og downsize deres antall. Spesielt utelukke kvinner som ble sittende fast i maten.

Schneider mix (SM) bør tilberedes på forhånd og kan oppbevares ved 4 ° c i ~ 14 dager. Vær oppmerksom på at en eldre blanding kan inneholde krystaller som kan skade overflaten av egg kamre. Bland alltid SM med fersk tilsatt insulin og la det tilstrekkelig tid til å nå romtemperatur. Dette beskytter egg kamre mot kuldesjokk, som kan ha en negativ innvirkning på veksten av mikrotubuli og Planar justeringen av cytoskeleton (som sett i utviklingsland Drosophila ving¹⁹).

Egg kamre og utvalgte ovarioles er svært skjøre, og på grunn av sin lille størrelse, kan flyte i SMI (SM med insulin). Det anbefales å la dem spontant synke i SMI. De har også ofte holde seg til disseksjon tang/kaktus verktøyet. I et slikt tilfelle, la dem slippe seg selv fra disseksjon enheter ved å forsiktig flytte dem i SMI. Unngå å klemme og berøre dem direkte til enhver tid. Om nødvendig, utelukke disse egg kamre/ovarioles fra den videre protokollen.

Som en disseksjon stereoscope er ikke pålitelig for identifisering av skadede egg kamre/ovarioles, egg kamre/ovarioles bør sjekkes ved hjelp av en CellMask eller FM 4-64 fargestoff under en konfokalmikroskopi/spinning disk mikroskop. Skadet egg kamre viser ekstreme fargestoffer i forhold til en uskadet egg kammer vev bakgrunn. Aldri erverve en TLM med sterke fargestoff patcher.

Kritiske trinn og feilsøking for in vitro Live Imaging av egg kamre

Hvis fritt plassert egg kamre i SMI fortsatt flytte, sjekk igjen under konfokalmikroskopi mikroskop for å se om det fortsatt er noen oversett rester av muskel ark og rusk flytende i SMI. Fjern dem og prøv på nytt. Av egget kamre, bør 90% være stabile og Immobile under påfølgende Imaging.

For å være sikker på at et valgt egg kammer/ovariole er stabilt, bruk høyhastighets bildebehandling (6 s intervaller) i 1 min. ustabilt egg kamre ville flytte på dette punktet. Det anbefales imidlertid å se hele time-lapse innspillingen for å kunne forsiktig korrigere en potensiell uventet bevegelse av avbildet egg kammer. Dette kan gjøres ved å flytte mikroskopisk stadium/tabell, som holder Petri parabolen med kultivert egg kamre/ovarioles, til den opprinnelige posisjonen slik at egget kammeret av interessen er igjen i avbildet, fokusert vindu.

Stopp bildebehandling hvis en plutselig og uventet bevegelse av avbildet egg kammer vises. Kontroller dempingen av mikroskop bordet, og unngå å vandre rundt ved mikroskopet i løpet av anskaffelses tiden da dette kan føre til avbrudd i bildet oppkjøpet på grunn av vibrasjoner forårsaket.

Hvis cellemembranen fargestoff er ikke synlig etter 30 min og den brukte laserlinjen er riktig, legge til mer av fargestoff og øke konsentrasjonen for neste oppkjøpet.

Hvis de actomyosin signalene ser ut til å være uklare, må du kontrollere NA for målet som brukes. En NA lavere enn 1,3 vil redusere bildekvaliteten. I tillegg må du kontrollere at brukt nedsenking olje har blitt brukt riktig til vann 63x objektiv. Legg til eller Erstatt den om nødvendig.

Hvis egget kamre krympe og observerte cellemembraner deformeres, sjekk om lokket er riktig lukket. Hvis lokket mangler eller ikke er riktig lukket, kan egge kamrene tørke ut på grunn av SMI fordampning over anskaffelses tiden.

Hvis rotasjonen av egg kamrene bremser ned eller stopper, Reduser laser strømmen. Hvis et hull vises i eggkammeret, har det blitt brent av laseren. Reduser laser strømmen.

Hvis actomyosin signaliserer blekemiddel etter 2 minutter under TLM-oppkjøpet, reduserer du laser strømmen og øker signal forsterkningen i mikroskop programvaren.

Når en TLM av hårsekken epitel av ett egg kammer er ervervet, er det anbefalt å unngå Imaging igjen i samme vev regionen av denne egg kammer. Men som egg kamre roterer rundt AP-aksen, er det mulig å gjenta oppkjøpet av en TLM bruker denne uskadet egg kammer etter circa 30 min. Mens Imaging hårsekken epitel i ett egg kammer, vil andre egg kamre ikke bli bleket/skadet selv om de er plassert i samme ovariole eller i en annen ovariole i SMI.

Hvis alle disse kravene er oppfylt, prosentandelen av vellykket avbildet egg kamre bør være circa 90%-100% for etapper 6-8, circa 50%-60% for etapper 3-5, og circa 20%-30% for etapper 1--2. Svikt er hovedsakelig på grunn av bevegelse av egg kamre eller skade på dem under deres disseksjon/manipulasjon.

Kritiske trinn og feilsøking for databehandling

Under maske generasjon ved hjelp av den med følgende skriptet i Fiji, kan det skje at det er mange genererte celle omriss som ikke reflekterer den faktiske cellemembraner i en TLM. Dette er ofte forårsaket av høy bakgrunnsstøy, spesielt når fargestoffer til flekken cellemembraner brukes. I et slikt tilfelle, for å unngå den kjedelige korreksjon av uønskede celle omriss i den genererte masken, kjøre segmentering igjen og sette parametrene til best mulig passform. Dette kan gjøres ved å justere den anslåtte støy toleranse parameteren.

Når du laster inn en av ParticleStack. TIF-filer som inneholder celle disposisjoner i Surface Manager, laster tiden skalerer lineært med antall celle omriss og kan ta flere minutter. Hvis lastingen avbrytes eller er feil, gjentar du det. Sikre det det sender vindu er inne fokusere og ingen andre program er anvendt.

Noen ganger må en celle omriss rettes i noen rammer; i et slikt tilfelle, bruk pensel knappen. Tegn riktig celle omriss i en bestemt ramme ved å dra musen rundt cellemembranen. Flytt til en annen ramme i TLM, og gå deretter tilbake til tidsrammen med rettelsen: feil celle disposisjonen skal nå erstattes. Deretter går du til neste ramme for å rette opp den. Pensel verktøyet vil nå bytte til slettemodus. Om nødvendig retter du opp konturene i neste tidsramme ved å skyve eksisterende celle omriss og deretter trykke på + Legg til-knappen for å opprette en ny celle disposisjon. Slett det gamle S-nummeret fra Surface Manager-vinduet, og gi nytt navn til den nye celle disposisjonen ved å trykke på Rename -knappen om nødvendig.

Hvis en hel viktig celle mangler i en TLM, oppretter du en ny maske disposisjon ved å trykke på Opphev merkingen > polygon. Lag en ny celle disposisjon i det første bildet i TLM ved å klikke langs cellemembranen. Deretter går du til den siste rammen i TLM og gjør det samme for den valgte cellen. Ved å kjøre filmen i tide, vil celle konturene bli interpolert. Riktig med pensel verktøyet om nødvendig. Når du er ferdig, trykker du på + Legg til -knappen og endrer navn på celle disposisjonen ved å trykke på Rename -knappen. Jo flere poeng/Klikk for å lage en ny celle omriss, jo bedre interpolering fungerer.

Foruten epitel rotasjon, TLMs er noen ganger påvirket av uønsket bevegelse. Derfor er det anbefalt å korrigere for slike vev drift i disse TLMs. Ved å gjøre dette, TLMs er også korrigert for epitel rotasjon av egg kamre, og cellemembraner blir stive. Dette gjør manuell analyse av actomyosin signaler enklere. Men en slik tilnærming ikke tillater forskerne å skille om de observerte actomyosin signalene beveger seg eller er statiske i forhold til cellemembranen. Hvis et skille mellom statiske og aktive bevegelser av actomyosin signaler er målet for en slik analyse, bør ingen vev drift korreksjon brukes. Vi fant at flertallet av actomyosin signaler aktivt flytte i forhold til cellemembranen og bare en mindre del av dem vises statisk.

Kritiske trinn og feilsøking for analyse av subcellulære actomyosin signaler

Hvis statistikken som genereres, inneholder outliers, må du sørge for at eventuelle svært lave eller høye verdier i forhold til hele datasettet gjenspeiler virkelig atferden i cellen og ikke artefakter. Dette kan gjøres ved å identifisere cellen som inneholder outliers og se etter celle omriss kvalitet på tidspunktet da lav/høy verdi ble målt. Ofte er slike ekstreme verdier resultat av defekte celle omriss som feilaktig måler en del av en annen celle. Dette kan være spesielt tydelig når store klumper forstyrrer celle omrisset til en nærliggende celle. I et slikt tilfelle er det avgjørende å korrigere celle konturene og gjenta målingen.

For å gjøre kvantifisering enklere, analysere signalene i en bestemt celle overflate og fortsette en etter en til alle cellene er analysert i en submovie. Resultatene av manuell analyse av subcellulære actomyosin signaler kan ikke vise symmetri bryte i en celle og en bestemt egg kammer. Vi opplevde at actomyosin ikke klart bryte symmetri i forhold til vev bevegelse i < 10% av den roterende egg kamre (etapper 6-8). Denne prosentandelen økes rundt trinn 4¹². Vi fant også at det er ingen forskjell om 5 min eller 10 min er analysert i identifisering av den foretrukne retningen av actomyosin signal bevegelse i et egg kammer¹².

Kritiske trinn og feilsøking for selektiv ekstraksjon av actomyosin signaler fra buet vev

Feil størrelse på boblene (identifiserte signaler) vil ikke resultere i noen av boblene, og programmet vil fryse i neste trinn. I dette tilfellet, Force-avslutte Fiji og nylig starte plugin ellipsoiden Surface projeksjon. Gjør det samme når programmet ikke reagerer når du trykker på Beregn. Dette er ofte en indikasjon på at ikke egnede parametre er valgt.

Hvis det er for mange klumper og/hvis de er konsentrert mot den ene siden av det analyserte eggkammeret, kan dette påvirke den utformede ellipsoiden og ikke gi riktig passform til egge kammeret. Gå tilbake til BLOB identifikasjon og prøve å arrangere sin størrelse i kombinasjon med x-, y-, og z-aksen valg av egget kammeret. En unnlatelse av å generere en god ellipsoiden passer også ofte oppstår når uegnet cut-off avstandsinnstillinger brukes.

Anslagene innhentet kan noen ganger ser misfocused, eller kanskje den oppnådde z flyet faktisk beveger seg mellom celle lag nær overflaten av egget kammeret. Dette er vanligvis et tegn på en dårlig montering ellipsoiden der en region av ellipsoiden er satt for langt fra egget kammeret. Prøv å passe ellipsoiden slik at den opprettholder samme avstand fra egget kammer omkretsen.

Begrensninger av metoden og romanen tilnærminger

Denne gratis dyrking av egg kamre utelater subtile flatere av et egg kammer overflate. For dette formål har denne metoden sine fordeler og ulemper. Når benytter konfokalmikroskopi mikroskopi, den skaffer brukernes med høy-resolution og høy-fart tenkelig det pålitelig avdekker actomyosin opptreden inne celler for omkretsen av egge kamre for en kort perioden (5 – 10 min). Men ved å gjøre dette, begrenser det størrelsen på et enkelt fly som kan bli avbildet med konfokalmikroskopi mikroskopi over tid. Generelt er det mulig å bilde opp til ~ 15 celler per egg kammer på stadier 6-8 men bare om lag to celler i egg kamre på trinn 1-5. Derfor har vi definert denne metoden her som passer bare for den lokale mobilnettet skala.

For å overvinne disse størrelsesgrensene som er forårsaket av den begrensede størrelsen på et enkelt konfokalmikroskopi fly, har vi utviklet en alternativ Fiji-basert tilnærming som kalles ellipsoiden overflate projeksjon, for bruk på vevs vekten. Dette kombinerer spinning plate mikroskopi med en semi-interaktiv overflate utvinning av egg kamre i vevet skala. På denne måten kan actomyosin signaler fås på samme tid for mer enn 50 – 100 celler fra en analysert egg kammer. Det er viktig å merke seg at denne tilnærmingen genererer svært store datasett av ervervet data (~ Giga bytes), har en lavere oppløsning (den bruker en 40x g. en 63x mål), og gir også en tregere Imaging hastighet (det tar ~ 60 s for å skanne gjennom halvparten av vevet i et egg Cham [trinn 6 – 8] og, som sådan, er det 10x langsommere enn den begrensede konfokalmikroskopi fly metoden).

Sammenlignet med andre eksisterende programvare for utpakking lagdelt anslag fra parametrisk overflater, det plugg utviklet for denne protokollen er fokusert på brukervennlighet og interaktive visuelle tilbakemeldinger på hvert trinn i prosessen. Andre verktøy, slik som MATLAB-baserte ImSaNE²⁰, brukt av Chen et al.²¹, fokus på håndtering av et bredt utvalg av parametrisk og nonparametrized overflate modeller og ulike projeksjon metoder. ImSaNE krever for eksempel at data skal preprocessed og justeres på en bestemt måte og delvis krever eksterne verktøy i mellomliggende trinn. I kontrast, plugin som presenteres her håndterer alle 3D/4D/5D bilde (sekvens) som kan åpnes i Fiji uten ekstern forbehandling. Mens ImSaNE er svært konfigurerbar (programmerbar) ved å redigere MATLAB-skript, gir vi et minimalt sett med alternativer i en arbeidsflyt som er skreddersydd til det spesifikke problemet som diskuteres her. Hvert trinn i den interaktive arbeidsflyten gir resultater som umiddelbart kan inspiseres visuelt og justeres om nødvendig.

Beslutningen om hvilke av disse Imaging tilnærminger, den lokale cellulære eller vev skala, er det beste for et bestemt eksperiment, avhenger utelukkende på det vitenskapelige spørsmålet som skal besvares (dvs. høyere kontra lavere oppløsning, kort kontra lang oppkjøps tid). Et godt kompromiss mellom disse to skalaer kan være å kombinere begge tilnærminger, og dermed få Imaging av actomyosin signaler på semi-vev skala (dvs. 20-30 celler). Dette krever en roterende plate mikroskop, en vann 63x linse med NA ≥ 1,3, og etablerte z-stack innstillinger for 20-30 celler i et egg kammer. Denne mye grunnere z-stakken (i motsetning til z-stakken kreves for oppkjøpet av halvparten av et egg kammer) gir raskere skanning av under 60 s. Tiden fikk her kan brukes enten for gjentatt z-stack oppkjøpet å fremskynde Imaging eller for et eksempel på utvinning (tid mellomlegg) mellom individuelle z-stabler. Med sistnevnte, en lengre oppkjøp tid (> 30 min) av TLMs av roterende egg kamre kan oppnås. Denne semi-tissue tilnærming garanterer en tilstrekkelig oppløsning for actomyosin signaler og Imaging av flere celler på samme tid over lengre tidsperioder.

Fremtidige applikasjoner og visjon

Begge beskrevne metoder (på den lokale cellulære og vev skala) gir en enkel og rimelig tilnærming (unntatt mikroskop enheter) med begrenset bivirkninger på actomyosin nettverket og kan implementeres og enkelt vedtatt for andre dissekert dyr vev. Den eneste forutsetningen her er en eksisterende dyrking protokoll i en Petri parabol for en buet vev av interesse, tilgjengelig transgenes, og markører eller merking metoder.

I kombinasjon med lys-ark fluorescens mikroskopi²², er det også mulig å bilde actomyosin maskiner i Toto (dvs. bildet den komplette ytre circumferential overflaten av Drosophila egg kamre samtidig, og deretter senere utfolde seg ved hjelp av plugin ellipsoiden Surface Extraction). Det er imidlertid noen begrensninger som må løses i form av egnethet for høyhastighets avbildning av actomyosin signaler, nemlig 1) innebygging av egg kamre i et lavt punkt smelter agarose eller deres stikker til en kapillær under Imaging; II) en lav numerisk blenderåpning av brukte vann linser som ikke gir tilstrekkelig actomyosin signal oppløsning; III) den ekstra tiden som trengs for å erverve flere vinkler av egg kamre, som hindrer høyhastighets Imaging.

For å oppnå dette, er det forutsigbar at med foredling av mikroskop parametre som for eksempel hastigheten til å skanne gjennom epitel vevet og forbedring av brukte mikroskopiske linser, vil den detaljerte analysen av actomyosin maskiner, i fremtiden, aktivere lovende høyoppløselige resultater som skal oppnås ved vev og i Toto skala over lang tid perioder.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Schneider Medium	Gibco	21720-024	[+]-Glutamine
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122	[+] 10.000 Units/mL Penicillin [+] 10.000 µg/mL Streptomycin
Fetal Bovine Serum	Sigma	F135	Heat inactivated
Insulin Solution Human	Sigma	I9278
50 mL Falcon tubes	Eppendorf		sterile
Millex-GV filter	Millipore	SLGV033NS	33 mm
Glass Bottom Microwell Dishes	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C	35 mm Petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 cover glass
Forceps	A. Dumont & Fils		#55
CellMask Deep Red (cell membrane dye)	Invitrogen	C10046
FM4-64 (cell membrane dye)	ThermoFisher/Invitrogen	T13320
Depression dissection slide	Fisher Scientific	12-560B
Microscopic equipment
Steromicroscope	e.g. Zeiss		Stemi SV 6
Inverted confocal microscope	e.g. Zeiss/Olympus
Spinning disc microscope	e.g. Zeiss/Andor
Microscopic glass/cover glass	e.g. Thermo Scientific/Menzel Glas
Cactus tool
Wironit needle holder	Hammacher	9160020
Cactus spine	Echinocactus grusonii/barrel cactus
Drosophila stocks used in the manuscript
AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP			For detail see Rauzi et al.: Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodeling. Nature 2010, Vol. 468, pg. 1110-1115.
AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP; fat258D/fat2103C			For detail see Viktorinova et al.: Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations. PLoS Genetics 2017, Vol. 13, Issue 11, pg. e1007107.