Developmental Biology

Análisis de la dinámica de Actomyosin en escalas celulares y de tejidos locales utilizando películas de lapso de tiempo de cámaras de huevo de Drosophila cultivada

Published: June 3, 2019 doi: 10.3791/58587

Ivana Viktorinová^1,2, Robert Haase*^1,2, Tobias Pietzsch*^1,2, Ian Henry^1,2, Pavel Tomancak^1,2

¹Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics, ²Center for Systems Biology Dresden

* These authors contributed equally

Summary

Este protocolo proporciona una metodología fácil de usar basada en Fiji junto con instrucciones sencillas que explican cómo analizar de manera confiable el comportamiento de la actomiosina en células individuales y tejidos epiteliales curvos. No se requieren habilidades de programación para seguir el tutorial; todos los pasos se realizan de forma semi-interactiva utilizando la interfaz gráfica de usuario de Fiji y los plugins asociados.

Abstract

Los óvulos inmaduros de Drosophila se llaman cámaras de huevo, y su estructura se asemeja a órganos primitivos que sufren cambios morfológicos de una forma redonda a una forma elipsoides durante el desarrollo. Este proceso de desarrollo se llama oogénesis y es crucial para generar huevos maduros funcionales para asegurar la próxima generación de moscas. Por estas razones, las cámaras de huevo han servido como un modelo ideal y relevante para entender el desarrollo de órganos animales.

Se han desarrollado varios protocolos de cultivo in vitro, pero hay varias desventajas en estos protocolos. Se trata de la aplicación de varias cubiertas que ejercen una presión artificial sobre las cámaras de huevo con imágenes con el fin de inmovilizarlas y aumentar el plano de adquisición de la superficie circunferencial de las cámaras de huevo analizadas. Tal enfoque puede influir negativamente en el comportamiento de la delgada maquinaria de actomiosina que genera el poder de girar las cámaras de huevo alrededor de su eje más largo.

Por lo tanto, para superar esta limitación, cultivamos las cámaras de óvulos Drosophila libremente en los medios de comunicación con el fin de analizar de forma fiable la maquinaria de actomiosin a lo largo de la circunferencia de las cámaras de óvulos. En la primera parte del protocolo, proporcionamos un manual que detalla cómo analizar la maquinaria actomiosina en un plano de adquisición limitada a escala celular local (hasta 15 células). En la segunda parte del protocolo, proporcionamos a los usuarios un nuevo complemento basado en Fiji que permite la extracción simple de una capa delgada definida de la superficie circunferencial de las cámaras de huevo. A continuación, el siguiente protocolo describe cómo analizar las señales de actomiosina a la escala tisular (>50 células). Finalmente, identificamos las limitaciones de estos enfoques tanto en las escalas celulares y tisulares locales como en su posible desarrollo futuro y posibles aplicaciones.

Introduction

El desarrollo continuo de nuevas tecnologías de imagen y software con aplicaciones en las ciencias de la vida ha proporcionado un enorme impacto en la comprensión de los principios básicos de la vida. Uno de los principales desafíos es la visualización fiable de los procesos de desarrollo en combinación con sus imágenes en vivo en diversos tejidos. Los tejidos son partes de órganos y cuerpos y, como tales, la mayoría no son fácilmente accesibles para la toma de imágenes. Por lo tanto, se han desarrollado protocolos que permiten su disección y el cultivo in vitro con el fin de visualizar eventos biológicos que reflejan suficientemente la situación in vivo dentro de un cuerpo vivo.

Durante las últimas décadas, el cultivo y la toma de imágenes en vivo de las cámaras de óvulos Drosophila, estructuras similares a los acinares que se asemejan a órganos primitivos, ha contribuido inmensamente a la comprensión de los principios básicos del desarrollo primitivo de órganos¹ ^, ² ^, ³. Actualmente, hay varios protocolos de cultivo disponibles, y su uso depende del tiempo de adquisición, el tipo de celda a la imagen y su accesibilidad (por ejemplo, línea germinal interna frente a línea somática externa)⁴.

Una característica común en todos estos protocolos de cultivo es la necesidad de la inmovilización de cámaras de huevo analizadas que muestran una alta actividad contráctea en medios líquidos. La actividad contráctea de las cámaras de huevo es causada principalmente por la hoja muscular que cubre una larga cadena de cámaras de huevo conectadas^5,⁶^,⁷. Por lo tanto, para lograr la inmovilización adecuada de las cámaras de huevo joven, se han desarrollado varios enfoques, que implican cubrir las cámaras de huevo con cubretapas⁶^,⁸^,⁹ o mantas flexibles⁴^, ¹⁰ o incrustarlos en agarosa de punto bajo³^,¹¹. Estos enfoques son populares, ya que también permiten la toma de imágenes de un plano visual más grande debido al aplanamiento sutil de la superficie circunferencial de las cámaras de huevo.

Sin embargo, recientemente, se ha demostrado que las cámaras de huevo joven (etapa 1-8) giran alrededor de su eje anterior-posterior⁶ y que este movimiento tisular es impulsado por una fina red de actomiosina cerca de la superficie circunferencial de estas cámaras^{de huevo jóvenes 12}. Por lo tanto, la alteración artificial de la superficie celular causada por un aplanamiento sutil de este tejido puede tener un impacto negativo en el comportamiento de la maquinaria de actomiosina generadora de fuerza. El contrapunto es que si el tejido de la cámara de óvulos no se aplana, la imagen microscópica de proteínas en la superficie circunferencial de las cámaras de óvulos se vuelve aún más limitada por la disminución del tamaño del plano de adquisición.

Por lo tanto, hemos combinado protocolos de Prasad et al.⁹ y el laboratorio de Celeste Berg⁴^,¹⁰ y los hemos modificado para que no se utilice ninguna manta/agarosa flexible en el método desarrollado. Las cámaras de huevo drosofilia se cultivan libremente en los medios de comunicación y el protocolo que se presenta aquí sólo se aplica a la microscopía invertida. Hay dos partes en el protocolo. La primera parte se centra en el análisis de señales de actomiosina a escala celular local (hasta 15 células) dentro de las cámaras de óvulos. En la segunda parte, nos centramos en superar las limitaciones asociadas con un pequeño plano de adquisición causados por el cultivo libre de cámaras de huevo. En este sentido, hemos desarrollado un nuevo método computacional basado en Fiji con una interfaz gráfica de usuario semiinteractiva que extrae selectivamente y despliega capas definidas de una superficie de tejido circunferencial. Esto es seguido por un protocolo que describe cómo analizar la actomiosina a la escala tisular (es decir, >50 células). Como la extracción selectiva de una capa delgada definida de tejidos epitelialescurvos no ha sido fácilmente posible utilizando una proyección clásica de la pila z (Figura 1), este método fácil de usar sirve como un requisito previo importante para entender comportamiento de una red de actomiosina delgada (<1 m) a la escala tisular en las cámaras de óvulos de Drosophila.

Además, para facilitar el protocolo, proporcionamos películas de lapso de tiempo (TM) de ejemplo y archivos de muestra de comportamiento Myosin II convencional no muscular etiquetado fluorescentemente (consulte Archivo complementario 3). La miosina II es una proteína motora y representa la parte contrácta activa de la maquinaria actomiosina. Para la imagen de Myosin II, utilizamos líneas transgénicas Drosophila que contienen una cadena de luz reguladora modificada de Myosin II llamada MRLC::GFP (ver Tabla de Materiales para más detalles)¹²^,¹³. Para visualizar las membranas celulares, el protocolo se basa en destisos comerciales (ver Tabla de Materiales). Este protocolo es adecuado no sólo para el análisis de pequeñas señales subcelulares MRLC::GFP^12, sino también para cualquier partícula subcelular de tamaño similar alrededor de 300 m, como las observadas con Life-Act::GFP¹²^,¹⁴.

Aunque ambos protocolos se presentan utilizando cámaras de huevo Drosophila cultivadas in vitro, la adquisición de señales de actomiosina también se puede realizar utilizando otros tejidos tras la optimización de los medios de cultivo y dependiendo de la disponibilidad proteínas etiquetadas fluorescentes con los colorantes comerciales correspondientes o, por ejemplo, microinyecciones de ARNm para obtener perfiles transitorios de expresión génica. Del mismo modo, el protocolo basado en Fiji para la extracción de una capa delgada de una superficie circunferencial se puede aplicar de forma más general a tejidos elipsoides y similares a órganos.

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Protocol

NOTA: El siguiente protocolo proporciona instrucciones sobre cómo analizar la actomiosina en la celular local y la escala tisular en las cámaras de óvulos Drosophila. El enfoque a escala local permite a los usuarios analizar el comportamiento detallado de la actomiosina en hasta 15 células por cámara de óvulos y requiere la adquisición de TLM sin antes (5-10 min) mediante el uso de imágenes de alta velocidad y un microscopio confocal invertido. Por el contrario, la escala tisular proporciona a los usuarios información de actomiosina en 50–100 células y requiere la adquisición de TLM durante un largo período de tiempo (30 min) mediante el uso de imágenes de baja velocidad y un microscopio de disco giratorio invertido (ver Figura 2 y parámetros recomendados en cada escala del Cuadro 1). La decisión a qué escala analizar las señales de actomiosina depende enteramente de la cuestión científica del usuario. Los TMN de prueba acompañados deben ayudar a tomar esta decisión.

1. Escala celular local (LCS)

NOTA: Para diseccionar e imaginar cámaras de huevo Drosophila cultivadas in vitro, siga el protocolo descrito en Archivo Suplementario 1. Para analizar los TlM adquiridos, continúe con el siguiente protocolo. Los enlaces a los archivos de prueba adjuntos de TlM se proporcionan en el archivo complementario 3.

Procesamiento de datos de TLM a escala celular local (LCS)
1. Corrección de lejía de TLMs para compensar la decadencia de intensidad de las etiquetas fluorescentes
  1. Asegúrese de que una aplicación actualizada de Fiji está instalada en el equipo que se utiliza siguiendo estas instrucciones: Fiji > Abrir un TLM (por ejemplo, TestMovie1.tif desde el archivo complementario 3).
  2. Divida los canales de color haciendo clic en Imagen > Color > Dividir canales.
  3. Realice una corrección de lejía en ambos canales utilizando Imagen > Ajustar > Corrección de lejía > Relación simple > Intensidad de fondo 0.0.
    NOTA: Si se obtienen resultados insatisfactorios, explore qué métodos de corrección en este plugin se ajustan mejor (por ejemplo, utilice Histograma coincidencia en lugar de una relaciónsimple).
2. Segmentación celular para generar una máscara de celda para TLMs
  1. Si Fiji aún no está abierto, vuelva a abrirlo (y asegúrese de que está actualizado) siguiendo la Ayuda > Actualización > Aplicar cambios > Aceptar.
  2. Si esto aún no se ha hecho, descargue la macro TissueCellSegmentMovie.ijm (desde http://adm.irbbarcelona.org/matlab/TissueCellSegmentMovie.ijm). Arrastre y suelte este script en Fiji.
  3. Abra el archivo TLM .tiff corregido por lejía (consulte la sección 1.1.1). Divida los canales del archivo corregido por lejía utilizando Imagen > Color > Dividir canales.
  4. Ejecute el script cargado en el canal de membrana de celda activa del TLM seleccionado pulsando el icono Ejecutar en el script abierto. Establezca el desenfoque gaussiano en 2.500 y la sensibilidad de detección de celdas en -1 y haga clic en Aceptar. Para obtener una buena máscara de celda, no cambie estos parámetros anteriores. Establezca la tolerancia de ruido estimada entre 10 y 20 para los TMM adquiridos con el objetivo 63x y haga clic en Aceptar.
    NOTA: Para otros objetivos, pueden ser necesarios diferentes parámetros. Cuanto más limpio sea el fondo en un TLM, se requiere la menor tolerancia de ruido estimada.
  5. Una máscara de celda generada aparece en el TLM analizado y también en una nueva ventana llamada ParticleStack (G)y, además, aparece una pequeña ventana llamada Acción requerida. Desde la máscara de celda en el TLM, céntrese solo en las celdas en el centro del TLM y seleccione aquellas que puedan proporcionar contornos completos y bien definidos a lo largo del TLM.
  6. Si las celdas seleccionadas contienen contornos de celda artificiales/adicionales, utilice la ventana de herramientas de combinación denominada Acción requerida en el TLM. Para este último, siga las instrucciones de la ventana.
    NOTA: Asegúrese de que los contornos celulares estén bien definidos y correspondan a membranas celulares reales en un TLM, ya que cualquier imprecisión puede afectar a los análisis posteriores. Los ajustes y cambios adicionales, como la eliminación de celdas no deseadas, se pueden realizar más adelante con la herramienta Administrador de superficies (descrita en la sección 1.1.3).
  7. Cuando las celdas seleccionadas en el centro se correspondan muy bien con las membranas celulares reales, guarde ParticleStack como un archivo .tiff siguiendo Archivo > Guardar como > Tiff.
3. Carga de la máscara de celda generada en el Administrador de superficies
  1. Instale Surface Manager Plugin¹⁵ en la configuración de Fiji utilizada. Siga las instrucciones de Viktorinova et al.¹⁶.
  2. Abre el Administrador de superficies con Plugins > Segmentación > Administrador de superficies (3D).
    NOTA: La ventana administrador de superficies muestra varios botones de acción a la derecha y una ventana vacía a la izquierda. Para ver todos los botones de acción, puede ser necesario estirar la ventana en su altura / anchura. Tenga en cuenta que los marcos de tiempo aparecerán como cortes z.
  3. Abra el archivo .tiff de ParticleStack correspondiente en Surface Manager haciendo clic en Archivo > Abrir y seleccione la imagen que desea abrir (por ejemplo, ParticlesStack1.tif).
  4. En el Administrador de superficies, haz clic en el botón Leer imagen de contorno y establece el índice Jacquard en 60%.
    NOTA: La carga del archivo ParticlesStack1.tif puede tardar hasta varios minutos, dependiendo de la potencia de procesamiento del equipo.
  5. Una vez cargada, cada celda se asignará con un número S y aparecerá en la parte izquierda de la ventana del Administrador de superficies.
    NOTA: Para mostrar contornos y nombres de celda para todas las celdas, marca las casillas Mostrar todo y Mostrar etiquetas en la parte inferior de la ventana del Administrador de superficies. Se recomienda utilizar esta función una vez que los números de celda se han comprobado para su corrección.
  6. Haga clic en el primer número S; el contorno de celda importado de ParticlesStack1.tif aparece en el TLM. Compruebe cada número S importado para la calidad del contorno de celda en todo el TLM y elimine las celdas no deseadas que muestran contornos de celda incorrectos. Para ello, resalte el contorno de la celda y haga clic en el botón Eliminar.
    NOTA: También es posible corregir los contornos de celda imprecisos y agregar nuevos contornos de celda. Esto se describe en la sección de discusión.
  7. Guarde todas las celdas corregidas como un archivo RoiSet.zip pulsando el botón Guardar en disco.
    NOTA: Si es necesario interrumpir la sesión, es posible cargar el archivo RoiSet en el Administrador de Surface más adelante: abra un TLM en Fiji (Archivo > Abrir) y seleccione un TLM. Abre el Administrador de superficies a través de Plugins > Segmentación > Administrador de superficies (3D). Cargue el archivo RoiSet.zip correspondiente haciendo clic en el botón Cargar desde disco y eligiendo el archivo RoiSet.zip adecuado. Compruebe que las máscaras de celda cargadas corresponden al TLM cargado.
4. Corrección de la deriva tisular en LOS TM
  NOTA: Durante el tiempo de adquisición de los TM, se pueden observar efectos de deriva debido a la rotación epitelial o un movimiento no deseado. En ambos casos, recomendamos corregir cualquier deriva con el fin de simplificar el análisis manual de actomiosina más adelante. La corrección de deriva solo es necesaria para el análisis manual de actomiosina. Este tutorial requiere el software de Fiji actualizado con el complemento MultiStackReg (https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#multistackreg) instalado.
  1. Abra el TLM corregido por lejía en Fiji a través de Archivo > Abrir y seleccione el archivo corregido por lejía creado con el tutorial mencionado anteriormente.
  2. Divida los canales y seleccione el que identifica las membranas celulares a través de Imagen > Color > Canales divididos.
  3. Utilice el siguiente protocolo cuando los contornos de celda no sean visiblemente suaves: Proceso > Filtros > Desenfoque gaussiano. Establézcalo en 1–2 para un objetivo de 63x y haga clic en Aceptar y, a continuación, en Sí. Haga clic en Proceso > Binario > Convertir en máscara utilizando la configuración predeterminada; a continuación, haga clic en Aceptar.
  4. Cargue el complemento MultiStackReg siguiendo Plugins > Registro > MultiStackReg.
  5. Asegúrese de que la pila 1 esté establecida en el canal de membrana celular, la acción 1 se establece en Alinear y transformación se establece en Traducción. Active la casilla Guardar archivo de transformación y, a continuación, haga clic en Aceptar.
  6. Vuelva a abrir el TLM seleccionado, el complemento MultiStackReg y el archivo de transformación guardado mediante Archivo > Abrir y seleccione un TLM. Divida los canales de color con Imagen > Color > Dividir canales.
  7. Cargue el complemento MultiStackReg haciendo clic en Plugins > Registro > MultiStackReg. Seleccione Cargar archivo de transformación como acción 1.
  8. Deje Transformación como cuerpo rígido y haga clic en Aceptar. Seleccione el archivo de transformación guardado anteriormente y haga clic en Aceptar de nuevo.
  9. Combine los canales de imagen y guarde el TLM registrado como un archivo .tiff siguiendo Imagen > Color > Combinar canales. Guarde el archivo haciendo clic en Archivo > Guardar como > Tiff.
    NOTA: Hay formas alternativas de corregir una deriva de tejido en Fiji, a saber, a través de Plugins > Registro > StackReg/Correct 3D drift.
Análisis de pulsos de actomiosina en Surface Manager en LCS
NOTA: Este paso de protocolo permite a los científicos identificar si los pulsos de actomiosina están presentes en el tejido analizado y comprender el comportamiento detallado, así como la direccionalidad de las señales de actomiosina.
1. Abra Fiji y asegúrese de que un TLM y su máscara de celda correspondiente estén abiertos en el Administrador de superficies.
  NOTA: Asegúrate de que Fiji esté instalado y actualizado y de que el complemento de Surface Manager esté instalado (paso 1.1.3.1).
2. Abra un TLM con Archivo > Abrir y seleccione un TLM para abrirlo (por ejemplo, TestMovie1_bleach.tif). Cargue el complemento Administrador de superficies a través de Plugins > Segmentación > Administrador de superficies (3D). Cargue la máscara de celda guardada creada en el tutorial aquí (por ejemplo, ParticlesStack1.tif) a través de Archivo > Abrir y seleccione una máscara de celda (por ejemplo, ParticlesStack1.tif). Cargue la región de interés correspondiente (ROI, por ejemplo, TestMovie1_RoiSet.zip). Vea la figura 3A.
3. Cambie al canal de interés en el TLM seleccionado.
  NOTA: Para distinguir los canales, siga el código de color indicado alrededor del TLM.
4. En el Administrador de superficies, haga clic en el botón Estadísticas para obtener la ventana denominada Valor gris medio sector por sector ( Figura3B). Tenga en cuenta que se mostrarán los valores de intensidad media/mediana de las señales de actomiosina en un canal analizado determinado dentro de los contornos de celda definidos a lo largo del tiempo, así como otros parámetros relacionados con el área de celda y la forma de la celda.
  NOTA: Los valores de intensidad están en unidades de arbitraty (A.U.); el área de la celda está en píxeles y necesita ser convertido en micrómetros cuadrados.
5. Guarde los valores obtenidos como un archivo de hoja de cálculo. Haga clic en la ventana Estadísticas, Archivo > Guardar como.
  NOTA: Es posible verificar los valores estadísticos obtenidos más adelante de la siguiente manera: abrir el TLM corregido con lejía en Fiji y abrir el administrador de Surface. Cargue el RoiSet.zip correspondiente en el TLM pulsando el botón Cargar desde disco y abra el archivo. La máscara guardada con contornos de celda se cargará y los nombres de las celdas aparecerán en la ventana izquierda del Administrador de superficies. Haga clic en el botón Estadísticas para ver los valores estadísticos.
Análisis manual de señales de actomiosina subcelulares individuales en LCS
NOTA: Este protocolo requiere la mayor concentración y consume mucho tiempo. En general, un TLM adquirido se puede analizar cómodamente dentro de 1 día. Esto no incluye el tiempo para la preparación de la mosca antes de su disección, la disección en sí y la adquisición de imágenes.
1. Abra un TLM seleccionado, corregido por lejía y registrado (corregido a la deriva) en una solicitud actualizada de Fiji. Utilice un TLM corregido por lejía y corrección a la deriva (por ejemplo, TestMovie1_bleach_reg.tif) como ejemplo de prueba.
2. Ajuste el brillo y el contraste para ver las señales individuales de actomiosin utilizando Imagen > Ajustar > Brillo/Contraste.
3. Alinee los TLM en la misma dirección en relación con el eje tejido/cuerpo. En el caso de las cámaras de huevo, alinee el lado anterior de las cámaras de huevo siempre a la izquierda de la imagen/subpelícula/TLM antes del análisis.
4. Divida la película seleccionada en subpelículas cortas de 30 s y proyecte cada una de ellas. Guarde subpelículas no proyectadas en tiempo y proyectadas en el tiempo con los nombres correspondientes. Guarde la fuente original.
  NOTA: Las subpelículas se pueden crear a partir de TLM originales eliminando primero fotogramas no deseados a través de Imagen > Pilas > Eliminador de sectores. Defina los sectores que se van a eliminar y establezca Incremento. Transforme a RGB antes de utilizar el removedor de cortes cuando Increment . Para proyectar un subpelícula de 30 s, haga clic en Imagen > Pilas > Proyecto Z > Intensidad máxima para los fotogramas definidos (sectores) y, a continuación, haga clic en Aceptar. Omita cada segundo subpelícula de 30 s para evitar contar las señales de actomiosina 2x en dos subpelículas posteriores de 30 s.
5. Coloque una imagen proyectada en el tiempo junto a la subpelícula de 30 s correspondiente (Figura4A,B). Identifique la línea de señal en la subpelícula proyectada en el tiempo. Identifique la dirección del movimiento de la señal de actomyosin (0o–360o) a lo largo de esta línea en la subpelícula original reproduciendo manualmente la subpelícula. Utilice la herramienta Angulo (en la barra de Fiji) para medir manualmente la dirección del movimiento de la señal en relación con el eje de tejido definido o una herramienta similar disponible.
  NOTA: Fiji sólo trabaja en una escala de 0 a 180o (figura4C),y se requiere un nuevo cálculo de los valores obtenidos en una escala de 0 a 360o. Una línea de señal corresponde a la trayectoria de un movimiento de señal actomiosina a lo largo del tiempo.
6. Para evitar la duplicación en el análisis de señales de actomiosina, marque las líneas de señal analizadas dentro de las celdas en la subpelícula proyectada en el tiempo (Figura4B,D).
7. Analice todas las celdas seleccionadas en la subpelícula de 30 s y guarde los ángulos obtenidos.
  NOTA: Analizar sólo señales de actomiosina citoplasmática subcelular en células con contornos celulares bien definidos a lo largo de un TLM. Excluya las células individuales con menos de 15–20 señales detectadas en todo el TLM. Ignore las señales de actomiosina que se mueven a través de las células debido a su origen desconocido. Un ejemplo de recuento de señales para una celda analizada en la subpelícula de 30 s se muestra en la Figura 4D.
8. Continúe hasta que se analicen las subpelículas de 30 s de largo de un TLM y guarde todos los ángulos medidos de las señales de actomiosina de un TLM en un archivo de hoja de cálculo.
9. Sume todos los ángulos medidos sobre el número relevante de TlM (dependiendo del experimento). Trazar el porcentaje de la dirección de las señales de actomiosina analizadas, por ejemplo, como un diagrama de rosas con un rango de 0 a 360o con un software preferido.
  NOTA: Para obtener resultados estadísticamente significativos, se recomienda analizar de cinco a diez cámaras de huevo independientes de cualquier etapa de la cámara de óvulos.

2. Escala de tejido

NOTA: Para diseccionar e imaginar cámaras de huevo Drosophila cultivadas in vitro, siga el protocolo en Archivo Suplementario 2. Para analizar los TlM adquiridos, continúe con el siguiente protocolo a continuación. Los archivos de prueba acompañados de TLMs se colocan en el archivo complementario 3.

Extracción selectiva de superficie de tejidos epiteliales curvos
Nota:Este protocolo permite a los usuarios extraer selectivamente una fina capa de actomiosina en un tejido epitelial curvo con el tiempo. Este paso de protocolo es fácil de usar y se basa en una interfaz gráfica intuitiva. Es posible analizar cómodamente (extraer superficie) varios TLM. Use TestMovie2.czi (de laArchivo Suplementario 3) como ejemplo de TLM de prueba.
1. Abra una aplicación actualizada de Fiji (Fiji > Ayuda > Actualización > Aplicar cambios > Aceptar).
2. Asegúrese de que el complemento de proyección de superficie elipsoide¹⁵ está instalado. Seguir a Alejandra Y A. ¹⁶.
3. Abra un TLM y expórtelo como un archivo XML/HDF5 haciendo clic en Plugins > BigDataViewer > Exportar imagen actual como archivo XML/HDF5.
  NOTA: Es necesario definir una ruta de exportación. El guardado en sí puede tardar varios minutos y depende de la longitud del TLM.
4. Abra el archivo exportado en Proyección de superficie elipsoide haciendo clic en Plugins > BigDataViewer > Proyección de superficie elipsoide > Seleccionar archivo XML.
  NOTA: Aparecerá una nueva ventana con vistas sagital de la cámara de huevos y un cuadro de diálogo para guiar al usuario a través del procesamiento. Los detalles sobre cómo navegar en la vista de sectorse se pueden encontrar en https://imagej.net/BigDataViewer.
5. La ventana de diálogo llamada Proyección de Ovarios tiene varias pestañas. En la primera pestaña de diálogo denominada Cuadro delimitador, defina los bordes x e y de una cámara de huevos en el TLM junto con el ancho z del cuadro delimitador (es decir, la profundidad de una cámara z-stack/egg) y pulse set (Figura 5A).
6. Para definir bordes, arrastre los botones situados junto a x, y y z o defina las coordenadas numéricas en los cuadros x, y y z. Asegúrese de que los bordes son lo suficientemente generosos como para conseguir la parte de la cámara de huevo de interés en la extracción de la superficie. Las partes seleccionadas de la cámara de huevo se resaltan en rosa.
7. Cambie a la pestaña Buscar blobs en la ventana Proyección de Ovarios. Defina el sigma y el valor máximo mínimo; a continuación, presione compute para identificar las señales de actomyosin (Figura5B),que aparecerán como blobs verdes. Vuelva a intentar este paso con diferentes parámetros hasta que se encuentren suficientes puntos (alrededor de 100).
  NOTA: Sigma 1-u20123 con un valor máximo mínimo de 20-u2012100 funciona mejor para identificar las señales de actomiosina de las cámaras de huevo de etapa 6 a -8. Identificar las señales de actomiosina es un paso crucial y depende de la calidad de la señal y su tamaño. Es importante confirmar el tamaño correcto de los blobs existentes. No hay manchas/blobs verdes visibles en la imagen significa que el siguiente paso no funcionará. Examine los planos z seleccionados para ver los blobs.
8. Para diseñar el elipsoide, continúe con la pestaña llamada Fit elipsoide. Establezca Muestras aleatorias en 10.000, Distancia de corte exterior/interior en 1-u201210 y, a continuación, haga clic en Calcular (Figura 5C).
  NOTA: Cuanto menor sea la distancia de corte, más preciso será el elipsoide deseado. Después de esto, la pestaña llamada Proyección se abrirá automáticamente y permite la definición de la extracción de la superficie. Es necesario optimizar la configuración.
9. Continúe más adelante con la pestaña llamada Proyección (Figura 5D). Configure una distancia de proyección mínima y máxima (es decir, la anchura del elipsoide deseado). Se requiere establecer una distancia de proyección mínima y máxima para que la región elipsoide definida rosa incluya toda la capa exterior de la cámara de huevo. Defina la distancia del sector (se recomienda 1).
  NOTA: En la Figura 6A,Cse muestran ejemplos de un ajuste elipsoide incorrecto y óptimo que da como resultado parámetros de proyección incorrectos y óptimos. La capa circunferencial delgada del interés se puede definir más adelante. Asegúrese de que la región rosa del elipsoide con el ancho definido en la cámara de huevo sea visible antes de presionar la computación. Es importante que el elipsoide deseado (línea única rosa) se adapte bien a la superficie elipsoide de una cámara de huevo con el fin de obtener los mejores resultados. Si el ajuste elipsoide no es bueno, organice diferentes ajustes hasta obtener la extracción de superficie deseada.
  1. Establezca un ancho de salida (800) y una altura (400) del elipsoide. Establezca desde qué punto de tiempo hasta qué punto de tiempo se debe crear la extracción de superficie (es decir, defina la longitud de la extracción de TLM). Elija una proyección esférica o cilíndrica. Voltee Z y alinee Y si es necesario.
  2. Presione calcular para obtener una extracción de superficie para ambos canales en ventanas nuevas denominadas Imagen. Ajuste el brillo y el contraste de las ventanas de imagen obtenidas para poder ver las señales de actomiosina proyectadas, haciendo clic en Imagen > Ajustar > Brillo/Contraste.
    NOTA: En la Figura 6B,Dse muestra un ejemplo de comparación de una proyección resultante de un ajuste elipsoide incorrecto y óptimo.
10. Si la extracción de superficie se ve bien, guarde las imágenes (ambos canales por separado) como .tiff. Además, guarde el archivo de ventana de registro para futuras referencias sobre cómo se extrajo la superficie de esta cámara de huevo en particular.
  NOTA: Esta es información particularmente importante si la capa delgada extraída debe volver a su forma original desplegada (solo para desarrolladores).
11. Combine los canales con un código de color preferido en Fiji.
  NOTA: Si es necesario, proyecte las capas de pila z seleccionadas con señales de actomiosina. La proyección de las capas de pila z seleccionadas es necesaria cuando el foco de adquisición cambia ligeramente con el tiempo en un TLM. Para obtener los mejores resultados, proyecte como máximo una a dos capas de pila z.
12. Guarde los resultados como archivos .tiff.
  NOTA: En la Figura 8se pueden encontrar ejemplos representativos de capas delgadas (superficie basal selectiva y apical) que representan la señal de Miosin II (MRLC::GFP) del epitelio folículo de las cámaras de huevo mutantes de control y grasa2.
Procesamiento de datos de una superficie de tejido extraída selectivamente
1. Corrija la lejía de los TLM para compensar la descomposición de la intensidad de las etiquetas fluorescentes.
  1. Abra Fiji. Abra un TLM (por ejemplo, TestMovie2_extraction.tif desde el archivo complementario 3) utilizando Archivo > Abrir. Seleccione la imagen para abrirla.
  2. Divida los canales de color y conviértalos en imágenes de 16 bits, si es necesario, haciendo clic en Imagen > Color > Dividir canales. Convierta los canales en imágenes de 16 bits (a partir de imágenes de 32 bits) utilizando Imagen > Texto > 16 bits.
  3. Realice una corrección de lejía en ambos canales utilizando Imagen > Ajustar > Corrección de lejía > Relación simple > Intensidad de fondo 0.0.
    NOTA: Si se obtienen resultados insatisfactorios, es necesario explorar qué métodos de corrección en este plugin se ajustan mejor (por ejemplo, utilizar la coincidencia de histograma en lugar de una relación simple).
  4. Combine los canales de las dos imágenes corregidas por lejía haciendo clic en Imagen > Color > Fusionar canales. Guarde la imagen combinada como un archivo .tiff haciendo clic en Archivo > Guardar como > Tiff.
    NOTA: Ajuste el contraste y el brillo de los canales si es necesario.
2. Segmentación celular para generar una máscara de celda para TLMs
  1. Si Fiji aún no está abierto, vuelva a abrirlo (y asegúrese de que esté actualizado haciendo clic en Ayuda > Actualizar > Aplicar cambios > Aceptar).
  2. Si esto aún no se ha hecho, descargue la macro TissueCellSegmentMovie.ijm (http://adm.irbbarcelona.org/matlab/TissueCellSegmentMovie.ijm).
  3. Arrastre y suelte este script en Fiji. Abra el archivo corregido por lejía (por ejemplo, TestMovie2_bleach.tif desde el archivo complementario 3, véase también 2.2.1).
  4. Divida los canales del archivo corregido por lejía haciendo clic en Imagen > Color > Dividir canales. Ajuste el canal de membrana para asegurar contornos de celda claros haciendo clic Imagen > Ajustar > Brillo/Contraste.
  5. Ejecute el script cargado en el canal de membrana de celda activa del TLM seleccionado pulsando el icono Ejecutar en el script abierto. Establezca Desenfoque gaussiano en 1.500. Establezca la sensibilidad de detección de celdas en -1 y haga clic en Aceptar. Establezca Tolerancia de ruido estimada en 8 para los TMMM adquiridos con el objetivo 40x y haga clic en Aceptar.
    NOTA: Para obtener una buena máscara de celda, no cambie estos parámetros anteriores. Para otros objetivos, pueden ser necesarios diferentes parámetros. Cuanto más limpio sea el fondo en un TLM, se requiere la menor tolerancia de ruido estimada.
  6. Una máscara de celda generada aparece en el TLM analizado y también en una nueva ventana llamada ParticleStack (G). Además, aparece una pequeña ventana llamada Acción requerida. Desde la máscara de celda en el TLM, céntrese solo en las celdas en el centro del TLM y seleccione aquellas que puedan proporcionar contornos completos y bien definidos a lo largo del TLM.
  7. Si las celdas seleccionadas contienen contornos de celda artificiales/adicionales, utilice la ventana de herramientas de combinación denominada Acción necesaria en el TLM. Para este último, siga las instrucciones de la ventana.
    NOTA: Asegúrese de que los contornos celulares estén bien definidos y correspondan a membranas celulares reales en un TLM, ya que cualquier imprecisión puede afectar a los análisis posteriores. Los ajustes y cambios adicionales, como la eliminación de celdas no deseadas, se pueden realizar más adelante con la herramienta Administrador de superficies (delineado en el tutorial siguiente).
  8. Cuando las celdas seleccionadas en el centro se correspondan muy bien con las membranas celulares reales, guarde ParticleStack como un archivo .tiff siguiendo Archivo > Guardar como > Tiff. Proceda a realizar la carga de la máscara de celda generada y el análisis de actomyosin en Surface Manager como se realizó anteriormente en las secciones 1.1.3 y 1.2 (también descrita en detalle en las secciones 2.2.3 y 2.3).
3. Carga de la máscara de celda generada en el Administrador de superficies
  1. Si el complemento de Surface Manager ya está instalado en la configuración de Fiji utilizada, continúe con el paso 2. Si no es así, siga Viktorinova et al.¹⁶. Para los desarrolladores, sólo el código fuente también está disponible¹⁵.
  2. Abra Surface Manager haciendo clic en Plugins > Segmentación > Administrador de superficies (3D).
    NOTA: La ventana administrador de superficies muestra varios botones de acción a la derecha y una ventana vacía a la izquierda. Para ver todos los botones de acción, puede ser necesario estirar la ventana en su altura / anchura. Tenga en cuenta que los marcos de tiempo aparecerán como cortes z.
  3. Abra el archivo ParticleStack.tif correspondiente en Surface Manager a través de Archivo > Abrir y seleccione la imagen que desea abrir (por ejemplo, ParticleStack2.tif desde el archivo complementario 3).
  4. En el Administrador de superficies, haz clic en el botón Leer imagen de contorno y establece el índice Jacquard en 60%.
    NOTA: La carga de un archivo ParticleStack.tif puede tardar hasta varios minutos, dependiendo de la potencia del equipo.
  5. Una vez cargada, cada celda se asignará con un número S y aparecerá en la parte izquierda de la ventana del Administrador de superficies (Figura7A).
    NOTA: Para mostrar contornos y nombres de celda para todas las celdas, marca las casillas Mostrar todo y Mostrar etiquetas en la parte inferior de la ventana del Administrador de superficies. Se recomienda utilizar esta función una vez que los números de celda se han comprobado para su corrección.
  6. Haga clic en el primer número S; el contorno de celda importado de ParticleStack.tif aparece en el TLM. Compruebe cada número S importado para la calidad del contorno de celda en todo el TLM y elimine las celdas no deseadas que muestran contornos de celda incorrectos. Para ello, resalte el contorno de la celda y haga clic en el botón Eliminar.
    NOTA: También es posible corregir los contornos de celda imprecisos y agregar nuevos contornos de celda. Esto se describe en la sección de discusión.
  7. Guarde todas las celdas corregidas como un archivo RoiSet.zip pulsando el botón Guardar en disco.
    NOTA: Si es necesario interrumpir la sesión, es posible cargar el archivo RoiSet.zip en el Administrador de Surface más adelante: abra un TLM en Fiji a través de Archivo > Abrir y seleccione un TLM. Abra el Administrador de superficies de la siguiente manera: Plugins > Segmentación > Administrador de superficies (3D). Cargue el roiSet.zip correspondiente haciendo clic en el botón Cargar desde disco y eligiendo el archivo RoiSet.zip adecuado (por ejemplo, TestMovie2_RoiSet.zip). Compruebe que las máscaras de celda cargadas corresponden al TLM cargado.
Análisis de pulsos de actomiosina en el Administrador de superficies
NOTA: Abra Fiji y asegúrese de que un TLM y su máscara de celda correspondiente estén abiertos en el Administrador de superficies. Asegúrate de que Fiji esté instalado y actualizado y de que el complemento de Surface Manager (https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager) esté instalado.
1. Abra un TLM con Archivo > Abrir y seleccione un TLM para abrirlo (por ejemplo, TestMovie2_bleach.tif). Carga el complemento Administrador de Surface a través de Plugins > Segmentación > Administrador de superficies (3D). Cargue la máscara de celda guardada creada en el tutorial aquí (por ejemplo, ParticlesStack2.tif) a través de Archivo > Abrir y seleccione una máscara de celda (por ejemplo, ParticlesStack2.tif). Cargue el ROI correspondiente (por ejemplo, TestMovie2_RoiSet.zip).
2. Cambie al canal de interés en el TLM seleccionado.
  NOTA: Para distinguir entre los canales, siga el código de color indicado alrededor del TLM.
3. En el Administrador de superficies, haga clic en el botón Estadísticas para obtener la ventana denominada Valor gris medio sector por sector ( Figura7B). Tenga en cuenta que se mostrarán los valores de intensidad media/mediana de las señales de actomiosina en un canal analizado determinado dentro de los contornos de celda definidos a lo largo del tiempo, así como otros parámetros relacionados con el área de celda y la forma de la celda.
  NOTA: Los valores de intensidad están en A.U.; el área de la celda está en píxeles y necesita ser convertido en micrómetros cuadrados.
4. Guarde los valores obtenidos como un archivo de hoja de cálculo: haga clic en la ventana Estadísticas, Archivo > Guardar como.
  NOTA: Es posible verificar los valores estadísticos obtenidos más adelante, de la siguiente manera. Abra el TLM corregido con lejía en Fiji. Abra el Administrador de superficies. Cargue el RoiSet.zip correspondiente en el TLM pulsando el botón Cargar desde disco y abra el archivo. La máscara guardada con contornos de celda se cargará y los nombres de las celdas aparecerán en la ventana izquierda del Administrador de superficies. Haga clic en el botón Estadísticas para ver los valores estadísticos.
  NOTA: En cuanto a un análisis manual de señales de actomiosina subcelulares individuales,no es posible realizar un análisis manual de las señales de actomiosina subcelular a escala tisular. La optimización es necesaria para el análisis de señales de actomiosina individuales a escala semi-tejido, como se destaca en la sección de discusión.

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Representative Results

Este protocolo permite a los científicos investigar el comportamiento de las redes de actomiosina en los tejidos epiteliales. Esto sólo es posible cuando un análisis detallado del comportamiento de la actomiosina a escala celular local (unas pocas células) se combina con un análisis similar a la escala tisular (muchas células). Sin embargo, los tejidos epiteliales son a menudo curvos y la extracción de una capa delgada de estos tejidos antes no era fácilmente posible, como se muestra en las cámaras de óvulos drosófilas (Figura1). El protocolo presentado aquí proporciona a los usuarios instrucciones simples que describen cómo analizar el comportamiento de actomiosina en ambas escalas (Figura2).

La primera parte de este protocolo se centra en las instrucciones relativas al análisis de pulsos de actomyosin utilizando el complemento Administrador de superficies (Figura3). También describe cómo analizar manualmente el comportamiento individual de actomiosina a escala celular local (Figura4). La segunda parte de este protocolo explica cómo extraer una capa delgada de tejido epitelial utilizando el plugin elipsoide Surface Projection (Figura5 y Figura6). Sólo entonces es posible analizar pulsos de actomiosina a escala de tejido utilizando el complemento Administrador de superficies (Figura 7). Los resultados representativos y una comparación del comportamiento de la actomiosina en el control rotativo y las cámaras de huevo drosophila mutantes de grasa estática2 a la escala celular y tisular local se muestran en la Figura 8 y en la película correspondiente 1, Película 2, Película 3, Película 4, Película 5y Película 6 (para obtener más información, consulte la figura 8).

Figura 1: Extracción selectiva de una capa delgada de una superficie de tejido curvado. (A) Para obtener suficiente información sobre las redes de actomiosina en la epitelia curvada circunferencialmente, es necesario adquirir una pila z profunda (rosa) sobre la mayoría de un tejido visible como se muestra para el epitelio del folículo curvo (gris) de cámaras de huevo drosofílica. (A') Sin embargo, una simple proyección de tal pila z conduce a la mezcla de redes enteras de actomiosina en células folículos. La miosina II visualizada con MRLC::GFP (verde) muestra la región interna (apical) de las células del folículo que expresa fuertemente en una proyección z y casi no hay información del lado basal (exterior), donde Myosin II muestra un fenotipo de polaridad celular plana fuerte, pero su intensidad de la señal es baja¹². Para evitar tales mezclas como se muestra en el panel A',hemos desarrollado un plugin fácil de usar, basado en Fiji llamado Elipsoid Surface Projection en BigDataViewer¹⁸ que permite (B) la extracción selectiva de una capa definida y delgada (rosa ) de actomiosina a partir de un epitelio curvo (B') como se muestra para Miosin II (verde) en una extracción seleccionada del lado basal (externo) del epitelio del folículo. Compare la diferencia de señal de Myosin II (MRLC::GFP) en los paneles A' y B'. Observe el patrón polarizado plano de Myosin II en el panel B'. Los contornos de las celdas están en rojo. El lado anterior está a la izquierda. Barra de escala de 50 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Red de actomiosina polarizada plana en las escalas celulares y tisulares locales. La imagen de actomiosina a diferentes escalas permite el análisis de diferentes números de células epiteliales, a saber (A) hasta 15 células a escala celular local y (B) 50-100 células en la escala tisular en el epitelio folículo de cultivo Cámaras de huevo sofófilas. No muscular Myosin II se visualiza con MRLC::GFP (verde) y el genotipo de la línea transgénica utilizada se especifica en la Tabla de Materiales. Los contornos de las celdas están en magenta. El lado anterior está a la izquierda. Barras de escala a 5 m (A); 50 m (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Un ejemplo del análisis de pulsos de Myosin II en Surface Manager a escala celular local. (A) Se carga una pila de partículas en el Administrador de superficies. Tenga en cuenta que todas las celdas identificadas en el TLM aparecen en la ventana Administrador de superficies. Es importante eliminar todas las celdas no deseadas o incompletas a lo largo de un TLM. (B) Las estadísticas obtenidas en Myosin II (MRLC::GFP) para las celdas seleccionadas se muestran en la ventana denominada Valor gris medio Sector por sector en el Administrador de superficies. MRLC::GFP se muestra en verde mientras que las membranas celulares están en rojo. El lado anterior está a la izquierda. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Un ejemplo del análisis manual de señales individuales de Myosin II a escala celular local. (A) Una subpelícula seleccionada de 30 s de largo se coloca junto a (B) su proyección de tiempo. Tenga en cuenta que tras la proyección de tiempo, Myosin II (MRLC::GFP) muestra líneas de trayectoria más largas (consulte el panel B) dentro de celdas individuales que en un marco de tiempo individual (consulte el panel A). Las líneas individuales en las células deben analizarse para su dirección angular en relación con el eje anterior-posterior de las cámaras de óvulos. (C) Tenga en cuenta que Fiji no mide entre 0y 360o, sino sólo de 0a a 180o para las señales que apuntan hacia arriba y de 0a a 179o para las señales que apuntan hacia abajo. Tenga en cuenta que 0o se coloca atípicamente a la derecha de una imagen analizada. (D) Sobre la base de esta información, las líneas que se mueven con (arriba en rosa) o contra (abajo en amarillo) la dirección de la rotación epitelial en una cámara de huevo en particular deben ser binned para identificar si la ruptura de simetría de las señales analizadas está presente dentro de un células y luego para múltiples células en el tejido analizado. MRLC::GFP se muestra en verde mientras que las membranas celulares están en rojo. El lado anterior está a la izquierda. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Un ejemplo de generación de un ajuste elipsoide en la escala de tejido. Para encajar un elipsoide en una cámara de huevo utilizando el plugin de proyección de superficie elipsoide en BigDataViewer, es necesario definir (A) un cuadro delimitador que incluye la mayoría del tejido escaneado. A continuación, es importante (B) para identificar los puntos de señal, que son un requisito previo para una generación óptima de ajuste elipsoide. (C) Cuando el ajuste elipsoide no es óptimo y no rodea muy bien una cámara de huevo, esto resulta en (D) mala extracción de la capa de tejido. Vea los resultados de extracción y proyección posterior en la Figura6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Comparación de un ajuste elipsoide incorrecto y óptimo y proyecciones de superficie correspondientes. (A) Cuando el elipsoide no está correctamente, (B) la proyección final de la superficie no proporcionará datos de señal completos en la capa delgada del tejido analizado. (C) Sin embargo, cuando se instala de forma óptima, garantiza una detección de señal igual de una capa delgada en el tejido. (D) Tenga en cuenta que la proyección de superficie óptima contiene varias capas delgadas como una pila z-stack proyectada por superficie a lo largo del tiempo, que se puede separar posteriormente como se muestra en la Figura8. Las señales de miosina II (MRLC::GFP, blancas) y las señales de membrana (blancas) se fusionan inicialmente antes de la proyección (paneles A y C),pero tras la propia proyección superficial, estos canales se separan (ver proyecciones de Myosin II en los paneles B y D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Un ejemplo del análisis de pulsos de Myosin II en Surface Manager a la escala de tejidos. (A) Se carga una pila de partículas en el Administrador de superficies. Tenga en cuenta que todas las celdas identificadas en el TLM aparecen en la ventana Administrador de superficies. Es importante eliminar todas las celdas no deseadas o incompletas a lo largo de un TLM. (B) Las estadísticas obtenidas en pulsos de Myosin II (MRLC::GFP) (media o mediana) para celdas seleccionadas a lo largo del tiempo se muestran en la ventana denominada Valor gris promedio Sector por sector en el Administrador de superficies. Tenga en cuenta que los puntos más fuertes de Myosin II pueden influir en la medida final de la intensidad intrínseca de la miosina II. Esto resulta del problema de que estos puntos de Myosin II pueden parecer migrar más allá del contorno de la celda donde hay una definición de contorno de celda incorrecta en la máscara de celda generada. MRLC::GFP se muestra en verde mientras que las membranas celulares están en rojo. El lado anterior está en la parte superior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Resultados representativos de una red Myosin II en el epitelio folículo Drosophila. Ejemplos representativos de comportamiento dinámico de Miosina II (MRLC::GFP) (A y B) a escala celular local y (C-F) a la escala tisular para controlar y grasa2 mutante Cámaras de óvulos Drosophila. Consulte la Tabla de materiales para obtener información detallada sobre los genotipos usados. Tenga en cuenta que las señales MRLC::GFP (verde) se mueven perpendiculares al eje anterior-posterior (AP) de las cámaras de huevo de control. Esta polaridad se pierde en fat2 cámaras de huevo mutantes y conduce a pulsos/oscilaciones anisotrópicas de Myosin II¹². Tras el análisis manual de las pequeñas señales MRLC::GFP (300 m) y la cuantificación de su movimiento direccional angular como se describe en el protocolo, la ruptura de la simetría de las señales MRLC::GFP se puede observar con una preferencia en contra de la dirección del epitelial rotación en una cámara de óvulos analizada¹² (Figura 4). Las películas correspondientes son: panel A , Película 1, Panel B , Película 2, Panel C , Película 3, Panel D , Película 4, Panel E , Película 5y panel F . Película 6. Los contornos de celda se muestran en magenta. El lado anterior está a la izquierda. Barras de escala a 5 m (A y B) y 50 m (C -F). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Parámetros recomendados para imágenes de alta velocidad de corto tiempo a escala celular local:
Ⅰ.	Tejido de interés libremente colocado en el medio de cultivo (es decir, sin resbalones de cubierta, mantas flexibles, etc.)
Ⅱ.	Objetivo de agua 63x con apertura numérica > 1,3
Ⅲ.	Microscopio confocal invertido
Ⅳ.	Un solo avión
Ⅴ.	Intervalos de tiempo de 6-12 s
vi.	5-10 minutos TLMs
Vii.	Requisito de almacenamiento de datos por TLM hasta 100 MB
Parámetros recomendados para imágenes de baja velocidad de larga duración a escala de tejido:
Ⅰ.	Tejido de interés libremente colocado en el medio de cultivo (es decir, sin resbalones de cubierta, mantas flexibles, etc.)
Ⅱ.	40x objetivos de agua y apertura numérica > 1.3
Ⅲ.	Microscopio de disco giratorio invertido
Ⅳ.	z-pilas para adquirir aproximadamente la mitad de una cámara de huevo
Ⅴ.	Intervalos de tiempo de 60 s
vi.	Al menos 30 minutos DE TLM
Vii.	Requisito de almacenamiento de datos aprox. 1GB

Tabla 1: Parámetros de imagen recomendados.

Movie 1
Película 1: Comportamiento dinámico representativo de Myosin II (MRLC::GFP) a escala celular en una cámara de óvulos Drosophila de control. Tenga en cuenta que MRLC::GFP (verde) prefiere moverse perpendicular mente al eje AP de las cámaras de huevo. Los contornos celulares están en magenta. Vista basal. El lado anterior está a la izquierda. Barra de escala de 5 m. Por favor, haga clic aquí para ver este video. Haga clic con el botón derecho para descargar.

Movie 2
Película 2: Comportamiento dinámico representativo de Myosin II (MRLC::GFP) a la escala celular en una cámara de óvulos Drosophila mutante fat2. Tenga en cuenta que MRLC::GFP pulsa (verde) y ya no está alineado plana perpendicular al eje AP de las cámaras de huevo estáticas. Los contornos celulares están en magenta. Vista basal. El lado anterior está a la izquierda. Barra de escala de 5 m. Por favor, haga clic aquí para ver este video. Haga clic con el botón derecho para descargar.

Movie 3
Película 3: Comportamiento dinámico representativo de la miosina basal II (MRLC::GFP) en la escala tisular en una cámara de óvulos Drosophila de control. Tenga en cuenta que sólo una capa delgada basal (externa) MRLC::GFP se extrae de casi la mitad del epitelio folículo de una cámara de óvulos. MRLC::GFP está en verde y los contornos celulares están en magenta. Observe la diferencia en el nivel de detalle del comportamiento de la señal MRLC::GFP obtenido aquí (que representa la escala de tejido) en comparación con la película 1 (que representa la escala celular). El lado anterior está a la izquierda. Barra de escala a 50 m. Por favor, haga clic aquí para ver este video. Haga clic con el botón derecho para descargar.

Movie 4
Película 4: Comportamiento dinámico representativo de miosina basal II (MRLC::GFP) en la escala tisular en una cámara de óvulos Drosophila mutante fat2. Tenga en cuenta que MRLC::GFP (verde) pulsa fuertemente en el lado basal de casi la mitad del epitelio del folículo de una cámara de óvulos mutante fat2 y no genera la fuerza sincronizada necesaria para promover la rotación epitelial. Los contornos celulares están en magenta. El lado anterior está a la izquierda. Barra de escala a 50 m. Por favor, haga clic aquí para ver este video. Haga clic con el botón derecho para descargar.

Movie 5
Película 5: Comportamiento dinámico representativo de la miosina apical II (MRLC::GFP) en la escala tisular en una cámara de óvulos Drosophila de control. Sólo una capa delgada MRLC::GFP se extrae del lado apical (interno) de casi la mitad del epitelio del folículo de una cámara de óvulos. Tenga en cuenta que MRLC::GFP (en verde) muestra un comportamiento dinámico diferente aquí en el lado apical en comparación con el lado basal del epitelio del folículo (como se muestra en la película 3). Los contornos celulares están en magenta. El lado anterior está a la izquierda. Barra de escala a 50 m. Por favor, haga clic aquí para ver este video. Haga clic con el botón derecho para descargar.

Movie 6
Película 6: Comportamiento dinámico representativo de La miosina apical II (MRLC::GFP) en la escala de tejido en una cámara de huevo Drosophila mutante fat2. Comportamiento dinámico alterado de MRLC::GFP (verde) extraído de una región apical delgada de casi la mitad del epitelio folículo de una cámara de huevo mutante de grasa estática2. Los contornos celulares están en magenta. El lado anterior está a la izquierda. Barra de escala a 50 m. Por favor, haga clic aquí para ver este video. Haga clic con el botón derecho para descargar.

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Discussion

Pasos críticos y solución de problemas para la disección y el cultivo de cámaras de huevo

Si se colocan demasiadas moscas en un vial pequeño, el alimento de la mosca puede volverse fangoso después de 2-3 días debido a grandes cantidades de larvas de alimentación y moscas adultas que quedan atrapadas en la comida de la mosca. En tal caso, voltear el resto de estas moscas en un nuevo vial con alimentos frescos y reducir el tamaño de su número. En particular, excluya a las hembras que estaban atrapadas en la comida.

La mezcla de Schneider (SM) debe prepararse con antelación y puede almacenarse a 4 oC durante 14 días. Tenga en cuenta que una mezcla más antigua puede contener cristales que pueden dañar la superficie de las cámaras de huevo. Mezcle siempre el SM con insulina recién añadida y déle tiempo suficiente para alcanzar la temperatura ambiente. Esto protege las cámaras de huevo contra el choque en frío, que puede tener un impacto negativo en el crecimiento de microtúbulos y la alineación plana del citoesqueleto (como se ve en el ala Drosophila ¹⁹en desarrollo).

Las cámaras de huevo y los óvulos seleccionados son muy frágiles y, debido a su pequeño tamaño, pueden flotar en el SMI (SM con insulina). Se recomienda dejar que se hundan espontáneamente en el SMI. También a menudo se adhieren a la herramienta de fórceps/cactus de disección. En tal caso, deje que se liberen de los dispositivos de disección moviéndolos suavemente en el SMI. Evite apretarlos y tocarlos directamente en todo momento. Si es necesario, excluya estas cámaras de huevo/ovarioles del protocolo adicional.

Como un esterescopio de disección no es confiable para la identificación de cámaras de huevo/ovarioles dañados, las cámaras de huevo/ovarioles deben revisarse utilizando un tinte CellMask o FM 4-64 bajo un microscopio de disco confocal/giratorio. Las cámaras de huevo dañadas muestran coloración extrema en comparación con un fondo de tejido de cámara de huevo intacto. Nunca adquiera un TLM con parches de tinte fuertes.

Pasos críticos y solución de problemas para la toma de imágenes en vivo in vitro de cámaras de óvulos

Si las cámaras de huevo colocadas libremente en el SMI todavía se mueven, compruebe de nuevo bajo el microscopio confocal para ver si todavía hay restos pasados por alto de láminas musculares y desechos flotando en el SMI. Quítelos e inténtelo de nuevo. De las cámaras de óvulos, el 90% debe ser estable e inmóvil durante las imágenes posteriores.

Para asegurarse de que una cámara de huevo/ovariole seleccionada es estable, utilice imágenes de alta velocidad (intervalos de 6 s) durante 1 min. Las cámaras de huevo inestables se moverían en este punto. Sin embargo, se recomienda ver toda la grabación de lapso de tiempo para poder corregir suavemente un posible movimiento inesperado de la cámara de huevo con imágenes. Esto se puede hacer moviendo la etapa/mesa microscópica, que sostiene la placa Petri con las cámaras de huevo cultivadas / óvulos, a la posición original para que la cámara de huevo del interés esté de nuevo en la ventana con imagen y enfocada.

Detenga la toma de imágenes si aparece un movimiento repentino e inesperado de la cámara de óvulos con imágenes. Compruebe la amortiguación de la mesa del microscopio y evite caminar cerca del microscopio durante el tiempo de adquisición, ya que esto puede resultar en la interrupción de la adquisición de la imagen debido a las vibraciones causadas.

Si el tinte de membrana celular no es visible después de 30 min y la línea láser utilizada es correcta, agregue más del tinte y aumente su concentración para la próxima adquisición.

Si las señales de actomiosina parecen estar borrosas, compruebe la NA del objetivo utilizado. Un NA inferior a 1.3 disminuirá la calidad de la imagen. Además, asegúrese de que el aceite de inmersión usado se ha aplicado correctamente al objetivo de agua 63x. Añádalo o reemplácelo si es necesario.

Si las cámaras de huevo se encogen y las membranas celulares observadas se deforman, compruebe si la tapa está correctamente cerrada. Si falta la tapa o no está bien cerrada, las cámaras de huevo pueden secarse debido a la evaporación de SMI durante el tiempo de adquisición.

Si la rotación de las cámaras de huevo se ralentiza o se detiene, disminuya la potencia del láser. Si aparece un agujero en la cámara de huevos, ha sido quemado por el láser. Disminuya la potencia del láser.

Si la actomiosina indica lejía después de 2 minutos durante la adquisición de TLM, disminuya la potencia del láser y aumente la amplificación de la señal en el software del microscopio.

Una vez que se ha adquirido un TLM del epitelio folículo de una cámara de óvulos, se recomienda evitar la toma de imágenes de nuevo en la misma región tisular de esta cámara de óvulos. Sin embargo, a medida que las cámaras de huevo giran alrededor de su eje AP, es posible repetir la adquisición de un TLM usando esta cámara de huevo intacta después de alrededor de 30 min. Mientras se toma imágenes del epitelio del folículo en una cámara de óvulos, otras cámaras de óvulos no se blanquearán/dañarán incluso si se encuentran en el mismo ovariole o en otro ovariole en el SMI.

Si se cumplen todos estos requisitos, el porcentaje de cámaras de huevo con imágenes exitosas debe ser de alrededor del 90%-100% para las etapas 6-8, alrededor del 50%–60% para las etapas 3–5, y alrededor del 20%-30% para las etapas 1-2. El fallo se debe principalmente al movimiento de las cámaras de huevo o a su daño durante su disección/manipulación.

Pasos críticos y solución de problemas para el procesamiento de datos

Durante la generación de máscaras utilizando el script proporcionado en Fiji, puede suceder que haya una gran cantidad de contornos celulares generados que no reflejan las membranas celulares reales en un TLM. Esto es a menudo causado por un alto ruido de fondo, especialmente cuando se utilizan colorantes para manchar las membranas celulares. En tal caso, para evitar la corrección tediosa de contornos de celda no deseados en la máscara generada, ejecute la segmentación de nuevo y establezca los parámetros en el mejor ajuste. Esto se puede hacer ajustando el parámetro Tolerancia de ruido estimada.

Al cargar uno de los archivos ParticleStack.tif que contienen contornos de celda en el Administrador de superficies, el tiempo de carga se escala linealmente con el número de contornos de celda y puede tardar varios minutos. Si la carga se interrumpe o es incorrecta, repítela. Asegúrese de que la ventana de carga está enfocada y no se está utilizando ningún otro programa.

A veces, un contorno de celda debe corregirse en algunos marcos; en tal caso, utilice el botón Pincel. Dibuje el contorno de celda correcto en un marco en particular arrastrando el ratón alrededor de la membrana celular. Muévase a un fotograma diferente del TLM y, a continuación, vuelva al marco de tiempo con la corrección: ahora se debe reemplazar el contorno de celda incorrecto. A continuación, vaya de nuevo al siguiente fotograma para corregirlo. La herramienta Pincel ahora cambiará al modo de borrado. Si es necesario, corrija los contornos en los próximos marcos de tiempo presionando el contorno de celda existente y luego presionando el botón +Agregar para crear un nuevo contorno de celda. Elimine el número S antiguo de la ventana del Administrador de superficies y cambie el nombre del nuevo contorno de celda presionando el botón Cambiar nombre si es necesario.

Si falta una celda importante completa en un TLM, cree un nuevo contorno de máscara presionando Anular selección > Polígono. Cree un nuevo contorno de celda en el primer marco del TLM haciendo clic a lo largo de la membrana celular. A continuación, vaya al último fotograma del TLM y haga lo mismo para la celda seleccionada. Al ejecutar la película en el tiempo, los contornos de celda se interpolarán. Corrija con la herramienta Pincel si es necesario. Una vez terminado, presione el botón +Agregar y cambie el nombre del contorno de la celda presionando el botón Cambiar nombre. Cuantos más puntos/clics para crear un nuevo contorno de celda, mejor funciona la interpolación.

Además de la rotación epitelial, los TlM a veces se ven afectados por el movimiento no deseado. Por lo tanto, se recomienda corregir para tal deriva de tejido en estos TLM. Al hacerlo, los TLM también se corrigen para la rotación epitelial de las cámaras de huevo, y las membranas celulares se vuelven rígidas. Esto facilita el análisis manual de las señales de actomiosina. Sin embargo, tal enfoque no permite a los científicos distinguir si las señales de actomiosina observadas se mueven o son estáticas en relación con la membrana celular. Si el objetivo de dicho análisis es una distinción entre los movimientos estáticos y activos de las señales de actomiosina, no se debe aplicar ninguna corrección de deriva tisular. Encontramos que la mayoría de las señales de actomiosina se mueven activamente en relación con la membrana celular y sólo una porción menor de ellos parecen estáticos.

Pasos críticos y solución de problemas para el análisis de señales de actomiosina subcelular

Si las estadísticas generadas contienen valores atípicos, asegúrese de que los valores extremadamente bajos o altos con respecto a todo el conjunto de datos reflejan realmente el comportamiento en la celda y no son artefactos. Esto se puede hacer identificando la celda que contiene los valores atípicos y comprobando la calidad del contorno de celda en el momento en que se midió el valor bajo/alto. A menudo, estos valores extremos son el resultado de contornos de células defectuosos que miden incorrectamente parte de otra celda. Esto puede ser especialmente evidente cuando los blobs grandes interfieren con el contorno de celda de una celda vecina. En tal caso, es crucial corregir los contornos de las celdas y repetir la medición.

Para facilitar la cuantificación, analice las señales en una superficie de celda determinada y continúe una por una hasta que todas las celdas se analicen en una subpelícula. Los resultados del análisis manual de las señales de actomiosina subcelular pueden no mostrar que la simetría se rompe en una célula y una cámara de óvulos en particular. Experimentamos que la actomiosina no rompe claramente la simetría en relación con el movimiento tisular en <10% de las cámaras de huevo giratorias (etapas 6–8). Este porcentaje se incrementa alrededor de la etapa 4^12. También encontramos que no hay diferencia si se analizan 5 min o 10 min en la identificación de la dirección preferida del movimiento de la señal de actomiosina en una cámara de huevo¹².

Pasos críticos y solución de problemas para la extracción selectiva de señales de actomiosina de tejidos curvos

El tamaño incorrecto de blobs (señales identificadas) no dará lugar a blobs y el programa se congelará en el paso siguiente. En este caso, forzar Fiji y reiniciar recientemente el plugin Elipsoid Surface Projection. Haga lo mismo cuando el programa no reaccione después de pulsar Calcular. Esto es a menudo una indicación de que se han elegido parámetros inadecuados.

Si hay demasiadas manchas y/si se concentran hacia un lado de la cámara de huevo analizada, esto puede afectar el elipsoide diseñado y no proporcionar el ajuste correcto para la cámara de óvulos. Vuelva a la identificación de blobs e intente organizar su tamaño en combinación con la selección de los ejes X, Y y Z de la cámara de óvulos. Un error al generar un buen ajuste elipsoide también ocurre a menudo cuando se utilizan configuraciones de distancia de corte inadecuadas.

Las proyecciones obtenidas a veces pueden parecer desenfocadas, o tal vez el plano z obtenido realmente se mueve entre las capas celulares cerca de la superficie de la cámara de óvulos. Esto es generalmente un signo de un elipsoide mal ajustado donde una región del elipsoide se establece demasiado lejos de la cámara de huevo. Trate de ajustar el elipsoide para que mantenga la misma distancia de la circunferencia de la cámara del huevo.

Limitaciones del método y enfoques novedosos

Este cultivo libre de cámaras de huevo omite el aplanamiento sutil de la superficie de una cámara de huevo. Para ello, este método tiene sus ventajas y desventajas. Cuando se utiliza microscopía confocal, proporciona a los usuarios imágenes de alta resolución y alta velocidad que descubren de forma fiable el comportamiento de la actomiosina en las células a la circunferencia de las cámaras de óvulos durante un corto período de tiempo (5-10 min). Sin embargo, al hacerlo, limita el tamaño de un solo plano que se puede crear una imagen con microscopía confocal a lo largo del tiempo. En general, es posible crear imágenes de hasta 15 células por cámara de óvulos en las etapas 6-8, pero sólo alrededor de dos células en las cámaras de óvulos en las etapas 1-5. Por lo tanto, hemos definido este método aquí como adecuado sólo para la escala celular local.

Para superar estos límites de tamaño causados por el tamaño limitado de un solo plano confocal, hemos desarrollado un enfoque alternativo basado en Fiji llamado Proyección de superficie elipsoide, para su uso a escala de tejido. Esto combina la microscopía de disco giratorio con una extracción de superficie semi-interactiva de cámaras de huevo a escala de tejido. De esta manera, las señales de actomiosina se pueden obtener al mismo tiempo para más de 50-100 células de una cámara de óvulos analizada. Es importante tener en cuenta que este enfoque genera conjuntos de datos muy grandes de los datos adquiridos (bytes de giga), tiene una resolución más baja (utiliza un objetivo de 40x frente a un objetivo de 63x), y también proporciona una velocidad de imagen más lenta (se necesitan 60 s para escanear a través de la mitad del tejido de un chabeno de huevo), y también proporciona una velocidad de imagen más lenta (se necesitan 60 s para escanear a través de la mitad del tejido de un chabeo de huevo) ber [etapas 6–8] y, como tal, es 10 veces más lento que el método de plano confocal limitado).

En comparación con otro software existente para extraer proyecciones en capas de superficies parametrizadas, el plugin desarrollado para este protocolo se centra en la facilidad de uso y la retroalimentación visual interactiva en cada paso del proceso. Otras herramientas, como el ImSaNE²⁰basado en MATLAB, utilizado por Chen et al.^21,se centran en el manejo de una amplia variedad de modelos de superficie parametrizados y no parametrizados y varios métodos de proyección. Por ejemplo, ImSaNE requiere que los datos se preprocieran y se alineen de una manera determinada y requiere parcialmente herramientas externas en pasos intermedios. Por el contrario, el plugin presentado aquí maneja cualquier imagen 3D/4D/5D (secuencia) que se pueda abrir en Fiji sin preprocesamiento externo. Aunque ImSaNE es altamente configurable (programable) mediante la edición de scripts de MATLAB, proporcionamos un conjunto mínimo de opciones en un flujo de trabajo que se adapta al problema específico que se describe aquí. Cada paso del flujo de trabajo interactivo proporciona resultados que se pueden inspeccionar visualmente y ajustar inmediatamente si es necesario.

La decisión sobre cuál de estos enfoques de imágenes, la escala celular o tisular local, es la mejor para un experimento en particular, depende puramente de la pregunta científica a responder (es decir, mayor frente a menor resolución; corto frente a largo tiempo de adquisición). Un buen compromiso entre estas dos escalas podría ser combinar ambos enfoques, obteniendo así la imagen de las señales de actomiosina a la escala semi-tejido (es decir, 20–30 células). Esto requiere un microscopio de disco giratorio, una lente de agua 63x con NA 1.3, y ajustes establecidos de la pila z para 20–30 células de una cámara de óvulos. Esta pila z mucho más superficial (a diferencia de la pila z requerida para la adquisición de la mitad de una cámara de huevo) permite un escaneo más rápido de menos de 60 s. El tiempo ganado aquí se puede utilizar para la adquisición repetida de la pila z para acelerar la imagen o para una recuperación de muestra (interdeja de tiempo) entre pilas z individuales. Con este último, se puede lograr un tiempo de adquisición más largo (>30 min) de TlM s de cámaras de huevo giratorias. Este enfoque semi-tejido garantiza una resolución suficiente para las señales de actomiosina y la toma de imágenes de más células al mismo tiempo durante períodos de tiempo más largos.

Aplicaciones y visión futuras

Ambos métodos descritos (a escala celular y tisular local) proporcionan un enfoque simple y de bajo costo (excluyendo dispositivos de microscopio) con efectos secundarios limitados en la red de actomiosina y se pueden implementar y adoptar fácilmente para otros tejidos animales diseccionados. El único requisito previo aquí es un protocolo de cultivo existente en una placa Petri para un tejido curvo de interés, transgenes disponibles y marcadores o métodos de etiquetado.

En combinación con la microscopía22 de fluorescencia de láminas de luz, también es posible crear imágenes de la maquinaria de actomiosina en toto (es decir, imaginar la superficie circunferencial exterior completa de las cámaras de óvulos Drosophila simultáneamente y luego desplegarse usando el plugin Elipsoid Surface Extraction). Sin embargo, hay algunas limitaciones que deben resolverse en términos de idoneidad para la toma de imágenes de alta velocidad de señales de actomiosina, a saber, 1) la incrustación de cámaras de huevo en una agarosa de fusión de punto bajo o su adherencia a un capilar durante la toma de imágenes; ii) una apertura numérica baja de lentes de agua usadas que no proporcionen suficiente resolución de señal de actomiosina; iii) el tiempo adicional necesario para adquirir varios ángulos de las cámaras de huevo, lo que evita la toma de imágenes de alta velocidad.

Con este fin, es previsible que, con el refinamiento de parámetros del microscopio como la velocidad para escanear a través del tejido epitelial y la mejora de las lentes microscópicas usadas, el análisis detallado de la maquinaria actomiosina, en el futuro, permita, en el futuro, prometiendo resultados de alta resolución que se obtendrán en el tejido y en escala toto durante largos períodos de tiempo.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores están muy agradecidos a Miriam Osterfield por compartir sus consejos sobre la imagen de vida in vitro de las cámaras de óvulos utilizando un enfoque adoptado por el laboratorio Celeste Berg⁴. También damos las gracias a Sebastian Tosi por el script de Fiji que permite la segmentación de células.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Schneider Medium	Gibco	21720-024	[+]-Glutamine
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122	[+] 10.000 Units/mL Penicillin [+] 10.000 µg/mL Streptomycin
Fetal Bovine Serum	Sigma	F135	Heat inactivated
Insulin Solution Human	Sigma	I9278
50 mL Falcon tubes	Eppendorf		sterile
Millex-GV filter	Millipore	SLGV033NS	33 mm
Glass Bottom Microwell Dishes	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C	35 mm Petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 cover glass
Forceps	A. Dumont & Fils		#55
CellMask Deep Red (cell membrane dye)	Invitrogen	C10046
FM4-64 (cell membrane dye)	ThermoFisher/Invitrogen	T13320
Depression dissection slide	Fisher Scientific	12-560B
Microscopic equipment
Steromicroscope	e.g. Zeiss		Stemi SV 6
Inverted confocal microscope	e.g. Zeiss/Olympus
Spinning disc microscope	e.g. Zeiss/Andor
Microscopic glass/cover glass	e.g. Thermo Scientific/Menzel Glas
Cactus tool
Wironit needle holder	Hammacher	9160020
Cactus spine	Echinocactus grusonii/barrel cactus
Drosophila stocks used in the manuscript
AX³/AX³; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP			For detail see Rauzi et al.: Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodeling. Nature 2010, Vol. 468, pg. 1110-1115.
AX³/AX³; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP; fat2^58D/fat2^103C			For detail see Viktorinova et al.: Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations. PLoS Genetics 2017, Vol. 13, Issue 11, pg. e1007107.

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References

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Developmental Biology

Análisis de la dinámica de Actomyosin en escalas celulares y de tejidos locales utilizando películas de lapso de tiempo de cámaras de huevo de Drosophila cultivada

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Protocol

Representative Results

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Disclosures

Acknowledgments

Materials

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