Summary
כאן, אנו להעריך את ההשפעות של תמצית המים של רוטה הקבר על היווצרות הרשת באמצעות שימוש בשיטת היווצרות צינור על מטריצה מרתף ג.
Abstract
אנגיוגנזה היא תופעה הכוללת תהליכים שונים, כגון הפצת תאים אנדותל, בידול והגירה, המובילה להקמת כלי דם חדשים ומערבת מספר מסלולים של אותות התמרה. כאן אנו מראים ששיטת היווצרות הצינורות היא דרך פשוטה להעריך את ההשפעה של מוצרים טבעיים על אנגיוגנזה ולחקור את המנגנונים המולקולריים המעורבים. בפרט, בנוכחות תמצית המים של רוטה האלגני (rgwe), תאי האנדותל אינם מסוגלים עוד ליצור רשת תא תא וכי השפעות rgwe על תא הטבור האנושי (huvec) היווצרות שפופרת בוטלה על ידי ה הפעלה חוקתית של מק.
Introduction
אנגיוגנזה הוא תהליך פיזיולוגי המוביל להיווצרות כלי דם חדשים מקיימים ומתרחש במהלך צמיחת embryogenesis ואיברים. בבגרות, אנגיוגנזה מופעל רק בשחלה רכיבה על אופניים, השליה במהלך ההריון, במהלך ריפוי פצעים ותיקון. אנגיוגנזה תלוי ביכולת של תאי האנדותל להתרבות, להבדיל ולהגר ליצירת רשת כלי דם מלאה1. עם זאת, במספר הפרעות, כגון מחלות דלקתיות, מטבולית ושגרונית, תהליכי אנגיוגנטיים משתנים ואנגיוגנזה הופך להיות מוגזם. יתר על כן, תהליכים אנגיוגנטית מבוקרת גם לעורר התקדמות הגידול גרורות1. מסיבות אלה, בעשור האחרון, לימודי מחקר מתמקדים בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות שמטרתן עיכוב של אנגיוגנזה מוגזם בסרטן, בעינית, במפרק, או בהפרעות בעור2,3.
גורם הגדילה של כלי הדם (מהווה את המטרה העיקרית של הטיפולים הקיימים אנטי-אנגיוגנטיים4, ומספר נוגדנים אנטי-וסקולריים שפותחו ומסונתז כדי למנוע אנגיוגנזה מוגזם. עם זאת, תרופות סינתטי אלה להראות תופעות לוואי חמורות יש יחס שלילי לתועלת הרווח5,6. לכן, זה הכרחי למצוא אסטרטגיות טיפוליות חדשות כדי להגביל אנגיוגנזה מוגזם עם תופעות לוואי מינימליות כדי להשלים ולשלב עם סמים המשמשים כיום. תרופות חדשות אלה ניתן למצוא בין מוצרים טבעיים המאופיינת מגוון כימי גבוה וספציפיות הביוכימי.
במאמר זה, אנו מציעים שיטה פשוטה כדי להעריך את ההשפעה של RGWE על היכולת של HUVECs ליצור tubules על מטריצה מרתף g, מבחנה5. אכן, rgwe הוא תערובת של מטבוליטים משני כגון פלאונואידים ו פוליפנולים ביניהם רוטין הוא המרכיב העיקרי5. רבים מהם נבדקו כבר כסוכנים אנטי דלקתיים ובעלי מצבר7,8,9,10,11. יתר על כן, לאחרונה הדגמנו כי rgwe, אבל לא rutin, הוא מסוגל לעכב את היכולת huvec ליצור tubules על מטריצה מרתף g, כי תופעה זו מתווכת על ידי מסלול מק-טיפשה, המציין rgwe ככלי טיפולי פוטנציאלי מסוגל ל למנוע היווצרות כלי דם חדש מוגזמת5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת RGWE
- במהלך חודשי האביב/הקיץ בפיקוחו של בוטניקאי יש לאסוף את העלים מצמחים.
הערה: במקרה זה, העלים נאספו בסעיף ניסיוני של צמחי מרפא בגן הבוטני של נאפולי, איטליה5. המפעל הוא ספונטני, רב שנתי, והוא נוכח באזורים הים התיכון (איור 1). - שוקלים 250 גרם של עלים וקוצצים דק אותם עם מספריים.
- לשים את העלים בבקבוקון חרוט ולהוסיף 1 L של מים מזוקקים כדי 250 גרם של עלים קצוצים ולהביא את זה לרתיחה ב 110 ° c עבור 60 דקות. לכסות את הבקבוקון עם רדיד אלומיניום כדי למנוע אידוי מוגזם.
- השתמש בנייר סינון של 3 מ"מ משפך כדי להפריד את העלים המבושלים משלב הנוזלים המייצג את תמצית המים.
- לסנן את השלב הנוזלי באמצעות פילטר 0.22 יקרומטר, לאסוף אותו בגביע. כסו את הגביע בעזרת parafilm והקפא את התמצית ב-80 ° c בלילה.
- הפוך 10-15 חורים עם מחט בתוך הפראפilm וליאופליז בתמצית בליאופליזר. שים לב כי זה יכול לקחת כמה ימים כדי להשיג את האבקה.
- שוקלים את האבקה שמתקבלת, מחלקים אותו לתוך הליברוטים, ומאחסנים אותה ב -4 ° צ' עד הצורך. ניתן לאחסן אותו במשך שנה.
- בעת הצורך בניסויים, להכין פתרון מניות, לדלל את האבקה עם מים מזוקקים לריכוז רגיל של 50 mg/mL. הפרד אותו לנפח קטן (לדוגמה, 1 mL). הכנה זו יכולה להיות מאוחסנת ב-20 ° צ' עד לשימוש, אך לא ניתן לאחסנו ב-4 ° c במשך יותר מכמה ימים בגלל החמצן של המולקולות. הימנע הקפאה והפשרה.
2. תרבית תאים
- לטפח HUVECs במדיום צמיחת תא אנדותל: המדיום הבסיס אנדותל שיושלם עם 1 μg/mL הידרוקורטיזון ו 1 ng/mL גורם צמיחה באפידרמיס, 10% FBS, ו פניצילין/סטרפטומיצין ב 37 ° c באווירה של 5% CO2.
- כאשר 80% שוטפת, פצל את התאים ביחס של 1:3 בכל מעבר. השתמש בתאים משתיים עד חמישה מעברים, שאינם מראים הבדלים גלויים בתגובה לגורמי גדילה. לאחר המעבר השישי, התאים הופכים להיות שאינם יוצרים צינורות על מטריצת המרתף הגושית.
3. מעבר חצייה
- כאשר HUVECs הם 70% confluent, מעביר אותם עם הגן הרצוי.
- עבור צלחת 100 מ"מ, השתמש 1 μg של ריק pCDNA3 וקטור כמו שליטה 1 μg של pCDNA3 וקטור המכיל את הגן של עניין (מק פעיל באופן מכונן [caMEK], במקרה זה).
- קומפלקס 1 μg של ה-DNA עם 3 μL של lipofectamine 2,000, מדולל בינוני סרום מופחת (ראה טבלת חומרים) לנפח הסופי של 200 μl. הסר את המדיום מן התאים ולהחליף אותו עם 1 מ ל של מדיום מלאה טריים; לאחר מכן, הוסף את פתרון ההעברה לתאים. דגירה את התאים בחממה ב 37 ° c, עם 5% CO2. ניתן גם להשתמש בסוכני הlipofectamine אחרים שונים מ-2,000, בעקבות הוראות היצרן.
- הוסף 7 מ ל של מדיום טרי מלאה 3 שעות לאחר הגלגול ולאחר מכן, לאחר מכן, מודצ נוסף את התאים ב 37 ° c עבור 24-48 h לפני שתמשיך עם assays הבא. יום לאחר החצייה, החליפו את המדיום במדיום מלאה ורעננה.
4. שיטת היווצרות הצינור
- מגניב 96 צלחת לוחית ומצננים הצינורות ב 4 ° צ' עבור 1 h לפני הכנת מרתף ג.
- ברגע של הכנת המרתף, לשים את הצלחת על הקרח (0 ° c) ולהוסיף 50 μL של מטריצה קרה בכל טוב תוך הימנעות היווצרות של בועות. שים לב כי המבחנה המכילה מטריקס יש לשמור על הקרח במהלך ההליך מאז המטריצה הופכת יציבה בטמפרטורת החדר.
- שים את הצלחת בחממה ב 37 ° c עם 5% CO2 עבור לפחות 30 דקות כדי לאפשר את המרתף כדי פולימלזציה.
- . בינתיים, תקצור את התאים שטוף את HUVECs עם 1 מ ל של 0.25% טריפסין/0.53 מ"מ פתרון EDTA; לאחר מכן, להוסיף 2 מ ל של הפתרון טריפסין-EDTA ו הדגירה ב 37 ° c עבור 5 דקות. שימו לב לתאים שמתחת למיקרוסקופ הפוך כדי לוודא ששכבת התא מפוזרת לחלוטין. לאחר מכן, לאסוף את המדיום שבו התאים מושעה ולקצור את התאים המנותקים על ידי צנטריפוגה ב 264 x g עבור 3 דקות. להשעות אותם ב 1 מ ל של מלוחים באגירה פוספט (PBS).
- כדי לספור את התאים, להוסיף 0.2 mL של ההשעיה התא ל 0.5 mL של PBS ו 0.3 mL של 0.4% טרי, פתרון כחול. לאחר 5 דקות בטמפרטורת החדר, ספור את התאים בחדר בורקר.
- להשעות את התאים בינוני מלא בריכוז של 2 x 104 תאים/50 μl. Seed אותם על המרתף ג בריכוז של 2 x 104 תאים לכל טוב ולתת להם ליישב על זה.
- שים לב למספר התאים. רבים מדי או יותר מדי תאים לא יכול ליצור צינורות בדרך הנכונה במרתף ג.
- להכין מינונים הגוברת של rgwe (0.01, 0.1, ו-1 מ"ג/mL), לדלל את פתרון המניה במדיום התרבות או רוטין (12, 120, ו300 μg/mL), הכל בנפח הסופי של 50 μl/ובכן, ולהוסיף אותם ל-50 μl/באר של השעיית תאים. הכרך האחרון בכל באר יהיה 100 μL. הכינו ארבע עד שש בארות. לכל מצב ניסיוני כפקד, לדלל מים מזוקקים (רכב) במדיום התרבות ביחס של 1:50.
- דגירה את התאים בחממה ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עבור זמן הנע בין 6 אל 24 h.
- שימו לב לתאים בטווח הזמן שבין 6 ל -24 שעות לאחר זריעה, תוך שימוש במיקרוסקופ עם ניגודיות פאזה בהגדלה של 10X. HUVECs מסוגלים ליצור מבנים כמו tube בתוך 6 h אבל זה אפשרי להתבונן תוצאות טובות יותר לאחר 12-18 h. לצלם את מבנים כמו צינור על כל היטב התמונה ממוצע בין שלושה עד חמישה שדות אקראיים בכל טוב.
- לאחר רכישת התמונה, ניתן להתנתק מן התאים מתוך מטריצת המרתף ולבחון את השפעת הטיפול במספר התאים. עבור כל באר, להסיר את המדיום, להוסיף dispase בריכוז של 24 U/mL, ולשים את הצלחת ב 37 ° c עבור 1 h. אז, מכל באר, לאסוף את המדיום שבו התאים מושעה והקציר התאים המנותקים על ידי צנטריפוגה ב 264 x g עבור 3 דקות. השהה אותם ב 0.2 ML של PBS. כדי לספור את התאים, להוסיף 0.2 mL של השעיית התא 0.5 mL של PBS ו 0.3 mL של 0.4% טרימין כחול פתרון. לאחר 5 דקות בטמפרטורת החדר, ספור את התאים בחדר בורקר.
- כדי לכמת את התוצאות של שיטת היווצרות הצינורית, ניתן לספור את מספר נקודות הסניף בהן לפחות שלוש שפופרות מצטרפות. באמצעות תוכנת התמונה המתאימה, לספור עבור כל שדה בכל מיקרוגרף את מספר נקודות הסתעפות ולחשב את הממוצע ± השגיאה הסטנדרטית (SE) עבור כל תנאי ניסיוני. השתמש במבחן דו -זנבי כדי להעריך משמעות סטטיסטית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי להעריך את ההשפעה של RGWE על אנגיוגנזה, בוצע שיטת היווצרות שפופרת על מטריצת מרתף מגולב. כאשר מטפחים אותו, HUVECs טופס מבנים כמו צינור שמקורם תאים המופיעים מוארך והמחברים זה את זה כדי ליצור רשת תא תא (איור 2). באיור 3, אנו מראים כי מספר הסניפים ב HUVECs טופלו עם rgwe היה נמוך באופן משמעותי בהשוואה לתנאי השליטה. בעיקר, בנוכחות של 0.1 mg/mL ו 1 מ"ג/mL RGWE, מספר הסניפים נמוכים יותר על-ידי 40% ו 60%, בהתאמה, בהשוואה לתנאי הפקד. מאז רוטין המצוין כמרכיב העיקרי של rgwe5, ניתחנו את השפעתו על היווצרות שפופרת huvec. כפי שמוצג באיור 4, רוטין לבד אינו מסוגל להשפיע על היכולת של huvecs ליצור רשת תא תא. לאחר מכן, השתמשנו במערך היווצרות הצינורית כדי לחקור את המנגנון המולקולרי הנמצא בבסיס העיכוב הנגרם על-ידי מערך הצינור. ה-מק/טיפשה תאיים מסלול איתות מפעיל תפקיד מרכזי בתהליכים אנגיוגנטית. הווצ ' מנוכר על ידי caMEK טופלו RGWE וטיפח על מטריקס במרתף g,. כפי שמוצג באיור 5, ב-camek-מעבר תאים אנדותל, rgwe כבר לא מעכב את היווצרות הצינור, בעוד תאים מבוים לאחר השימוש, משמש כפקד, עדיין בצורת רשת תא תא על מטריקס במרתף g, ו מגיבים rgwe, ובכך לציין כי השפעת ה-RGWE באנגיוגנזה מתווכת על-ידי מסלול ה-מק-טיפשה.
איור 1: רוטה גרבאנס. שיח של רוטה האולנס . אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: huvecs טופס מבנים כמו שפופרת על מטריצה מרתף ג. מייצגים תמונות מיקרוסקופיים של huvecs תרבותי בצלוחית קלקר (משמאל) ועל מטריצה המרתף ג (מימין). סרגל קנה מידה = 10 μm.
איור 3: RGWE מעכב את היווצרות הצינור HUVECs. (A) הכוח הגבוה תצלומים מיקרוסקופיים של huvecs תרבותי על מטריצה במרתף ג שטופלו rgwe (0, 0.01, 0.1, ו 1.0 mg/mL). סרגל קנה המידה הוא 10 μm. (ב) האחוז של נקודת הסניף HUVEC (אפור כהה) בנוכחות rgwe (0.01, 0.1, ו 1.0 Mg/mL) לעומת תאים לא מטופלים (0 מ"ג/mL) ו טרי, מבחן הדרה כחול (אפור בהיר) על Huvec שטופלו (0.01 , 0.1, ו 1 מ"ג/mL) או לא (0 מ"ג/mL) עם RGWE עבור 24 h. *p < 0.01 מול מצב הפקד (0 מ"ג/ml). התוצאות מבוטאים כממוצע ± SE של שלושה ניסויים עצמאיים. המשמעות הסטטיסטית הושגה במבחן דו- זנבי.
איור 4: Rutin אינו משפיע על היווצרות שפופרת HUVEC. (A) הכוח הגבוה תצלומים מיקרוסקופיים של huvecs הנזרע על מטריצה מרתף ג מטופלים (12, 120, ו 300 μg/ml) או לא (0 μg/mL) עם רוטין עבור 24 שעות. סרגל קנה המידה הוא 10 μm. (ב) האחוז של נקודת הסתעפות huvec (אפור כהה) בנוכחות הגדלת מינונים של רוטין (12, 120, ו 300 μ/mL) לעומת תנאי שליטה (0 μg/mL) ו טריטן כחול מבחן הדרה (אפור בהיר) על huvec שטופלו (12 , 120, ו 300 μ/ml) או לא (0 μg/mL) עם רוטין עבור 24 שעות. התוצאות מבוטאים כממוצע ± SE של שלושה ניסויים עצמאיים. משמעות סטטיסטית הושגה על-ידי מבחן tדו-זנבי.
איור 5: מסלול מק המסלול מדיה RGWE השפעות על היווצרות צינור HUVEC. (א) תמונות מיקרוסקופיים בעלי כוח גבוה של huvecs מזוהמים עם וקטור ריק (העברה מדמה) או עם camek, הנזרע על מטריצת מרתף ג וטיפל במינונים הגוברת של rgwe (0, 0.01, 0.1, ו 1 מ"ג/mL). סרגל קנה המידה הוא 10 μm. (ב) אחוז מספר נקודות הסתעפות ב-huvecs מבוים-העברה (אפור כהה) ו ב HUVECs מנוכר עם camek (אפור בהיר) וטיפל עם מינונים גוברת של rgwe (0.01, 0.1, ו 1 מ"ג/mL) לעומת שליטה תנאים (0 מ"ג/mL). *p < 0.01 לעומת מצב הפקד; § p < 0.05 לעומת תאים שעברו עם הווקטור הריק וטופלו באותה כמות rgwe. התוצאות מבוטאים כממוצע ± SE של שלושה ניסויים עצמאיים. המשמעות הסטטיסטית הושגה במבחן דו- זנבי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תרכובות טבעיות מתאפיינות בגיוון כימי גבוה ובחומרים ביוכימיים ומייצגים מקור למולקולות טיפוליות בפוטנציה. כאן, אנו מראים כיצד להשיג תמצית מים מהמפעל R. קברות ולהציע את שיטת היווצרות הצינור כשיטה קלה לביצוע, אמין, כמותית שימושי כדי לחקור את ההשפעות של rgwe על אנגיוגנזה. חשוב להרתיח את העלים של R. קברות עבור 1 h כדי להיות בטוח לקבל את תמצית המים השלמה. הרתחה של פחות מ 1 h לא איפשרה את החילוץ של כל המולקולות, ואת התמצית לא יכול להפעיל את האפקט הביולוגי צפוי.
שיטת היווצרות הצינור מייצגת בדיקת מבחנה כדי ללמוד את המנגנונים המולקולריים שבבסיס השלבים המובילים להיווצרות כלי דם חדשים. הדבר מאפשר לחוקרים לזהות תרכובות המסוגלים לווסת את האנגיוגנזה, כמו גם את החלבונים והאותות הקשורים למפלים. יתרה מזאת, שיטת המחקר מאפשרת לחוקרים לבדוק חומרים שיכולים להשפיע, באותו זמן, הפצת תאים אנדותל, הדבקה, הגירה ופעילות פרוטאז, כל המנגנונים החשובים במערך כלי הדם. באמצעות מבחן זה בלבד, אנו מראים כי RGWE, אבל לא rutin המרכיב העיקרי שלה, הוא מסוגל להפחית את היכולת של HUVECs ליצור מבנים כמו שפופרת מבלי להשפיע על הכדאיות התא וכי אפקט זה תלוי בהפעלת מסלול של מק. עם זאת, חשוב לבצע את הבדיקה עם המספר הנכון של תאים. למעשה, מעטים מדי או תאים רבים מדי לא יכול לאפשר את היווצרות הנכון של הצינורות. מסיבה זו, מומלץ לבצע בדיקה ראשונית כדי למצוא את מספר התאים הנכון. יתר על כן, מספר מעברי התאים הוא חשוב כמו מספר התא מאז, כדי להשיג את התצורה הנכונה היווצרות הצינור, התאים צריכים להיות מעבר פעמיים עד חמש פעמים. לאחר מעבר 6, מתרחשים מנגנוני הזדקנות כי יכול לפגוע במערך הצינור הימני.
שיטת היווצרות הצינור היא שיטת התגבשות מאוד, והיא שופך אור על הפיזיולוגיה של תאי האנדותל, גם אם זה לא התקן הזהב למחקר תלת מימדי של היווצרות שפופרת8,9,10, . בסדר, 11 קולגן תלת מימדי ומודלים פיברוב הוכחו להיות טובים יותר עבור חקירות של tubulogenesis כלי דם, לבלוב, ואינטראקציה של תא באנדותל. עם זאת, לעומת שיטת היווצרות הצינור על מטריצה במרתף ג בדיקות אלה הם יותר זמן וכסף צורכת11, הרומז כי הראשון יכול להיות בדיקה טובה כדי לקבל תוצאות ראשוניות שיכול להיות בסיס ממוקד יותר במחקרים vivo. בסופו של דבר, ניתן לבצע את שיטת היווצרות הצינורות ב -24 שעות, מכיוון שהhuvecs בלתי-משתנה מסוגלים ליצור מבנים כמו שפופרת בתוך 6 h12,13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו ממומנת על ידי Fondi di Ateneo כדי לוקה קולוצ-דאמאטו ו VALERE תוכניות קרנות למריה תרזה גויים ו AIRC קרן IG18999 למיאוריציו Bifulco.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HUVEC cells | Clontech | C2519A | |
| FBS | Invitrogen | 10270106 | |
| EBM-2 basal medium | Clontech | cc3156 | |
| Single quot kit- supplemets and growth factors | clontech | cc4147 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| 96-well plates | Thermo Scientific | 167008 | |
| 15 mL conical tubes | Sarstedt | 62,554,502 | |
| 10 mL disposable serological pipette | Sarstedt | 861,254,001 | |
| 5 mL disposable serological pipette | Sarstedt | 861,253,001 | |
| 1,000 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| 100 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| 20 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| p1000 pipette tips | Sarstedt | ||
| p20-200 pipette tips | Sarstedt | 70,760,502 | |
| Burker chamber | Fortuna | ||
| Trypan blu stain | Gibco | 15250-061 | |
| DPBS | Gibco | 14190-094 | |
| mill-ex 0.22 μm filters | Millipore | SLGS033SS | |
| Lyophilizer | VirTis-SP Scientific | ||
| Incubator | Thermo Scientific | ||
| CO2 | AirCos | ||
| Pen-Strep | Gibco | 15070-063 | |
| 100 mm dish | Sarstedt | 833,902 | |
| pcDNA3 | Invitrogen | v79020 | |
| Lipofectamine-2000 | Invitrogen | 11668027 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | Reduced serum medium |
| Rutin | Sigma-Aldrich | R5143-50G | |
| Axiovert 25 microscope | Zeiss | ||
| AmScope MD500 camera | AmScope | ||
| Dispase | Thermo Scientific | D4818 | |
| Lab heater | Falc | ||
| ParaFilm | American National Can |
References
- Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473 (7347), 298-307 (2011).
- Ferrara, N., Kerbel, R. S. Angiogenesis as a therapeutic target. Nature. 438 (7070), 967-974 (2005).
- Ravishankar, D., Rajora, A. K., Greco, F., Osborn, H. M. I. Flavonoids as prospective compounds for anti-cancer therapy. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45, 2821-2831 (2013).
- Gentile, M. T., et al. Ruta graveolens water extract inhibits cell-cell network formation in human umbilical endothelial cells via MEK-ERK1/2 pathway. Experimental Cell Research. 364 (1), 50-58 (2018).
- Butler, M. S. Natural products to drugs: natural product-derived compounds in clinical trials. Natural Product Reports. 25, 475-516 (2008).
- Sulaiman, R. S., Basavarajappa, H. D., Corson, T. W. Natural product inhibitors of ocular angiogenesis. Experimental Eye Research. 129, 161-171 (2014).
- Risau, W.
- Trung, N. X. In vitro models for angiogenesis. Journal of Science & Development. 13 (4), 850-858 (2015).
- Ucuzian, A. A., Greisler, H. P.
- Simons, M., et al. American Heart Association Council on Basic Cardiovascular Sciences and Council on Cardiovascular Surgery and Anaesthesia. State-of-the-Art Methods for Evaluation of Angiogenesis and Tissue Vascularisation: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circulation Research. 116 (11), e99-e132 (2015).
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nature Protocols. 5 (4), 628-635 (2010).
- DeCicco-Skinner, K. L., et al. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. Journal of Visualized Experiments. (91), e51312 (2014).
