Summary
Hier evaluieren wir die Auswirkungen des Wasserextrakts von Ruta-Grabolen auf die Gefäßnetzbildung, indem wir einen Rohrbildungstest auf eine gegelte Kellermatrix verwenden.
Abstract
Angiogenese ist ein Phänomen, das verschiedene Prozesse umfasst, wie endotheliale Zellproliferation, Differenzierung und Migration, die zur Bildung neuer Blutgefäße führen und mehrere Signaltransduktionswege beinhalten. Hier zeigen wir, dass der Rohrbildungstest eine einfache In-vitro-Methode ist, um die Auswirkungen natürlicher Produkte auf die Angiogenese zu bewerten und die beteiligten molekularen Mechanismen zu untersuchen. Insbesondere sind Endothelzellen in Gegenwart des Wasserextrakts von Ruta graveolens (RGWE) nicht mehr in der Lage, ein Zellzellnetz zu bilden, und dass die RGWE-Wirkungen auf die Endothelzellbildung der menschlichen Nabelvene (HUVEC) durch die konstitutive Aktivierung von MEK.
Introduction
Angiogenese ist ein physiologischer Prozess, der zur Bildung neuer Blutgefäße aus bereits bestehenden führt und während der Embryogenese und des Organwachstums auftritt. Im Erwachsenenalter wird die Angiogenese nur im Radfahren des Eierstocks, in der Plazenta während der Schwangerschaft und während der Wundheilung und -reparatur aktiviert. Die Angiogenese hängt von der Fähigkeit der Endothelzellen ab, sich zu vermehren, zu differenzieren und zu einem intakten Gefäßnetz zu migrieren1. Bei mehreren Erkrankungen, wie entzündlichen, metabolischen und rheumatischen Erkrankungen, werden angiogene Prozesse jedoch verändert und die Angiogenese wird exzessiv. Darüber hinaus stimulieren unkontrollierte angiogene Prozesse auch die Tumorprogression und Metastasierung1. Aus diesen Gründen konzentrieren sich die Forschungsstudien in den letzten zehn Jahren auf die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien zur Hemmung übermäßiger Angiogenese bei Krebs-, Augen-, Gelenk- oder Hauterkrankungen2,3.
Der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF) stellt das Hauptziel der aktuellen antiangiogenen Therapien4dar, und mehrere monoklonale Antikörper gegen VEGF wurden entwickelt und synthetisiert, um eine übermäßige Angiogenese zu verhindern. Jedoch, Diese synthetischen Drogen zeigen schwere Nebenwirkungen und haben ein ungünstiges Kosten-Nutzen-Verhältnis5,6. Daher ist es unerlässlich, neue therapeutische Strategien zu finden, um übermäßige Angiogenese mit minimalen Nebenwirkungen zu begrenzen, um mit derzeit verwendeten Medikamenten zu ergänzen und zu kombinieren. Diese neuen Medikamente finden sich unter natürlichen Produkten, die sich durch eine hohe chemische Vielfalt und biochemische Spezifität auszeichnen.
In diesem Artikel schlagen wir eine einfache Methode vor, um die Auswirkungen der RGWE auf die Fähigkeit von HUVECs zu bewerten, Tubuli auf einer gegelten Kellermatrix in vitro5zu bilden. In der Tat ist RGWE eine Mischung aus sekundären Metaboliten wie Flavonoiden und Polyphenolen, unter denen Rutin die Hauptkomponente ist5. Viele von ihnen wurden bereits als entzündungshemmende und vasoprotektive Mittel7,8,9,10,11getestet. Darüber hinaus haben wir vor kurzem gezeigt, dass RGWE, aber nicht Rutin, in der Lage ist, die HUVEC-Fähigkeit, Tubulen auf einer gegelten Kellermatrix zu bilden, zu hemmen und dass dieses Phänomen durch den MEK-ERK-Weg vermittelt wird, was darauf hindeutet, dass RGWE ein mögliches therapeutisches Werkzeug ist, das in der Lage ist, übermäßige Bildung neuer Blutgefäße zu verhindern5.
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Protocol
1. RGWE Vorbereitung
- Sammeln Sie R. graveolens Blätter von Pflanzen während der Frühlings-/Sommermonate unter der Aufsicht eines Botanikers.
HINWEIS: In diesem Fall wurden Die Blätter in der Experimentellen Abteilung für Heilpflanzen im Botanischen Garten von Neapel, Italien5gesammelt. Die Pflanze ist spontan, mehrjährige, und ist in den Mittelmeerregionen vorhanden (Abbildung 1). - 250 g Blätter wiegen und mit einer Schere fein hacken.
- Die Blätter in einen konischen Kolben geben und 1 L destilliertes Wasser zu 250 g gehackten Blättern geben und bei 110 °C 60 min zum Kochen bringen. Den Kolben mit Aluminiumfolie bedecken, um übermäßige Verdunstung zu vermeiden.
- Verwenden Sie 3 mm-Trichterfilterpapier, um die gekochten Blätter von der flüssigen Phase zu trennen, die den Wasserextrakt darstellt.
- Filtern Sie die Flüssigphase durch einen 0,22 m-Filter und sammeln Sie sie in einem Becher. Den Becher mit Parafilm bedecken und den Extrakt über Nacht bei -80 °C einfrieren.
- Machen Sie 10 - 15 Löcher mit einer Nadel im Parafilm und lyophilisieren Sie den Extrakt in einem Lyophilisator. Beachten Sie, dass es ein paar Tage dauern kann, um das Pulver zu erhalten.
- Wiegen Sie das erhaltene Pulver, teilen Sie es in Aliquots auf und lagern Sie es bei 4 °C, bis es notwendig ist. Es ist möglich, es für ein Jahr zu speichern.
- Bei Bedarf für die Experimente eine Stammlösung vorbereiten, die das Pulver mit destilliertem Wasser auf eine Standardkonzentration von 50 mg/ml verdünnt. Trennen Sie es in kleine (z.B. 1 ml) Aliquots. Dieses Präparat kann bis zur Verwendung bei -20 °C gelagert werden, kann aber aufgrund der Oxidationen der Moleküle nicht mehr als ein paar Tage bei 4 °C gelagert werden. Vermeiden Sie Einfrieren und Tauen.
2. Zellkultur
- Kultivieren Sie HUVECs im endothelialen Zellwachstumsmedium: endotheliale Basalmedium, ergänzt mit 1 g/ml Hydrocortison und 1 ng/ml epidermalem Wachstumsfaktor, 10% FBS, und Penicillin/Streptomycin bei 37 °C in einer Atmosphäre von 5%CO2.
- Wenn 80% konfluent, teilen Sie die Zellen im Verhältnis 1:3 jede Passage. Verwenden Sie Zellen von zwei bis fünf Passagen, die keine offensichtlichen Unterschiede in der Reaktion auf Wachstumsfaktoren zeigen. Nach dem sechsten Durchgang werden die Zellen seneszierend und bilden keine Schläuche auf der gegelten Kellermatrix.
3. Transfektion
- Wenn die HUVECs zu 70% konfluent sind, transfekt sie mit dem gewünschten Gen.
- Für eine 100-mm-Platte verwenden Sie 1 g leeren pCDNA3-Vektor als Kontrolle und 1 g pCDNA3-Vektor, der das betreffende Gen enthält (in diesem Fall konstitutiv aktives MEK [caMEK).
- Komplexe DNA mit 3 l Lipofectamin 2.000, verdünnt mit reduziertem Serummedium (siehe Materialtabelle)bis zum Endvolumen von 200 l. Entfernen Sie das Medium aus den Zellen und ersetzen Sie es durch 1 ml frisches, vollständiges Medium; fügen Sie dann die Transfecting-Lösung zu den Zellen hinzu. Inkubieren Sie die Zellen im Inkubator bei 37°C, mit 5% CO2 . Es ist möglich, auch andere Transfektionsmittel zu verwenden, die sich von Lipofectamin 2.000 unterscheiden, nach den Anweisungen des Herstellers.
- Fügen Sie 7 ml komplettes frisches Medium 3 h nach der Transfektion hinzu und inkubieren Sie die Zellen dann bei 37 °C für 24 - 48 h weiter, bevor Sie mit den nächsten Tests fortfahren. Ersetzen Sie am Tag nach der Transfektion das Medium durch ein frisches komplettes Medium.
4. Tube Formation Assay
- Eine 96-Well-Platte und Pipettenspitzen bei 4 °C 1 H abkühlen, bevor Sie den gegelten Keller vorbereiten.
- Zum Zeitpunkt der Kellervorbereitung die Platte auf Eis legen (0 °C) und in jedem Brunnen 50 l kalte Matrix hinzufügen, während die Bildung von Blasen vermieden wird. Beachten Sie, dass die matrixhaltige Durchstechflasche während des Verfahrens auf Eis gehalten werden sollte, da die Matrix bei Raumtemperatur fest wird.
- Legen Sie die Platte in den Inkubator bei 37 °C mit 5% CO2 für mindestens 30 min, damit der Keller polymerisieren kann.
- In der Zwischenzeit ernten Sie die Zellen. Waschen Sie die HUVECs mit 1 ml einer 0,25% Trypsin/0,53 mM EDTA Lösung; Dann 2 ml der Trypsin-EDTA-Lösung hinzufügen und bei 37 °C für 5 min inkubieren. Beobachten Sie die Zellen unter einem invertierten Mikroskop, um zu überprüfen, ob die Zellschicht vollständig dispergiert ist. Dann sammeln Sie das Medium, in dem die Zellen suspendiert werden, und ernten Sie die abgetrennten Zellen durch Zentrifugation bei 264 x g für 3 min. Setzen Sie sie in 1 ml Phosphat-gepufferter Saline (PBS) aus.
- Um die Zellen zu zählen, fügen Sie 0,2 ml der Zellsuspension zu 0,5 ml PBS und 0,3 ml 0,4% Trypan-Blaulösung hinzu. Nach 5 min bei Raumtemperatur die Zellen in einer Bürker-Kammer zählen.
- Setzen Sie die Zellen in vollständigem Medium in der Konzentration von 2 x 104 Zellen/50 l aus. Samen Sie sie in der Konzentration von 2 x 104 Zellen pro Brunnen in den gegelten Keller und lassen Sie sie sich darauf niederlassen.
- Achten Sie auf die Anzahl der Zellen. Zu viele oder zu wenige Zellen bilden im gegelten Keller möglicherweise keine Schläuche auf die richtige Art und Weise.
- Vorbereiten sie steigende Dosen von RGWE (0,01, 0,1 und 1 mg/ml), verdünnen Sie die Stammlösung in Kulturmedium oder Rutin (12, 120 und 300 g/ml), alles im Endvolumen von 50 l/well, und fügen Sie sie zu 50 l/Well der Zellsuspension hinzu. Das endige Volumen in jedem Brunnen beträgt 100 l. Bereiten Sie vier bis sechs Brunnen für jede experimentelle Bedingung vor. Als Kontrolle wird destilliertes Wasser (Fahrzeug) im Kulturmedium im Verhältnis 1:50 verdünnt.
- Inkubieren Sie die Zellen im Inkubator bei 37 °C und 5%CO2 für eine Zeit von 6 bis 24 h.
- Beobachten Sie die Zellen innerhalb eines Zeitbereichs von 6 bis 24 h nach der Aussaat, mit einem Phasenkontrastmikroskop bei einer Vergrößerung von 10X. HUVECs sind in der Lage, röhrenartige Strukturen innerhalb von 6 h zu bilden, aber es ist möglich, bessere Ergebnisse nach 12 - 18 h zu beobachten. Fotografieren Sie die röhrenartigen Strukturen auf jedem Brunnen und stellen Sie einen Durchschnitt von drei bis fünf zufälligen Feldern in jedem Brunnen.
- Nach der Bildaufnahme können die Zellen von der Kellermatrix gelöst und gezählt werden, um die Wirkung der Behandlung auf die Anzahl der Zellen zu bewerten. Für jeden Brunnen das Medium entfernen, Dispase bei einer Konzentration von 24 U/ml hinzufügen und die Platte 1 h bei 37 °C setzen. Dann, von jedem Brunnen, sammeln Sie das Medium, in dem die Zellen suspendiert werden und ernten Sie die abgetrennten Zellen durch Zentrifugation bei 264 x g für 3 min. Resuspend sie in 0,2 ml PBS. Um die Zellen zu zählen, fügen Sie 0,2 ml Zellsuspension zu 0,5 ml PBS und 0,3 ml 0,4% Trypan-Blaulösung hinzu. Nach 5 min bei Raumtemperatur die Zellen in der Bürkerkammer zählen.
- Um die Ergebnisse des Rohrbildungstestes zu quantifizieren, ist es möglich, die Anzahl der Verzweigungspunkte zu zählen, in denen sich mindestens drei Röhren verbinden. Zählen Sie mit der entsprechenden Bildsoftware für jedes Feld in jedem Mikrograph die Anzahl der Verzweigungspunkte, und berechnen Sie den Mittelwert des Standardfehlers (Standardfehler, SE) für jede Versuchsbedingung. Verwenden Sie einen zweischwänzigen t-Test, um die statistische Signifikanz zu bewerten.
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Representative Results
Um den Einfluss von RGWE auf die Angiogenese zu bewerten, führten wir einen Rohrbildungstest auf eine gegelte Kellermatrix durch. Wenn sie darauf kultiviert werden, bilden HUVECs röhrenartige Strukturen, die aus Zellen stammen, die länsam erscheinen und sich zu einem Zell-Zell-Netzwerk verbinden (Abbildung 2). In Abbildung 3zeigen wir, dass die Anzahl der mit RGWE behandelten Filialen in HUVECs im Vergleich zu den Kontrollbedingungen deutlich geringer war. Insbesondere bei Vorhandensein von 0,1 mg/ml und 1 mg/ml RGWE ist die Anzahl der Zweige um 40 % bzw. 60 % niedriger als bei der Kontrollbedingung. Da Rutin als Hauptbestandteil von RGWE5indiziert wurde, haben wir seine Wirkung auf den HUVEC-Rohrbildungstest analysiert. Wie in Abbildung 4dargestellt, kann Rutin allein die Fähigkeit der HUVECs, ein Zell-Zell-Netzwerk zu bilden, nicht beeinflussen. Dann verwendeten wir den Rohrbildungstest, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die der RGWE-induzierten Hemmung der Rohrbildung zugrunde liegen. Der intrazelluläre Signalweg MEK/ERK spielt eine zentrale Rolle bei angiogenen Prozessen. HUVECs, die von caMEK transfiziert wurden, wurden mit RGWE behandelt und auf gegelter Kellermatrix kultiviert. Wie in Abbildung 5dargestellt, hemmt RGWE in caMEK-transfizierten Endothelzellen nicht mehr die Rohrbildung, während Mock-transfikierte Zellen, die als Kontrolle verwendet werden, noch ein Zellzellnetzwerk auf der gegelten Kellermatrix bilden und auf RGWE reagieren, was auf RGWE dass die Wirkung des RGWE bei der Angiogenese durch den MEK-ERK-Weg vermittelt wird.
Abbildung 1: Ruta graveolens. Ein Ruta graveolens Strauch. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: HUVECs bilden röhrenartige Strukturen auf einer gegelten Kellermatrix. Repräsentative mikroskopische Fotografien von HUVECs, die in Polystyrolschale (links) und auf gegelter Kellermatrix (rechts) kultiviert sind. Skalenbalken = 10 m.
Abbildung 3: RGWE hemmt die Rohrbildung in HUVECs. (A) Hochleistungsmikroskopische Fotografien von HUVECs, die auf einer gegelten Kellermatrix kultiviert wurden, die mit RGWE (0, 0,01, 0,1 und 1,0 mg/ml) behandelt wurde. Der Anteil des HUVEC-Zweigpunkts (dunkelgrau) in Gegenwart von RGWE (0,01, 0,1 und 1,0 mg/ml) im Vergleich zu unbehandelten Zellen (0 mg/ml) und dem Trypan-Blau-Ausschlusstest (hellgrau) an behandelten HUVECs (0,01) 0,1 und 1 mg/ml) oder nicht (0 mg/ml) mit RGWE für 24 h. *p < 0,01 gegenüber dem Kontrollzustand (0 mg/ml). Die Ergebnisse werden als Mittelwert der SE von drei unabhängigen Experimenten ausgedrückt. Die statistische Signifikanz wurde durch einen zweischwänzigen t-Test ermittelt.
Abbildung 4: Rutin hat keinen Einfluss auf die Bildung von HUVEC-Rohren. (A) Hochleistungsmikroskopische Fotografien von HUVECs, die auf einer gegelten Kellermatrix gesät und behandelt werden (12, 120 und 300 g/ml) oder nicht (0 g/ml) mit Rutin für 24 h. Der Skalenbalken beträgt 10 m. (B) Der Prozentsatz des HUVEC-Zweigpunkts (dunkelgrau) in Gegenwart steigender Rutindosen (12, 120 und 300 x/ml) im Vergleich zu Denkbedingungen (0 g/ml) und dem Trypan-Blau-Ausschlusstest (hellgrau) an behandelten HUVECs (12 , 120 und 300 x/ml) oder nicht (0 g/ml) mit Rutin für 24 h. Die Ergebnisse werden als Mittelwert der SE von drei unabhängigen Experimenten ausgedrückt. Die statistische Signifikanz wurde durch einen zweischwänzigen t-Test ermittelt.
Abbildung 5: MEK-Signalweg vermittelt RGWE-Effekte auf die HUVEC-Rohrbildung. (A) Hochleistungsmikroskopische Fotografien von HUVECs, die mit leerem Vektor (Mocktransfektion) oder mit caMEK transfiziert, auf der gegelten Kellermatrix gesät und mit zunehmenden Dosen von RGWE (0, 0,01, 0,1 und 1 mg/ml) behandelt werden. Der Skalenbalken ist 10 m. (B) Der Prozentsatz der Anzahl der Verzweigungspunkte in HUVECs mock-transfited (dunkelgrau) und in HUVECs, die mit caMEK (hellgrau) transfiziert und mit steigenden Dosen von RGWE (0,01, 0,1 und 1 mg/ml) im Vergleich zur Kontrolle behandelt werden. Bedingungen (0 mg/ml). *p < 0,01 im Vergleich zur Regelbedingung; § p < 0,05 im Vergleich zu Zellen, die mit dem leeren Vektor transfiziert und mit der gleichen Menge RGWE behandelt werden. Die Ergebnisse werden als Mittelwert der SE von drei unabhängigen Experimenten ausgedrückt. Die statistische Signifikanz wurde durch einen zweischwänzigen t-Test ermittelt.
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Discussion
Natürliche Verbindungen zeichnen sich durch eine hohe chemische Vielfalt und biochemische Spezifität aus und stellen eine Quelle potenziell therapeutischer Moleküle dar. Hier zeigen wir, wie man Wasserextrakt aus der Pflanze R. graveolens erhält und schlagen den Rohrbildungstest als einfach durchzuführende, zuverlässige und quantitative Methode vor, die nützlich ist, um die Auswirkungen von RGWE auf die Angiogenese zu untersuchen. Es ist wichtig, die R. graveolens Blätter für 1 h zu kochen, um sicher zu sein, den kompletten Wasserextrakt zu erhalten. Das Kochen für weniger als 1 h erlaubte nicht die Extraktion aller Moleküle, und der Extrakt konnte nicht die erwartete biologische Wirkung ausüben.
Tube formation assay stellt einen In-vitro-Test dar, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die den verschiedenen Schritten zugrunde liegen, die zur Bildung neuer Blutgefäße führen. Dieser Test ermöglicht es forschern, Verbindungen zu identifizieren, die in der Lage sind, Angiogenese zu modulieren, sowie die beteiligten Proteine und Signalkaskaden. Darüber hinaus ermöglicht dieser Test den Forschern, Substanzen zu testen, die gleichzeitig die Endothelzellproliferation, Adhäsion, Migration und Proteaseaktivität beeinflussen können, alle wichtigen Mechanismen bei der Bildung von Blutgefäßen. Nur mit dieser Art von Test zeigen wir, dass RGWE, aber nicht seine Hauptkomponente Rutin, in der Lage ist, die Fähigkeit von HUVECs zu reduzieren, röhrenartige Strukturen zu bilden, ohne die Zelllebensfähigkeit zu beeinträchtigen, und dass dieser Effekt von der MEK-ERK-Signalwegaktivierung abhängt. Es ist jedoch wichtig, den Test mit der richtigen Anzahl von Zellen durchzuführen. Tatsächlich konnten zu wenige oder zu viele Zellen die richtige Bildung der Röhren nicht zulassen. Aus diesem Grund ist es ratsam, einen Vortest durchzuführen, um die richtige Anzahl von Zellen zu finden. Darüber hinaus ist die Anzahl der Zellgänge ebenso wichtig wie die Zellzahl, da Zellen, um den richtigen Rohrbildungstest zu erhalten, zweimal bis fünfmal durchzogen werden müssen. Nach Durchgang 6 treten Seneszenzmechanismen auf, die die rechte Rohrbildung beeinträchtigen können.
Der Rohrbildungstest ist ein sehr reproduzierbarer Assay, und er beleuchtet die Physiologie von Endothelzellen, auch wenn er nicht der Goldstandard für die dreidimensionale Untersuchung der Rohrbildung8,9,10ist. 11. Dreidimensionale Kollagen- und Fibrinmodelle haben sich als besser für Untersuchungen der vaskulären Tubulogenese, keimenden und endotheliaalen Zell-Perizyten-Wechselwirkung erwiesen. Jedoch, im Vergleich zu den Rohrbildung Assay auf gegelte Kellermatrix, diese Tests sind mehr zeit- und geldaufwendig11, was darauf hindeutet, dass der erste könnte ein guter Test sein, um vorläufige Ergebnisse zu erhalten, die die Grundlage für fokussiertere in vivo Studien sein kann. Schließlich kann der Rohrbildungstest in 24 h durchgeführt werden, da nicht transformierte HUVECs in der Lage sind, röhrenartige Strukturen innerhalb von 6 h12,13zu bilden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von Fondi di Ateneo an Luca Colucci-D'Amato und VALERE Programmfonds an Maria Teresa Gentile und AIRC Fonds IG18999 an Maurizio Bifulco finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HUVEC cells | Clontech | C2519A | |
| FBS | Invitrogen | 10270106 | |
| EBM-2 basal medium | Clontech | cc3156 | |
| Single quot kit- supplemets and growth factors | clontech | cc4147 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| 96-well plates | Thermo Scientific | 167008 | |
| 15 mL conical tubes | Sarstedt | 62,554,502 | |
| 10 mL disposable serological pipette | Sarstedt | 861,254,001 | |
| 5 mL disposable serological pipette | Sarstedt | 861,253,001 | |
| 1,000 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| 100 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| 20 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| p1000 pipette tips | Sarstedt | ||
| p20-200 pipette tips | Sarstedt | 70,760,502 | |
| Burker chamber | Fortuna | ||
| Trypan blu stain | Gibco | 15250-061 | |
| DPBS | Gibco | 14190-094 | |
| mill-ex 0.22 μm filters | Millipore | SLGS033SS | |
| Lyophilizer | VirTis-SP Scientific | ||
| Incubator | Thermo Scientific | ||
| CO2 | AirCos | ||
| Pen-Strep | Gibco | 15070-063 | |
| 100 mm dish | Sarstedt | 833,902 | |
| pcDNA3 | Invitrogen | v79020 | |
| Lipofectamine-2000 | Invitrogen | 11668027 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | Reduced serum medium |
| Rutin | Sigma-Aldrich | R5143-50G | |
| Axiovert 25 microscope | Zeiss | ||
| AmScope MD500 camera | AmScope | ||
| Dispase | Thermo Scientific | D4818 | |
| Lab heater | Falc | ||
| ParaFilm | American National Can |
References
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