Summary
ここでは、ゲル化基マトリックス上のチューブ形成アッセイを用いて、ルタ・グラボレンズの水抽出物が血管ネットワーク形成に及ぼす影響を評価する。
Abstract
血管新生は、内皮細胞増殖、分化、移動などの異なるプロセスを含む現象であり、新しい血管の形成につながり、いくつかのシグナル伝達経路を伴う。ここでは、管形成アッセイが血管新生に対する天然物の影響を評価し、関連する分子機構を調べるための単純なインビトロ法であることを示す。特に、ルタ・グラボレン(RGWE)の水抽出物の存在下では、内皮細胞は細胞ネットワークを形成することができなくなり、ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)管形成に対するRGWE効果が廃止される。MEKの構成的活性化。
Introduction
血管新生は、既存のものから新しい血管の形成につながり、胚形成および臓器の成長中に起こる生理学的プロセスである。成人期には、血管新生は、サイクリング卵巣、妊娠中の胎盤、および創傷治癒および修復中にのみ活性化される。血管新生は、内皮細胞が増殖し、分化し、無傷の血管ネットワーク1を形成するために移行する能力に依存する。しかし、炎症性、代謝性疾患、リウマチ性疾患などのいくつかの疾患では、血管新生プロセスが変化し、血管新生が過剰になる。さらに、制御されていない血管新生プロセスはまた、腫瘍の進行および転移1を刺激する。これらの理由から、過去10年間の研究研究は、癌、眼、関節、または皮膚疾患2、3における過剰な血管新生の阻害を目的とした新しい治療戦略の開発に焦点を当てている。
血管内皮増殖因子(VEGF)は、現在の抗血管新生療法4の主な標的を表し、およびいくつかの抗VEGFモノクローナル抗体が開発され、過剰な血管新生を防ぐために合成されている。しかし、これらの合成薬物は重篤な副作用を示し、不利な費用対利益比5、6を有する。したがって、現在使用されている薬剤を補完し、組み合わせるために最小限の副作用で過剰な血管新生を制限する新しい治療戦略を見つけることが不可欠です。これらの新薬は、高い化学的多様性と生化学的特異性を特徴とする天然物の中で見つけることができます。
本論文では,RGWEがインビトロ5のゲル化基マトリックス上で管状を形成する能力に対するRGWEの影響を評価する簡単な方法を提案する.実際、RGWEは、ルチンが主要成分5であるフラボノイドおよびポリフェノールなどの二次代謝産物の混合物である。それらの多くは、すでに抗炎症および血管保護剤7、8、9、10、11としてテストされています。さらに、最近では、ルチンではなくRGWEがゲル化基基マトリックス上で管状を形成するHUVEC能力を阻害し、この現象がMEK-ERK経路によって媒介され、RGWEが潜在的な治療ツールとしてできることを示している。過度の新しい血管形成を防ぐ 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. RGWE準備
- 植物学者の監督の下、春/夏の間に植物からR.グラボレンズの葉を収集します。
注:この場合、葉はナポリの植物園の薬用植物の実験セクションで収集されました, イタリア5.植物は自発的で多年生であり、地中海地域に存在する(図1)。 - 250gの葉の重量を量り、細かくはさみでそれらを刻みます。
- 葉を円錐形のフラスコに入れ、250gの刻んだ葉に蒸留水を1L加え、110°Cで60分間沸騰させます。
- 3mmの漏斗フィルターペーパーを使用して、水抽出物を表す液体相からゆで葉を分離します。
- 0.22 μm フィルターを通して液体相をフィルター処理し、ビーカーで回収します。ビーカーをパラフィルムで覆い、一晩-80°Cで抽出物を凍らせます。
- パラフィルムに針で10~15個の穴を作り、凍結乾燥剤で抽出物を凍結乾燥します。粉末を得るのに数日かかることに注意してください。
- 得られた粉末を計量し、アリコットに分け、必要になるまで4°Cに保存します。1年間保存することが可能です。
- 実験に必要な場合は、ストック溶液を調作し、蒸留水で粉末を50mg/mLの標準濃度に希釈する。少量(例えば、1 mL)のアリコートに分ける。この調製物は、使用されるまで-20°Cで保存することができますが、分子の酸化のため、数日間以上4°Cで保存することはできません。凍結や解凍は避けてください。
2. 細胞培養
- 内皮細胞増殖培地中にHUVECを培養:1μg/mLヒドロコルチゾンおよび1ng/mL表皮成長因子、10%FBS、およびペニシリン/ストレプトマイシンを5%CO2の雰囲気下で37°Cで補合した内皮基底培地。
- 80%がコンフルエントである場合、細胞を1:3の割合で分割します。成長因子に応じて明らかな違いを示さない2~5つの通路の細胞を使用します。第6の通過後、細胞は老化し、ゲル化された基基マトリックス上にチューブを形成しない。
3. トランスフェクション
- HUVECが70%のコンフルエントである場合は、所望の遺伝子でそれらをトランスフェクトします。
- 100 mm プレートの場合は、1 μg の空の pCDNA3 ベクターを対照として使用し、目的の遺伝子を含む pCDNA3 ベクターの 1 μg を使用します(この場合は、構成的に活性 MEK [caMEK])。
- リポフェクタミン2,000の3 μLを持つDNAの複合体1 μgは、還元血清培地(材料の表を参照)で希釈し、細胞から培地を取り出し、新鮮な完全培地の1 mLに置き換えます。次に、トランスフェクションソリューションをセルに追加します。インキュベーター内の細胞を37°Cでインキュベートし、5%CO2でインキュベートする。また、製造業者の指示に従って、リポフェクタミン2,000とは異なる他のトランスフェクション剤を使用することも可能である。
- トランスフェクション後に完全な新鮮な培地の7 mLを3時間追加し、次のアッセイを進める前に、さらに37°Cで24〜48時間細胞をインキュベートする。トランスフェクションの翌日、培地を新鮮な完全培地に置き換える。
4. チューブ形成アッセイ
- ゲル化した地下室を準備する前に、96ウェルプレートとピペットチップを4°Cで1時間冷却します。
- 地下準備の瞬間に、プレートを氷(0°C)に置き、気泡の形成を避けながら、各井戸に50 μLのコールドマトリックスを加えます。マトリックスは室温で固体になるので、マトリックス含有バイアルは手順中に氷の上に保持する必要があります。
- 37°Cのインキュベーターにプレートを入れ、5%CO2を少なくとも30分間入れ、地下室を重合させます。
- その間に、細胞を収穫します。0.25%トリプシン/0.53 mM EDTA溶液の1 mLでHUVECを洗浄します。次に、トリプシン-EDTA溶液の2mLを加え、37°Cで5分間インキュベートし、反転顕微鏡下の細胞を観察し、細胞層が完全に分散していることを確認します。次いで、細胞を懸濁させた培地を集め、264 x gで遠心分離により3分間、リン酸緩衝生理食生(PBS)の1mLでそれらを再懸濁させる。
- 細胞を数えるには、0.2 mLのセル懸濁液をPBSの0.5 mLおよび0.4%トリパンブルー溶液の0.3 mLに加える。室温で5分後、Bürker室の細胞を数える。
- 2 x 104細胞/50 μLの濃度で完全培地中の細胞を再中断し、ウェル当たり2 x 104細胞の濃度でゲル化基下にシードし、それらに落ち着かせてください。
- セルの数に注意してください。ゲル化した地下室で正しい方法でチューブを形成しない細胞が多すぎたり少なすぎたりする場合があります。
- RGWE(0.01、0.1、および1mg/mL)の増加用量を準備し、培養培地またはルチン(12、120、および300 μg/mL)でストック溶液を希釈し、すべて50 μL/ウェルの最終容積で、50 μL/ウェルに加えます。各ウェルの最終容積は100 μLになります。各実験条件に対して4~6ウェルを準備します。対照として、培養培地中の希釈蒸留水(車両)を1:50の割合で希釈する。
- 6~24時間の間、インキュベーター内の細胞を37°Cおよび5%CO2でインキュベートします。
- 播種後6~24時間の時間範囲内で細胞を観察し、10倍の倍率で位相コントラスト顕微鏡を用いた。HUVECは6時間以内にチューブ状の構造を形成することができますが、12-18 hの後に良い結果を観察することが可能です 各井戸のチューブ状の構造を撮影し、各井戸の3〜5つのランダムなフィールドの平均を画像化します。
- 画像集録後、細胞を基基マトリックスから切り離し、カウントして細胞数に対する治療の効果を評価することができる。各ウェルについて、培地を取り出し、24U/mLの濃度でジスパーゼを加え、プレートを37°Cに1時間置く。次いで、各ウェルから、細胞を懸濁させた培地を集め、離離した細胞を264×gで3分間遠心分離して収穫し、PBSの0.2mLで再懸濁する。細胞を数えるには、0.2 mLの細胞懸濁液をPBSの0.5 mL、0.4%トリパンブルー溶液の0.3mLを加えます。室温で5分後、Bürker室の細胞を数える。
- チューブ形成アッセイの結果を定量化するために、少なくとも3本のチューブが結合する分岐点の数をカウントすることができる。適切な画像ソフトウェアを使用して、各顕微鏡写真の各フィールドの分岐点数をカウントし、各実験条件の平均±標準誤差(SE)を計算する。統計的有意性を評価するには、両尾t-test を使用します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
血管新生に対するRGWEの影響を評価するために、ゲル化基基マトリックス上のチューブ形成アッセイを行った。その上で培養すると、HUVECは細長く見える細胞に由来し、互いに接続して細胞ネットワークを形成するチューブ状の構造を形成する(図2)。図3では、RGWEで処理したHUVECの分岐数が、制御条件と比較して有意に少なくなっていることを示す。特に、0.1mg/mLおよび1mg/mL RGWEの存在下では、分岐の数は、対照条件と比較して、それぞれ40%および60%低い。ルチンはRGWE5の主要成分として示されているので、HUVECチューブ形成アッセイへの影響を解析した。図4に示すように、ルチンだけでは、細胞ネットワークを形成するHUVECの能力に影響を与えることができない。次に、チューブ形成アッセイを用いて、RGWE誘発性チューブ形成阻害の根底にある分子機構を調べた。MEK/ERK細胞内シグナル伝達経路は血管新生プロセスにおいて重要な役割を果たす。caMEKによってトランスフェクトされたHUVECをRGWEで処理し、ゲル化した地下マトリックスで培養した。図5に示すように、caMEKトランスフェクト内皮細胞では、RGWEはもはやチューブ形成を阻害せず、一方、コントロールとして使用される模擬トランスフェクト細胞は、依然としてゲル化基基マトリックス上で細胞ネットワークを形成し、RGWEに応答し、このように示す血管新生におけるRGWEの効果はMEK-ERK経路によって媒介される。
図1:ルタ・グラボレンズ.ルタ・グラボレンズの低木この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:HUVECはゲル化した地下マトリックス上にチューブ状の構造を形成する。ポリスチレン皿(左)とゲル化地下マトリックス(右)で培養したHUVECの代表的な顕微鏡写真。スケールバー = 10 μm.
図3:RGWEはHUVECにおけるチューブ形成を阻害する。(A) RGWE(0,0.01,0.1,1.0.1,1.0mg/mL)で処理したゲル化地下マトリックス上で培養したHUVECの高出力顕微鏡写真。スケールバーは10μm(B)未処理細胞(0mg/mL)とトレーパンブルー排除試験(0.01)と比較してRGWE(0.01、0.1、および1.0mg/mL)の存在下でHUVEC分岐点(濃い灰色)のパーセンテージ(0.01)を処理したHUVECのトレーパンブルー除外試験(0.01)。,0.1,1mg/mL)またはRGWEを24h. *p < 0.01対対制御条件(0mg/mL)で(0mg/mL)しないか。結果は、3つの独立した実験の平均±SEとして表される。統計的有意性は、両尾t検定によって得られた。
図4:ルチンはHUVEC管形成に影響を与えない。(A) ゲル化した地下マトリックスに播種し、24時間ルチンで(0 μg/mL)または処理しない(0 μg/mL)。スケールバーは10μm(B)ルチン(12、120、300 μ/mL)の増加量の存在下でHUVEC分岐点(ダークグレー)の割合(0 μg/mL)とHUVEC処理されたトレーパンブルー除外試験(ライトグレー)(12)、120、および 300 μ/mL)または 24 時間のルチン付き (0 μg/mL) なし。結果は、3つの独立した実験の平均±SEとして表される。統計的有意性は、両尾t検定によって得られた。
図5:MEK経路は、HUVECチューブ形成に対するRGWE効果を媒次的に調べている。(A) 空のベクター(模擬トランスフェクション)またはcaMEKでトランスフェクトされたHUVECの高出力顕微鏡写真を、ゲル化した地下マトリックスに播種し、RGWE(0、0.01、0.1、および1mg/mL)の用量増加で処理した。スケールバーは10μm(B)HUVECモックトランスフェクト(ダークグレー)とHUVECの分岐点数のパーセンテージで、caMEK(ライトグレー)をトランスフェクトし、RGWE(0.01、0.1、および1mg/mL)の用量を増加して処理しました。条件 (0 mg/mL)*p < 0.01対制御条件;§p < 0.05対細胞を空のベクターでトランスフェクトし、同じ量の RGWE で処理した。結果は、3つの独立した実験の平均±SEとして表される。統計的有意性は、両尾t検定によって得られた。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
天然化合物は、高い化学的多様性と生化学的特異性によって特徴付けられており、潜在的に治療的分子の供給源を表します。ここでは、植物R.graveolensから水抽出物を得る方法を示し、血管新生に対するRGWEの効果を調べるために有用な、実行しやすい、信頼性が高く、定量的な方法としてチューブ形成アッセイを提案する。完全な水抽出物を得るためには、R.グラボレンズの葉を1時間沸騰させておく必要があります。1時間未満の沸騰は、すべての分子の抽出を可能にしなかった、と抽出物は、期待される生物学的効果を発揮することができませんでした。
チューブ形成アッセイは、新しい血管の形成につながるいくつかのステップの基礎となる分子機構を研究するためのインビトロテストを表す。このアッセイにより、研究者は血管新生を調節できる化合物、ならびに関与するタンパク質およびシグナル伝達カスケードを同定することができます。さらに、このアッセイにより、研究者は、血管形成におけるすべての重要なメカニズムを、同時に内皮細胞増殖、接着、移行、プロテアーゼ活性に影響を与える可能性のある物質を検査することができます。この種の試験のみを用いて、RGWEは、その主要成分ルチンではなく、細胞の生存率に影響を与えることなくチューブ状の構造を形成するHUVECの能力を低下させることができ、この効果がMEK-ERK経路活性化に依存することを示す。ただし、適切な数のセルでテストを実行することが重要です。実際には、あまりにも少ないまたはあまりにも多くの細胞は、チューブの右の形成を許可することができませんでした。このため、正しい数のセルを見つけるために予備テストを実行することをお勧めします。また、細胞回数は細胞数と同じくらい重要であるため、正しい管形成アッセイを得るためには、細胞を2~5回通過させなければならない。通過6の後、右管形成を損なう可能性のある老化機構が生じる。
チューブ形成アッセイは非常に再現可能なアッセイであり、チューブ形成8、9、10の三次元研究のゴールドスタンダードでなくても、内皮細胞の生理学に光を当てる。 11.3次元コラーゲンおよびフィブリンモデルは、血管管状形成、発芽、および内皮細胞膜相互作用の調査に適することが実証されている。しかし、ゲル化基底マトリックス上のチューブ形成アッセイと比較して、これらの試験はより時間と費用を消費する11であり、最初の試験は、生体内研究でより焦点を当てるための基礎となり得る予備的な結果を得るための良いテストであり得ることを示唆している。最後に、チューブ形成アッセイは、非形質化されたHUVECが6h 12、13内にチューブ状の構造を形成することができるので、24時間で行うことができる。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
この作品は、フォンディ・ディ・アテネオからルカ・コルッチ・ダマト、ヴァレ・プログラムの資金をマリア・テレサ・ジェンタイルとAIRCファンドIG18999からマウリツィオ・ビフルコに資金提供しました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HUVEC cells | Clontech | C2519A | |
| FBS | Invitrogen | 10270106 | |
| EBM-2 basal medium | Clontech | cc3156 | |
| Single quot kit- supplemets and growth factors | clontech | cc4147 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| 96-well plates | Thermo Scientific | 167008 | |
| 15 mL conical tubes | Sarstedt | 62,554,502 | |
| 10 mL disposable serological pipette | Sarstedt | 861,254,001 | |
| 5 mL disposable serological pipette | Sarstedt | 861,253,001 | |
| 1,000 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| 100 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| 20 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| p1000 pipette tips | Sarstedt | ||
| p20-200 pipette tips | Sarstedt | 70,760,502 | |
| Burker chamber | Fortuna | ||
| Trypan blu stain | Gibco | 15250-061 | |
| DPBS | Gibco | 14190-094 | |
| mill-ex 0.22 μm filters | Millipore | SLGS033SS | |
| Lyophilizer | VirTis-SP Scientific | ||
| Incubator | Thermo Scientific | ||
| CO2 | AirCos | ||
| Pen-Strep | Gibco | 15070-063 | |
| 100 mm dish | Sarstedt | 833,902 | |
| pcDNA3 | Invitrogen | v79020 | |
| Lipofectamine-2000 | Invitrogen | 11668027 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | Reduced serum medium |
| Rutin | Sigma-Aldrich | R5143-50G | |
| Axiovert 25 microscope | Zeiss | ||
| AmScope MD500 camera | AmScope | ||
| Dispase | Thermo Scientific | D4818 | |
| Lab heater | Falc | ||
| ParaFilm | American National Can |
References
- Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473 (7347), 298-307 (2011).
- Ferrara, N., Kerbel, R. S. Angiogenesis as a therapeutic target. Nature. 438 (7070), 967-974 (2005).
- Ravishankar, D., Rajora, A. K., Greco, F., Osborn, H. M. I. Flavonoids as prospective compounds for anti-cancer therapy. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45, 2821-2831 (2013).
- Gentile, M. T., et al. Ruta graveolens water extract inhibits cell-cell network formation in human umbilical endothelial cells via MEK-ERK1/2 pathway. Experimental Cell Research. 364 (1), 50-58 (2018).
- Butler, M. S. Natural products to drugs: natural product-derived compounds in clinical trials. Natural Product Reports. 25, 475-516 (2008).
- Sulaiman, R. S., Basavarajappa, H. D., Corson, T. W. Natural product inhibitors of ocular angiogenesis. Experimental Eye Research. 129, 161-171 (2014).
- Risau, W.
- Trung, N. X. In vitro models for angiogenesis. Journal of Science & Development. 13 (4), 850-858 (2015).
- Ucuzian, A. A., Greisler, H. P.
- Simons, M., et al. American Heart Association Council on Basic Cardiovascular Sciences and Council on Cardiovascular Surgery and Anaesthesia. State-of-the-Art Methods for Evaluation of Angiogenesis and Tissue Vascularisation: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circulation Research. 116 (11), e99-e132 (2015).
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nature Protocols. 5 (4), 628-635 (2010).
- DeCicco-Skinner, K. L., et al. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. Journal of Visualized Experiments. (91), e51312 (2014).
